多肽合成基礎(chǔ)知識(shí)大全

1、多肽合成基礎(chǔ)知識(shí)匯編編制：合成部一、多肽合成概論1 .多肽化學(xué)合成概述：1963 年，1創(chuàng)立了將氨基酸的 C 末端固定在不溶性樹(shù)脂上，然后在此樹(shù)脂上依次縮合氨基酸，延長(zhǎng)肽鏈、合成蛋白質(zhì)的固相合成法，在固相法中，每步反應(yīng)后只需簡(jiǎn)單地洗滌樹(shù)脂，便可達(dá)到純化目的.克服了經(jīng)典液相合成法中的每一步產(chǎn)物都需純化的困難，為自動(dòng)化合成肽奠定了基礎(chǔ).為此，Merrifield 獲得 1984 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)今天，固相法得到了很大發(fā)展.除了 Merrifield 所建立的 Boc 法（Boc:叔丁氧談基）之外，又發(fā)展了 Fmoc 固相法（Fmoc:9-藥甲氧談基）.以這兩種方法為基礎(chǔ)的各種肽自動(dòng)合成儀也相繼出現(xiàn)和

2、發(fā)展，并仍在不斷得到改造和完善Merrifield 所建立的 Boc 合成法2是采用 TFA（三氟乙酸）可脫除的 Boc 為“-氨基保護(hù)基，側(cè)鏈保護(hù)采用葦醇類.合成時(shí)將一個(gè) Boc氨基酸衍生物共價(jià)交聯(lián)到樹(shù)脂上，用 TFA 脫除 Boc,用三乙胺中和游離的氨基末端，然后通過(guò) Dcc 活化、耦聯(lián)下一個(gè)氨基酸，最終脫保護(hù)多采用 HF 法或 TFMSAU 氟甲磺酸）法.用 Boc 法已成功地合成了許多生物大分子，如活性酶、生長(zhǎng)因子、人工蛋白等多肽是涉及生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)。它是分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物，由多種氨基酸按照一定的排列順序通過(guò)肽鍵結(jié)合而成。到現(xiàn)在，人們已發(fā)現(xiàn)和

3、分離出一百多種存在于人體的肽，對(duì)于多肽的研究和利用，出現(xiàn)了一個(gè)空前的繁榮景象。多肽的全合成不僅具有很重要的理論意義，而且具有重要的應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)多肽全合成可以驗(yàn)證一個(gè)新的多肽的結(jié)構(gòu)；設(shè)計(jì)新的多肽，用于研究結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；為多肽生物合成反應(yīng)機(jī)制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽藥物等。多肽的化學(xué)合成技術(shù)無(wú)論是液相法還是固相法都已成熟。近幾十年來(lái)，固相法合成多肽更以其省時(shí)、省力、省料、便于計(jì)算機(jī)控制、 便于普及推廣的突出優(yōu)勢(shì)而成為肽合成的常規(guī)方法并擴(kuò)展到核昔酸合成等其它有機(jī)物領(lǐng)域。 本文概述了固相合成的基本原理、實(shí)驗(yàn)過(guò)程，對(duì)其現(xiàn)狀進(jìn)行分析并展望了今后的發(fā)展趨勢(shì)。從 1963 年 Merri

4、field 發(fā)展成功了固相多肽合成方法以來(lái)，經(jīng)過(guò)不斷的改進(jìn)和完善，到今天固相法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個(gè)常用技術(shù)，表現(xiàn)出了經(jīng)典液相合成法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。其基本原理是：先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價(jià)鍵的結(jié)構(gòu)同一個(gè)不溶性的高分子樹(shù)脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng)過(guò)脫去氨基保護(hù)基并同過(guò)量的活化竣基組分反應(yīng)，接長(zhǎng)肽鏈。重復(fù)（縮合-洗滌-去保護(hù)-中和及洗滌-下一輪縮合）操作，達(dá)到所要合成的肽鏈長(zhǎng)度，最后將肽鏈從樹(shù)脂上裂解下來(lái)，經(jīng)過(guò)純化等處理，即得所要的多肽。其中 a-氨基用 BOC（叔丁氧談基）保護(hù)的稱為 BOC 固相合成法，&-氨基用 FMOC9-藥甲氧城

5、基）保護(hù)的稱為 FMOCI 相合成法，2 .固相合成的基本原理多肽合成是一個(gè)重復(fù)添加氨基酸的過(guò)程，固相合成順序一般從 C 端（竣基端）向 N 端（氨基端）合成。過(guò)去的多肽合成是在溶液中進(jìn)行的稱為液相合成法?，F(xiàn)在多采用固相合成法，從而大大的減輕了每步產(chǎn)品提純的難度。為了防止副反應(yīng)的發(fā)生，參加反應(yīng)的氨基酸的側(cè)鏈都是保護(hù)的?？⒒耸怯坞x的，并且在反應(yīng)之前必須活化?；瘜W(xué)合成方法有兩種，即 Fmoc 和 tBoc。由于 Fmoc 比 tBoc 存在很多優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)在大多采用 Fmoc 法合成，如圖：具體合成由下列幾個(gè)循環(huán)組成：一、去保護(hù)：Fmoc 保護(hù)的柱子和單體必須用一種堿性溶劑（piperidine）去

