淺論二 ■ 英對小鼠異位子宮內(nèi)膜影響的分子機制研究

1、淺論二 英對小鼠異位子宮內(nèi)膜影響的分子機制研究         【摘要】  【目的】 探討四氯二苯并二 英(TCDD)對子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型的影響及其分子學機制。 【方法】 采用小鼠自體子宮內(nèi)膜移植法建立小鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型，分別給予TCDD 0、l、3、10 g/kg劑量灌胃，每21 d 1次，于建模術(shù)后3、6、9周處死，鑒定異位病灶的形成，測量異位病灶體積。采用免疫組化法和RT-PCR法檢測各組小鼠異位子宮內(nèi)膜組織中芳香烴受體(AhR)和細胞色素P450 1A1(CYP1A1)表達水平?！窘Y(jié)果】

2、染毒組小鼠異位病灶體積的增加與染毒劑量和時間具有明顯的正相關(guān)性(r = 為0.727、0.553，均P 0.05);染毒組小鼠異位子宮內(nèi)膜AhR蛋白較對照組增強(P 0.05);且隨染毒劑量增加和染毒時間延長，AhR蛋白表達相應增加(r分別為0.687、0.442，均P 0.01);隨染毒劑量增加，CYP1A1蛋白表達相應增加(r = 0.640，P 0.01)，對照組未檢測到CYP1A1蛋白表達;染毒組小鼠異位子宮內(nèi)膜AhR mRNA較對照組增強(P 0.05)。隨染毒劑量增加和暴露時間延長，AhR mRNA表達相應增加(r分別為0.565、0.635，P 0.01);隨染毒劑量的增加，CY

3、P1A1 mRNA表達明顯增加(r = 0.659，P 0.01)，對照組小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中未檢測到CYP1A1mRNA?！窘Y(jié)論】 TCDD可促進小鼠模型異位子宮內(nèi)膜病灶的發(fā)展，其機制可能與AhR及其下游基因CYP1A1激活有關(guān)。AhR及CYP1A1的表達增強是二 英暴露的生化指標。 【關(guān)鍵詞】  四氯二苯并二 英; 子宮內(nèi)膜異位癥; 小鼠; AhR; CYP1A1Abstract： 【Objective】 To investigate the effect of 2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) on development

4、of endometriosis in a mouse model from perspective of molecular mechanism. 【Methods】 The endometriosis mouse model was established with autotransplantation of endometrium. Twenty-one days prior to induction surgery which produces endometriosis， female mice were pretreated with 2，3，7，8-tetrachlorodib

5、enzo-p-dioxin (TCDD) at 0， 3， or 10 mg TCDD/kg. Animals were treated again at the time of surgery and at 3， 6， and 9 weeks following surgery. Evaluation of ectopic focuses diameter were made at 3， 6， 9 weeks post surgery. The AhR and CYP1A1 expression on ectopic endometrium were identified by immuno

6、histochemistry and RT-PCR assays. 【Results】 With increased time and dose of TCDD exposure， it produced a dose-dependent increase in endometriotic site diameter when all time points were pooled within each dose in mice (r = 0.727 and 0.553 respectively， both P 0.05). The expression of AhR protein on

7、ectopic focuses in mice were higher in the TCDD exposure group than those in control group， and presented time-dose dependent increase (r = 0.687 and 0.442， both P 0.01). The higher dose of exposure increased， the higher CYP1A1 protein expressions enhanced (r = 0.640， P 0.01). As compared with the c

8、ontrol group， the expression of AhR mRNA in ectopic focuses of mice were higher in the TCDD exposure group， and show time-dose dependent increase (r = 0.565 and 0.635， both P 0.01). The higher dose of exposure increased， the higher CYP1A1 mRNA expression enhanced (r = 0.659， P 0.01). 【Conclusion】 TC

9、DD can promote progression of ectopic focus of endometriosis in the mouse 子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)是育齡婦女的常見病，但其發(fā)病機制尚不清楚。近年來流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)二英(dioxin)污染越嚴重的國家或地區(qū)，其EMS的發(fā)病率越高1。所以，推測涉及外來物解毒的酶活性的改變可能是EMS的危險因素。毒理研究發(fā)現(xiàn)二英通過與芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)結(jié)合并激活AhR介導的信號途徑，發(fā)揮不同毒性效應。細胞色素P450 1A1(Cytochrome P450 1A