6、除氨基的保護(hù)基團(tuán)。二、激活和交聯(lián)：下一個(gè)氨基酸的竣基被一種活化劑所活化?；罨膯误w與游離的氨基反應(yīng)交聯(lián)，形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅(qū)使反應(yīng)完成。循環(huán)：這兩步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)直到合成完成。三、洗脫和脫保護(hù)：多肽從柱上洗脫下來(lái)，其保護(hù)基團(tuán)被一種脫保護(hù)劑（TFA）洗脫和脫保護(hù)。2.1 樹(shù)脂的選擇及氨基酸的固定將固相合成與其他技術(shù)分開(kāi)來(lái)的最主要的特征是固相載體，能用于多肽合成的固相載體必須滿足如下要求：必須包含反應(yīng)位點(diǎn)（或反應(yīng)基團(tuán)），以使肽鏈連在這些位點(diǎn)上，并在以后除去；必須對(duì)合成過(guò)程中的物理和化學(xué)條件穩(wěn)定；載體必須允許在不斷增長(zhǎng)的肽鏈和試劑之間快速的、不受阻礙的接觸；另外，載體必須允許提供足

7、夠的連接點(diǎn)，以使每單位體積的載體給出有用產(chǎn)量的肽，并且必須盡量減少被載體束縛的肽鏈之間的相互作用。用于固相法合成多肽的高分子載體主要有三類：聚苯乙烯-苯二乙烯交聯(lián)樹(shù)脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇類樹(shù)脂及衍生物，這些樹(shù)脂只有導(dǎo)入反應(yīng)基團(tuán)，才能直接連上（第一個(gè)）氨基酸。根據(jù)所導(dǎo)入反應(yīng)基團(tuán)的不同，又把這些樹(shù)脂及樹(shù)脂衍生物分為氯甲基樹(shù)脂、竣基樹(shù)脂、氨基樹(shù)脂或酰脫型樹(shù)脂。BOg 成法通常選擇氯甲基樹(shù)脂，如 Merrifield 樹(shù)脂；FMO 若成法通常選擇竣基樹(shù)脂如王氏樹(shù)脂。氨基酸的固定主要是通過(guò)保護(hù)氨基酸的竣基同樹(shù)脂的反應(yīng)基團(tuán)之間形成的共價(jià)鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)的，形成共價(jià)鍵的方法有多種：氯甲基樹(shù)脂，通常先制得保護(hù)

8、氨基酸的四甲鏤鹽或鈉鹽、鉀鹽、葩鹽，然后在適當(dāng)溫度下，直接同樹(shù)脂反應(yīng)或在合適的有機(jī)溶劑如二氧六環(huán)、DM 械 DMS 加反應(yīng)；竣基樹(shù)脂，則通常加入適當(dāng)?shù)目s合劑如 DCCM 竣基二咪座，使被保護(hù)氨基酸與樹(shù)脂形成共酯以完成氨基酸的固定；氨基樹(shù)脂或酰脫型樹(shù)脂，卻是加入適當(dāng)?shù)目s合劑如 DCCW,通過(guò)保護(hù)氨基酸與樹(shù)脂之間形成的酰胺鍵來(lái)完成氨基酸的固定。氨基、竣基、側(cè)鏈的保護(hù)及脫除要成功合成具有特定的氨基酸順序的多肽，需要對(duì)暫不參與形成酰胺鍵的氨基和竣基加以保護(hù)，同時(shí)對(duì)氨基酸側(cè)鏈上的活性基因也要保護(hù)，反應(yīng)完成后再將保護(hù)基因除去。同液相合成一樣，固相合成中多采用烷氧談基類型作為 a 氨基的保護(hù)基，因?yàn)檫@樣不易

9、發(fā)生消旋。最早是用葦氧玻基，由于它需要較強(qiáng)的酸解條件才能脫除，所以后來(lái)改為叔丁氧談基（BOC 保護(hù)，用 TFA（三氟乙酸）脫保護(hù)，但不適用含有色氨酸等對(duì)酸不穩(wěn)定的肽類的合成。1978年，changMeienlofer 和 Atherton 等人采用 Carpino 報(bào)道的 Fmoc（9-藥甲氧城基）作為 a 氨基保護(hù)基，F(xiàn)moc 基對(duì)酸很穩(wěn)定，但能用哌咤-CH2CL2 或哌咤-DMF 脫去，近年來(lái)，F(xiàn)moc 合成法得到了廣泛的應(yīng)用?？⒒ǔＳ眯纬甚セ姆椒ㄟM(jìn)行保護(hù)。甲酯和乙酯是逐步合成中保護(hù)竣基的常用方法，可通過(guò)皂化除去或轉(zhuǎn)變?yōu)榉我员阌糜谄瑪嘟M合；叔丁酯在酸性條件下除去；葦酯常用催化氫化除去。

10、對(duì)于合成含有半胱氨酸、組氨酸、精氨酸等帶側(cè)鏈功能基的氨基酸的肽來(lái)說(shuō)，為了避免由于側(cè)鏈功能團(tuán)所帶來(lái)的副反應(yīng)，一般也需要用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基將側(cè)鏈基團(tuán)暫時(shí)保護(hù)起來(lái)。保護(hù)基的選擇既要保證側(cè)鏈基團(tuán)不參與形成酰胺的反應(yīng)，又要保證在肽合成過(guò)程中不受破壞，同時(shí)又要保證在最后肽鏈裂解時(shí)能被除去。如用三苯甲基保護(hù)半胱氨酸的 S-,用酸或銀鹽、汞鹽除去；組氨酸的咪座環(huán)用 2,2,2-三氟-1-葦氧談基和 2,2,2-三氟-1-叔丁氧?；一Ｗo(hù)，可通過(guò)催化氫化或冷的三氟乙酸脫去。精氨酸用金剛烷氧談基（Adoc）保護(hù)，用冷的三氟乙酸脫去。固相中的接肽反應(yīng)原理與液相中的基本一致，將兩個(gè)相應(yīng)的氨基被保護(hù)的及竣基被保護(hù)的氨基酸

11、放在溶液內(nèi)并不形成肽鍵，要形成酰胺鍵，經(jīng)常用的手段是將竣基活化，變成混合酸酊、活潑酯、酰氯或用強(qiáng)的失去劑（如碳二亞氨）形成對(duì)稱酸酊等方法來(lái)形成酰胺鍵。其中選用 DCCHOB 械 HOBT/DCC 勺對(duì)稱酸酊法、活化酯法接肽應(yīng)用最廣。裂解及合成肽鏈的純化 BOC 法用 TFA+HFS 解和脫側(cè)鏈保護(hù)基，F(xiàn)MOCI 直接用 TFA,有時(shí)根據(jù)條件不同，其它堿、光解、氟離子和氫解等脫保護(hù)方法也被采用。合成肽鏈進(jìn)一步的精制、分離與純化通常采用高效液相色譜、親和層析、毛細(xì)管電泳等。1. .固相合成的特點(diǎn)及存在的主要問(wèn)題固相合成法對(duì)于肽合成的顯著的優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)化并加速了多步驟的合成；因反應(yīng)在一簡(jiǎn)單反應(yīng)器皿中便可

12、進(jìn)行，可避免因手工操作和物料重復(fù)轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的損失；固相載體共價(jià)相聯(lián)的肽鏈處于適宜的物理狀態(tài)，可通過(guò)快速的抽濾、洗滌未完成中間的純化，避免了液相肽合成中冗長(zhǎng)的重結(jié)晶或分柱步驟，可避免中間體分離純化時(shí)大量的損失；使用過(guò)量反應(yīng)物，迫使個(gè)別反應(yīng)完全，以便最終產(chǎn)物得到高產(chǎn)率；增加溶劑化，減少中間的產(chǎn)物聚焦；固相載體上肽鏈和輕度交聯(lián)的聚合鏈緊密相混，彼此產(chǎn)生一種相互的溶劑效應(yīng)，這對(duì)肽自聚集熱力學(xué)不利而對(duì)反應(yīng)適宜。固相合成的主要存在問(wèn)題是固相載體上中間體雜肽無(wú)法分離，這樣造成最終產(chǎn)物的純度不如液相合成物，必需通過(guò)可靠的分離手段純化。2. .固相合成的研究發(fā)展前景固相多肽合成已經(jīng)有 40 年的歷史了，然而到現(xiàn)

13、在，人們還只能合成一些較短的肽鏈，更談不上隨心所欲地合成蛋白質(zhì)了，同時(shí)合成中的試劑毒性，昂貴費(fèi)用，副產(chǎn)物等一直都是令人頭痛的問(wèn)題，而在生物體內(nèi)，核糖體上合成肽鏈的速度和產(chǎn)率都是驚人的，那么，是否能從生物體合成蛋白質(zhì)的原理上得到一些啟發(fā)，應(yīng)用在固相多肽合成(樹(shù)脂)上，這是一個(gè)令人感興趣的問(wèn)題，也許是今后多肽合成的發(fā)展。在 Boc 合成法中，反復(fù)地用酸來(lái)脫保護(hù)，這種處理帶來(lái)了一些問(wèn)題：如在肽與樹(shù)脂的接頭處，當(dāng)每次用 50%TFA脫 Boc 基時(shí)，有約 1.4%的肽從樹(shù)脂上脫落，合成的肽越大，這樣的丟失越嚴(yán)重；止匕外，酸催化會(huì)引起側(cè)鏈的一些副反應(yīng).Boc 合成法尤其不適于合成含有色氨酸等對(duì)酸不穩(wěn)定的

14、肽類.1978 年，ChangMeienlofer 和 Atherton 等人采用 Carpino3報(bào)道的 Fmoc(9-藥甲氧城基)基團(tuán)作為 a-氨基保護(hù)基，成功地進(jìn)行了多肽的 Fmoc 固相合成.Fmoc法與 Boc 法的根本區(qū)別在于采用了堿可脫除的 Fmoc 為 a-氨基的保護(hù)基.側(cè)鏈的保護(hù)采用 TFA 可脫除的叔丁氧基等，樹(shù)脂采用 90%TFA切除的對(duì)烷氧葦醇型樹(shù)脂和 1%丁尸切除的二烷氧葦醇型樹(shù)脂，最終的脫保護(hù)避免了強(qiáng)酸處理.3. .HPLC 分析和純化分析 HPLC 使用柱子和泵系統(tǒng)，可以經(jīng)受傳遞高壓，這樣可以用極細(xì)的微粒(3-10gm)做填料。由此多肽要在幾分鐘內(nèi)高度被分析。HP

15、LC 分兩類：離子交換和反相。離子交換 HPLCK 靠多肽和固相間的直接電荷相互作用。柱子在一定 PH 范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸組成表現(xiàn)出相反電荷。分離是一種電荷相互作用，通過(guò)可變 PH,離子強(qiáng)度，或兩者洗脫出多肽，通常，先用低離子強(qiáng)度的溶液，以后逐漸加強(qiáng)或一步一步加強(qiáng)，直到多肽火柱中洗脫出。離子交換分離的一個(gè)例子使用強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱。如 sulfoethylaspartimide 通過(guò)酸性 PH 中帶正電來(lái)分離。反相 HPLC 條件與正常層析正相反。多肽通過(guò)疏水作用連到柱上，用降低離子強(qiáng)度洗脫，如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價(jià)吸附到硅上的碳?xì)渫殒湗?gòu)成

16、，這種鏈長(zhǎng)度為 G4-G8 碳原子。由于洗脫是一種疏水作用。大的疏水肽用短鏈柱洗脫好。然而，總體實(shí)踐中，這兩類柱互變無(wú)多少顯著差別，別類載體由碳水化合物構(gòu)成，比如苯基。典型的操作常由兩綬沖劑組成，0.1%TFA-H2o 和 80%acetonitrile0.1%TFA-H2o 稀 acetonitrile。用線型梯變以每分鐘 0.5%到1.0%改變的速度混合。 常見(jiàn)分析和純化用柱為 4.6X250mm(310“m和 22X250mm(10m).如果用徑向填柱， 那么大小是 8X100(3-10Rm)和 25X250mm(101m)大量各種緩沖劑含許多不同試劑，比如 heptafluorobut

17、yric 酸，0.1%5酸，稀 Heformic 酸(5-6%,pH2-4),10-100mMNH4HCO3,醋酸鈉/氨，TFA/TEA,磷酸鈉或鉀，異戊酚。這樣許多不同組合可形成緩沖劑，但要注意一點(diǎn)：硅反相柱料不能長(zhǎng)時(shí)間暴露于高 pH,甚至微堿 pH,因?yàn)檫@樣會(huì)破壞柱子。4. .Fmob 氨基酸的制備和側(cè)鏈保護(hù)Fmoc 基團(tuán)是在有 NaHCO3cNa2CO 酹在的二氧六環(huán)溶液中，通過(guò)以下反應(yīng)引入到氨基酸中的：理想的 Fmoc-氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基應(yīng)在堿性條件下穩(wěn)定，在酸性條件下脫除.下面對(duì)其做一介紹.4Asp 和 GluAsp 和 Glu 側(cè)鏈竣基常用 t-Bu 保護(hù).可用 TFA、TMSBr

18、 等脫除.但是用 t-Bu 保護(hù)仍有側(cè)鏈環(huán)化形成酰亞胺的副反應(yīng)發(fā)生.近年來(lái)，發(fā)展了一些新的保護(hù)基如環(huán)烷醇酯、金剛烷醇酯等可減輕這一副反應(yīng)，這些保護(hù)基可用 TMSOTfU氟甲磺酸三甲硅烷酯）除去.4Ser、Thr 和 Tyrser、Thr 的羥基及 Tyr 的酚羥基通常用 t-Bu 保護(hù).叔丁基的引入比較麻煩，首先 ser 制成茱氧?；?，再在酸催化下與異丁烯反應(yīng).Ser 和 Thr 還可用葦基保護(hù)，Ser 用葦醇引入葦基、Thr 用溟葦引入葦基.4Asn 和 GlnAsn 和 Gln 側(cè)鏈的酰胺鍵在肽合成中一般不加以保護(hù).但合成大肽時(shí)，Asn 和 Gln 的.竣基活化時(shí)可能會(huì)發(fā)生分子內(nèi)脫氫反應(yīng)

19、生成氟基化合物.堿性時(shí) Gln 的側(cè)鏈可以環(huán)化生成酰胺.而且不保護(hù)的 Fmoc-Gln 和 Fmoc-Asn 在 DCM中溶解度很差.為了避免這些問(wèn)題，可以用 9-咕噸基，2,4,6-三甲氧葦基，4,4一二甲氧二苯甲基或三苯甲基等保護(hù)，這四種基因均可用 TFA 脫除.4HisHis 是最容易發(fā)生消旋化的氨基酸，必須加以保護(hù).對(duì)咪座環(huán)的非無(wú)-N 開(kāi)始用葦基（Bzl）和甲基磺?；═OS）保護(hù).但這兩種保護(hù)基均不太理想.TOS 對(duì)親核試劑不穩(wěn)定，Bzl需要用氫解或 Na/NHs 除去，并且產(chǎn)生很大程度消旋.Boc 基團(tuán)是一個(gè)較理想的保護(hù)基，降低了咪座環(huán)的堿性，抑制了消旋，成功地進(jìn)行了一些合成.但是

20、當(dāng)反復(fù)地用堿處理時(shí)，也表現(xiàn)出一定的不穩(wěn)定性.哌咤談基在堿中穩(wěn)定，但是沒(méi)能很好地抑制消旋，而且脫保護(hù)時(shí)要用很強(qiáng)的親核試劉如對(duì)咪座環(huán)無(wú)-N 保護(hù)，可以完全抑制消旋，無(wú)-N 可以用葦氧甲基（Bom）和叔丁氧甲基（Bum）保護(hù)，（Bum）可以用 TFA脫除，Bom 更穩(wěn)定些，需用催化氫解或強(qiáng)酸脫保護(hù)，Bum 是目前很有發(fā)展前途的 His 側(cè)鏈保護(hù)基，其不足之處在于 Fmoc（His）Bum 在 DCMKDM 葉的溶解度較差.4CysCys 的SH 具有強(qiáng)親核性， 易被酰化成硫酸， 也易被氧化為二硫鍵， 必須加以保護(hù).常用保護(hù)基有三類： 一類用 TFA 可脫除，如對(duì)甲葦基、對(duì)甲氧葦基和三苯甲基等；第二類

21、可用（CF3CO）3T1/TFA 脫除，對(duì) TFA 穩(wěn)定.如 t-Bu、BomW 乙酰胺甲基等.第三類對(duì)弱酸穩(wěn)定，如葦基和叔丁硫基（stBu）等，Cys（StBu）可用疏基試劑和磷試劑還原，Cys（Bzl）可用 Na/NH3（1）脫保護(hù).4ArgArg 的服基具有強(qiáng)親核性和堿性，必須加以保護(hù).理想的情況是三個(gè)氮都加以保護(hù)，實(shí)際上保護(hù) 1 或 2 個(gè)服基氮原子.保護(hù)基分四類：（1）硝基（2）烷氧城基磺?；郊谆?硝基在制備、酰化裂解中產(chǎn)生很多副反應(yīng)，應(yīng)用不廣.烷氧城基應(yīng)主要有 Boc 和二金剛烷氧城基（Adoc）2、Fmoc（Arg）Boc 的耦聯(lián)反效率不高，哌咤理時(shí)不處穩(wěn)定，會(huì)發(fā)生副反應(yīng)；A

22、doc 保護(hù)了兩個(gè)非無(wú)N,但有同樣的副反應(yīng)發(fā)生.對(duì)磺?；Ｗo(hù)，其中 TOS 應(yīng)用最廣，但它較又 t 脫除.近年來(lái) 2,3,6-三甲基-4-甲氧苯橫酰基（Mtr）較受歡迎,在 TFA 作用下，30 分鐘即可脫除，但是它們都不能完全抑制側(cè)鏈的?；l(fā)生.三苯甲基保護(hù)基可用 TFA 脫除.缺點(diǎn)是反應(yīng)較慢，側(cè)鏈仍有酰化反應(yīng)，且其在 DCMDMF 中溶解度不好.4LysLys 的-NH2 必須加以保護(hù).但與 aNH2 的保護(hù)方式應(yīng)不同，該保護(hù)基要到肽鏈合成后除去.NH2 的保護(hù)無(wú)消旋問(wèn)題，可以采用?；Ｗo(hù)基，其它常用的保護(hù)基有葦氧碳基和 Boc.4Fmoc 基團(tuán)的脫除Fmoc 基團(tuán)的藥環(huán)系的吸電子作用使

23、9-H 具有酸性，易被較弱堿除去，反應(yīng)條件很溫和.反應(yīng)過(guò)程可表示如下：哌咤進(jìn)攻 9-HJ3 消除形成二苯藥烯，很容易被二級(jí)環(huán)胺進(jìn)攻形成穩(wěn)定的加成物.Fmoc 基團(tuán)對(duì)不同的堿穩(wěn)定性不同，可根據(jù)實(shí)際條件選用.4耦聯(lián)反應(yīng)固相中的接肽反應(yīng)原理與液相中基本一致.將兩個(gè)相應(yīng)的氨基被保護(hù)的及竣基被保護(hù)的氨基酸放在溶液內(nèi)，并不形成肽鍵.要形成酰胺鍵，經(jīng)常用的手段是將竣基活化，其方法是將它變成混合酸酊，或者將它變?yōu)榛顫婖?、酰氯，或者用?qiáng)的失去劑(碳二亞胺)也可形成酰胺鍵，耦聯(lián)反應(yīng)可表示如下：(A:城基活潑試劑)碳二亞胺是常用的活化試劑，其中 Dcc 使用范圍最廣，其缺點(diǎn)是形成了不溶于 DCM 勺 DCH 過(guò)濾時(shí)

24、又難于除盡.其他一些如二異丙基碳二亞胺(DCI)、甲基叔丁基碳二亞胺也用于固相合成中，它們形成的月尿溶于 DCW,經(jīng)洗滌可以除去.其他活化試劑，還有 Bop(BopC1)、氯甲酸異丙酯、氯甲酸異丁酯、SOC12t.其中 Dcc、Bop 活化形成對(duì)稱酸酊、SOC1 洗成酰氯，其余三種形成不對(duì)稱酸酊.4對(duì)稱酸酊法用 Dcc 形成對(duì)稱酸酊的方法使用較廣.其缺點(diǎn)是有些氨基酸在 DCW 不易溶解，生成的 Fmoc 氨基酸酊溶解度更差.同時(shí)還有些副反應(yīng)，如形成二肽、消旋等.4混合酸酊法最常用試劑是氯甲酸的異丙基酯和異丁基酯.前者得到的酸酊穩(wěn)定性好.只產(chǎn)生很少消旋，在適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)計(jì)量及溶劑條件下，耦聯(lián)反應(yīng)很快

25、.而且，在此反應(yīng)中使用的 N-甲基嗎啾和 N-甲基哌咤對(duì) Fmoc 基團(tuán)無(wú)影響.4酰氯法在 Boc 法中不常用的酰氯，因?yàn)楸容^激烈，一些保護(hù)基如 Boc 不穩(wěn)定.但是，F(xiàn)moc 基團(tuán)可以耐受酰氯處理，生成的 Fmoc 氨基酰氯也很穩(wěn)定.在三甲基乙酸/三胺或苯并三氮座/二異丙基乙二胺中， 反應(yīng)速度很快， 消旋很少.酰氯法在固相合成中應(yīng)用還不多，但已表明，F(xiàn)moc-氨基酰氯適用于合成有立體障礙的肽序列.4活化酯法活化酯法在固相合成中應(yīng)用最為廣泛.采用過(guò)的試劑也很多，近來(lái)最常用的有 HOBt 酯、ODhbt 酯、OTD 磔旨等.HOBt 酯反應(yīng)快，消旋少，用碳二亞胺很容易制得；ODhbt 酯很穩(wěn)定，

26、容易進(jìn)行分離純化，與 HOBt 酯具有類似的反應(yīng)性和消旋性能，它還有一個(gè)優(yōu)越之處，在?；瘯r(shí)有亮黃色、耦聯(lián)結(jié)束時(shí)顏色消失，有利于監(jiān)測(cè)反應(yīng)；OTDO酯與 ODhbt 酯類似，消旋化極低，易分離，酰化時(shí)伴有顏色從桔紅色到黃色的變化等4原位法將碳二亞胺和 a-N 保護(hù)氨基酸直接加到樹(shù)脂中進(jìn)行反應(yīng)叫做原位法用 DIC 代替 Dcc 效果更好.其他的活化試劑還有 Bop 和 Bop-C1 等.原位法反應(yīng)快、副反應(yīng)少、易操作.其中 DIC 最有效，其次是 Bop，Bop-C1 等.遺憾的是 Bop ?；瘯r(shí)生成致癌的六甲基磷酰胺，限制了其應(yīng)用4裂解及側(cè)鏈保護(hù)基脫除Fmoc 法裂解和脫側(cè)鏈保護(hù)基時(shí)可采用弱酸.T

27、FA 為應(yīng)用最廣泛的弱酸試劑，它可以脫除 t-Bu、Boc、Adoc、Mtr 等；條件溫和、副反應(yīng)較少.不足之處：Arg 側(cè)鏈的 Mtr 很難脫除，TFA 用量較大；無(wú)法除掉 Cys 的 t-Bu 等基因.也有采用強(qiáng)酸脫保護(hù)的方法：如用 HF 來(lái)脫除一些對(duì)弱酸穩(wěn)定的保護(hù)基，如 Asp、Glu、Ser、Thr 的 Bzl（土基）保護(hù)基等，但是當(dāng)脫除 Asp 的吸電子保護(hù)基時(shí)，會(huì)引起環(huán)化副反應(yīng).而 TMSB 而 TMSOT 施有苯甲硫酸存在時(shí)，脫保護(hù)速度很快.此外，根據(jù)條件不同，堿、光解、氟離子和氫解等脫保護(hù)方法也有應(yīng)用Fmoc 基團(tuán)用于固相合成多肽已經(jīng)有了十多年的歷史，在合成一些含有在酸性條件下

28、不穩(wěn)定的氨基的殘基的肽時(shí)，具有特別優(yōu)越之處.將 Fmoc 法和 Boc 法互相補(bǔ)充，定會(huì)在合成更多、更大的生物分子中發(fā)揮。:、常用保護(hù)氨基酸數(shù)據(jù)縮寫(xiě)名稱分子量縮寫(xiě)名稱分子量A-AlaFmoc-Ala329.3M-MetFmoc-Met371.5R-ArgFmoc-Arg(Pbf)648.77F-PheFmoc-Phe387.4N-AsnFmoc-Asn(Trt)596.7(D)F-PheFmoc-D-Phe387.4D-AspFmoc-Asp(OtBu)411.46P-ProFmoc-Pro337.4C-CysFmoc-Cys(Trt)585.7S-SerFmoc-Ser(tBu)383.4Q

29、-GlnFmoc-Gln(Trt)610.7T-ThrFmoc-Thr(tBu)397.5E-GluFmoc-Glu(OtBu)425.48W-TrpFmoc-Trp(Boc)526.59G-GlyFmoc-Gly297.3(D)W-TrpFmoc-D-Trp(Boc)526.59H-HisFmoc-His(Trt)619.7D-TyrFmoc-Tyr(tBu)459.5I-IleFmoc-Ile353.4V-ValFmoc-Val339.4L-LeuFmoc-Leu353.4pGluPyroGlu129.1K-LysFmoc-Lys(Boc)468.5常用試劑種類及數(shù)據(jù)名稱分子量名稱分子量密

30、度(g/ml)HOBt135.1DIPCDI(DIC)126.30.806TBTU321.1DIPEA(DIA)129.40.76HATU380.3AcO102.11.08DMAP122.1Pyridine79.10.983HOAT136.1TFA114.21.44PyBOP580.3TMP121.180.92EDT94.241.123TIS158.4NMM101.150.9168常見(jiàn)保護(hù)基團(tuán)結(jié)構(gòu)及數(shù)據(jù)縮寫(xiě)分子量縮寫(xiě)分子量縮寫(xiě)分子量Fmoc-222tBu-56Acm-57Pbf-253OtBu-72Mz-165.1Trt-242.3Ac-43Boc-101.1Z-134.1三、常用氨基酸結(jié)構(gòu)及

31、性質(zhì)NameSymbolMWMW(-H2O)StructureThreeLetterCodeOneLetterCodeAlanineAlaA89.0971.08ArginineArgR174.20156.19AsparagineAsnN132.12114.10AsparticAcidAspD133.10115.09CysteineCysC121.15103.15GlutamicAcidGluE147.13129.12GlutamineGlnQ146.15128.13GlycineGlyG75.0757.05HistidineHisH155.16137.14IsoleucineIleI131.1

32、7113.16LeucineLeuL131.17113.16LysineLysK146.19128.17MethionineMetM149.21131.20PhenylalaninePheF165.19147.18ProlineProP115.1397.12SerineSerS105.0987.08ThreonineThrT119.12101.11TryptophanTrpW204.23186.21TyrosineTyrY181.19163.18ValineValV117.1599.13四、常見(jiàn)保護(hù)基團(tuán)結(jié)構(gòu)NameStructureSymbolFormulaResidueWtAcetamido

33、methylAcmC3H6NO72.1AcetylAcC2H3O43.0AllyloxycarbonylAlocC4H5O285.16-AmidohexanoateLCC4H7NO85.17-Amido-4-methylcoumarylAMCC10H8NO2174.27-Amido-4-trifluoromethyl-coumarylAFCC10H5F3NO2228.25-(2-Aminoethyl)amino-naphthalene-1-sulfonicacidEDANSC12H13N2O3S265.3BenzoylBzC7H5O105.1BenzylBzlC7H791.1Benzyloxy

34、carbonylZ(Cbz)C8H7O2135.1BenzyloxymethylBomC8H9O121.2(+)-BiotinylBiotinC10H15N2O2S227.32-Bromobenzyloxycarbonyl2-Br-ZC8H6BrO2214.0tert-ButyltBuC4H957.1tert-ButyloxycarbonylBocC5H9O2101.1tert-ButylthioStBuC4H9S89.22-Chlorobenzyloxycarbonyl2-Cl-ZC8H6ClO2169.6CyclohexylcHexC6H1183.12,6-Dichlorobenzyl2,

35、6-di-Cl-BzlC7H5Cl2160.04-(4-Dimethylaminophenyl-azo)benzoylDABCYLC15H14N3O252.32,4-DinitrophenylDnpC6H3N2O4167.19-FluorenylmethylFmC14H11179.19-Fluorenylmethyloxy-carbonylFmocC15H11O2223.3FluoresceinIsothiocyanateFITCC21H12NO5S390.4LissamineRhodamineLRC31H38N2O6S2598.8Mesitylene-2-sulfonylMtsC9H11O2

36、S183.34-MethoxybenzylMobC8H9O121.2(7-Methoxycoumarin-4-yl)acetylMcaC12H9O4217.24-Methoxy-2,3,6-trimethyl-benzenesulfonylMtrC10H13O3S213.34-MethoxytritylMmtC20H17O273.44-MethylbenzylMBzlC8H9105.24-MethyltritylMttC20H17257.44-MorpholinecarbonylMuC5H8NO2114.1p-NitroanilidepNAC6H5N2O2137.12,2,4,6,7-Pent

37、amethyldihydro-benzofuran-5-sulfonylPbfC13H17O3S253.32,2,5,7,8-Pentamethyl-chroman-6-sulfonylPmcC14H19O3S267.4Rhodamine110R110C20H13N2O3329.3SuccinylSucC4H5O3101.14-ToluenesulfonylTosC7H7O2S155.2TritylTrtC17H15243.3XanthylXanC13H9O181.2五、多肽常識(shí)ReconstitutionandStorageofPeptidesPeptidesareusuallysuppli

38、edasafluffy,freeze-driedmaterialinserumvials.Storepeptidesinafreezeraftertheyhavebeenreceived.Inordertoreconstitutethepeptide,distilledwaterorabuffersolutionshouldbeutilized.Somepeptideshavelowsolubilityinwaterandmustbedissolvedinothersolventssuchas10%aceticacidforapositivelychargedpeptideor10%ammon

39、iumbicarbonatesolutionforanegativelychargedpeptide.Othersolventsthatcanbeusedfordissolvingpeptidesareacetonitrile,DMSO,DMF,orisopropanol.Usetheminimalamountofthesenon-aqueoussolventsandaddwaterorbuffertomakeupthedesiredvolume.Afterpeptidesarereconstituted,theyshouldbeusedassoonaspossibletoavoiddegra

40、dationinsolution.Unusedpeptideshouldbealiquotedintosingle-useportions,relyophilizedifpossible,andstoredat-20C.Repeatedthawingandrefreezingshouldbeavoided.MethodstoDissolvePeptidesThebestwaytodissolveapeptideistousewater.Forpeptidesthatarenotsolubleinwater,usethefollowingprocedure:10.Foracidicpeptide

41、s,useasmallamountofbasesuchas10%ammoniumbicarbonatetodissolvethepeptide,dilutewithwatertothedesiredconcentration.Donotusebaseforcysteine-containingpeptides.11.Forbasicpeptides,useasmallamountof30%aceticacid,dilutewithwatertothedesiredconcentration.12.Foraveryhydrophobicpeptide,trydissolvingthepeptid

42、einaverysmallamountofDMSO,dilutewithwatertothedesiredconcentration.13.Forpeptidesthattendtoaggregate(usuallypeptidescontainingcysteines),add6Murea,6Mureawith20%aceticacid,or6Mguanidine?HCltothepeptide,thenproceedwiththenecessarydilutions.PreparationofHBTU/HOBtSolutionforthePeptideSynthesizer1Prepara

43、tionof0.5MHOBtinDMF:oWeigh13.5ganhydrousHOBt(0.1mol,MW135.1)100g,AnaSpecCatalog#21003;500g,AnaSpecCatalog#21004intoa250mLgraduatedcylinder.oAddDMFuntilthe200mLlevelisreached.2Preparationof0.45MHBTU/HOBtsolution:oAddthesolutionpreparedinstep1to37.9gHBTU(0.1mol,MW379.3)100g,AnaSpecCatalog#21001;500g,A

44、naSpecCatalog#21002containedinabeakeroranErlenmayerflask.3Stirforabout15minwithamagneticstirringbaruntilHBTUisdissolved.4Filterthesolutionthroughafineporesizesinteredglassfunnel.5Pourthefilteredsolutionintoanappropriatebottleforattachmenttoapeptidesynthesizer.*Thissolutionisstableatroomtemperaturefo

45、ratleastsixweeks.BiotinylationofAminoGroup1.Wash0.1mmolresinwithDMF.2.Dissolve0.244g(+)-biotin(1mmol,MW244.3)1g,AnaSpecCatalog#21100;5g,AnaSpecCatalog#21101in5mLDMF-DMSO(1:1)solution.Alittlewarmingisnecessary.3.Add2.1mL0.45MHBTU/HOBtsolutionand0.3mLDIEAtothesolutionpreparedinstep2.4.Addtheactivatedb

46、iotinsolutiontotheresinandletstirovernight.5.Checkresintomakesurecouplingiscompleteasevidencedbynegativeninhydrintest(colorless).6.WashresinwithDMF-DMSO(1:1)(2x)toremoveexcess(+)-biotin.7.WashresinwithDMF(2x)andDCM(2x).8.Lettheresindrybeforeproceedingtocleavage.ProcedureforLoadingFmoc-AminoAcidto2-C

47、hlorotritylChlorideResin11.Weigh10g2-chlorotritylchlorideresin(15mmol)1g,AnaSpecCatalog#22229;5g,AnaSpecCatalog#22230inareactionvessel,washwithDMF(2x),swelltheresinin50mLDMFfor10min,drainvessel.12.Weigh10mmolFmoc-aminoacidinatesttube,dissolveFmoc-aminoacidin40mLDMF,transferthesolutionintothereaction

48、vesselabove,add8.7mLDIEA(50mmol),swirlmixturefor30minatroomtemperature.13.Add5mLmethanolintothereactionvesselandswirlfor5min.14.DrainandwashwithDMF(5x).15.Checksubstitution.16.Add50mL20%piperidinetoremovetheFmocgroup.Swirlmixturefor30min.17.WashwithDMF(5x),DCM(2x),putresinontissuepaperoverafoampadan

49、dletdryatroomtemperatureovernightunderthehood.Covertheresinwithanotherpieceoftissuepaper,presslightlytobreakaggregates.18.Weighloadedresin.19.Packinappropriatecontainer.ProcedureforCheckingSubstitutionofFmoc-AminoAcidLoadedResins1.Weighduplicatesamplesof5to10mgloadedresininaneppendorftube,add1.00mL2

50、0%piperidine/DMF,shakefor20min,centrifugedowntheresin.2.Transfer100Lioftheabovesolutionintoatubecontaining10mLDMF,mixwell.3.Pipette2mLDMFintoeachofthetwocells(referencecellandsamplecell),setspectrophotometertozero.Emptythesamplecell,transfer2mLofthesolutionfromstep2intothesamplecell,checkabsorbance.

51、4.Subs=101(A)/7.8(w)A=absorbancew=mgofresin5.Checkabsorbancethreetimesat301nm,calculateaveragesubstitution.ManualFmocSynthesis(0.25mmol)5WashresinwithDMF(4x)andthendraincompletely.6Addapproximately10mL20%piperidine/DMFtoresin.Shakeforoneminanddrain.7Addanother10mL20%piperidine/DMF.Shakefor30min.8Dra

52、inreactionvesselandwashresinwithDMF(4x).Makesurethereisnopiperidineremaining.Checkbeadsusingninhydrintest,beadsshouldbeblue.9CouplingStep-Preparethefollowingsolution:1.mmolFmoc-aminoacid2.1mL0.45MHBTU/HOBT(1mmol)348 仄 DIEA(2mmol)Addabovesolutiontotheresinandshakeforaminimumof30min.Thiscouplingstepca

53、nbelongerifdesired.10DrainreactionvesselandwashresinwithDMF(4x).11PerformNinhydrintest:oIfnegative(colorless),proceedtostep2andcontinuesynthesis.oIfpositive(blue),returntostep5andre-couplethesameFmoc-aminoacid.Increasethecouplingtimeifnecessary.SynthesisofPhosphotyrosine-ContainingPeptidesUsingFmoc-

54、PhosphotyrosineReagent:N-Fmoc-O-phosphotyrosine1g,AnaSpecCatalog#20254;5g,AnaSpecCatalog#202558.For0.1mmolor0.25mmolsynthesis,use0.483gFmoc-Tyr(PO3H2)-OH(1mmol,MW483.4).ForABIsynthesizers,packFmoc-Tyr(PO3H2)-OHinacartridge.9.ThecycleprogramforcouplingFmoc-Tyr(PO3H2)-OHisthesameasforotherFmoc-aminoac

55、idsexceptforthecouplingtime(seestep3).(Note:ABIsynthesizersuseHBTU/HOBTastheactivatingreagent.)10.ThecouplingtimeforFmoc-Tyr(PO3H2)-OHneedstobeincreased.ForABImodel430Apeptidesynthesizer,insertseveralsteps(i.e.,vortexon,wait990sec,vortexoff,toincreasethecouplingtime).ForABImodel431Apeptidesynthesize

56、r,addadditionalIs.Overnightcouplingmaybenecessaryforsomesequences.11.AfterthecouplingstepforFmoc-Tyr(PO3H2)-OH,performninhydrintesttoensurecompletecoupling.Negative(colorless)ninhydrintestindicatescompletecoupling,whileapositive(blue)ninhydrintestindicatesincompletecoupling.12.Increasethecouplingtim

57、eoftheaminoacidresiduesafterthephosphotyrosineorperformdoublecoupling.(Note:Thecouplingofaminoacidsafterthephosphotyrosinecanbedifficult.)13.Thereisalimitonthenumberofaminoacidresiduesthatcanbecoupledafterthehosphotyrosine.Sincethephosphogroupisunprotected,sidereactionsarelikelytoccur.(Note:Peptides

58、havebeensuccessfullycoupledwithsequencescontainingupotenadditionalaminoacidsfollowingthephosphotyrosineresidue.)SimultaneousSynthesisofPeptidesWhichDifferintheC-TerminiUsing2-ChlorotritylResinandWangResin*PeptideswhichdifferintheC-terminicanbesimultaneouslysynthesizedinonereactionvesselbyemployingre

59、sinsthatpossessdifferentcleavageproperties.Theresinsusedweretheweakacidlabile2-chlorotritylresinsandtheTFAlabileWangresins.Thesuccessofthisapproachwasshownbytheco-synthesisofACTH(4-10)withACTH(4-11)andNeuropeptideY,aC-terminalamidepeptidewithitscorrespondingC-terminalfreeacidanalog.*HongA.,LeT.,andP

60、hanT.TechniquesinProteinChemistryVI,531-562(1995).CleavageProtocoltoProduceFullyProtectedPeptideStartingResin:ChlorotritylresinsReagentsfor1gPeptide-Resin:1mLaceticacid(AcOH)2mLtrifluoroethanol(TFE)1. mLdichloromethane(DCM)1.Prepareabovemixture.2.Addpeptide-resintothemixtureandletitstiratroomtemperature