10、1，CYP1A1)屬重要的I相解毒酶，是目前研究最多的AhR反應基因，報道稱其基因多態(tài)性可能與子宮內(nèi)膜異位癥的形成密切相關(guān)。本文選擇二英中最具代表性的2，3，7，8-四氯二苯并-對-二英(2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)為研究對象，探討在EMS模型中不同劑量及時間TCDD作用模式下TCDD樣配體AhR及其下游活性物質(zhì)CYP1A1的基因表達狀態(tài)，探尋TCDD在EMS中可能涉及的分子水平作用機制。1 材料和方法1.1 動物建模參考1996年Cummings的嚙齒類動物TCDD實驗模式建模4-5，60只成熟未孕SPF級ICR雌性小鼠(體質(zhì)量為28 3

11、2 g，購自南通大學實驗動物中心)隨機分為3個時間組(3周組、6周組、9周組)，每組20只，每組再隨機分成4個TCDD(標準品純度 99%，購自Cerilliant公司)劑量組(每組5只)，其分別為對照組(0 g/kg)、低劑量組(1 g/kg)，中劑量組(3 g/kg)和高劑量組(10 g/kg)。通過灌胃法染毒，每21 d給藥1次，首次給藥時間記為0 d，在給藥的第21天，再次給藥同時行小鼠自體子宮內(nèi)膜移植術(shù)，自一側(cè)子宮角取約2 mm × 1 mm組織2塊，分別縫合在小鼠腹膜、卵巢。分別在術(shù)后3、6、9周采用脫臼法依次處死各組小鼠，3周組小鼠共暴露TCDD 2次;6周組小鼠共暴露

12、TCDD 3次;9周組小鼠共暴露TCDD 4次。1.2 免疫組織化學檢測AhR(PRT 9)單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)和CYP1A1(B-4)單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology)分別作為一抗。石蠟切片，采用SP法，染色步驟按試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)內(nèi)說明進行，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)顯色。用已知陽性的小鼠胎盤組織作陽性對照，以磷酸鹽緩沖液替代一抗作陰性對照。顯微鏡下，細胞胞漿中具有棕褐黃色顆粒者為陽性細胞。結(jié)果采用計算機圖像分析軟件Image-Pro plus 4.5 對AhR及CYP1A1陽性部位進行原位半定量檢

13、測，每張切片隨機選用5個視野，選取陽性部位，測定累積光密度(integral optical density，IOD)、面積(area)、計算相對光密度(相對IOD = IOD/area)值，而5個視野的相對IOD平均值作為該切片的代表值。1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測AhR、CYP1A1和內(nèi)參照物-actin引物應用軟件Primer5.0設(shè)計，由南京金思特科技有限公司合成，與從Gene Bank下載的mRNA序列核對無誤。AhR上游引物：5-TACTCCACTTCAGCCACC-3，下游引物：5-TGTCATGCCACTTTCTCC-3，241 bp;CYP1A1上游引物：5

14、-AGTATTTGGTCGTGTCA GTAG-3，下游引物：5-TCCAGGGAAGAGTTAGGC -3，494 bp;-actin上游引物：5-ATGGATGACGAT ATCGCT-3，下游引物：5-ATGAGGTAGTCTGTCA GGT-3，184 bp。參照Trizol Reagent(美國Invitrogen公司)說明書，采用一步法提取子宮內(nèi)膜異位灶組織的總RNA。RT-PCR參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa RNA PCR kit (AMV) ver3.0 (大連寶生物工程有限公司)說明書進行。擴增條件：94 預變性2 min;94 變性30 s，47 退火30 s，72 延伸3

15、0 s，擴增30個循環(huán)。2%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)攝影，掃描PCR產(chǎn)物溴乙錠染色后強度，分別行定性及半定量檢測。1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，數(shù)據(jù)以x ± s表示，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD(Least-significant difference)法進行組間比較，多個變量之間相關(guān)性用皮爾遜相關(guān)分析(Pearson correlation test)，P 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2 結(jié) 果2.1 TCDD對EMS小鼠的影響建模術(shù)后3周開腹鑒定異位病灶的形成，對照組(n = 5)和染毒組(n = 15)小鼠的

16、卵巢和腹壁種植處均建模成功，形成典型的異位病灶。Pearson相關(guān)分析顯示，染毒時間和劑量與異位病灶面積的增長呈明顯的正相關(guān)(r分別為0.727、0.553，均P 0.01)。對照組成模小鼠的異位種植灶在不同時間點(術(shù)后3、6、9周)，其外觀大體一致。2.2 AhR在小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中的表達免疫組化顯示對照組和染毒組小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶中均有AhR陽性反應表達。AhR蛋白于對照組小鼠子宮內(nèi)膜腺上皮細胞的胞漿上，AhR蛋白在染毒組小鼠子宮內(nèi)膜腺上皮和基質(zhì)細胞的胞漿均有表達，主要位于基質(zhì)細胞胞漿(圖1)。AhR蛋白在染毒組小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶中表達增強，和對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P 0.

17、05)。6周和9周時，不同染毒劑量組AhR蛋白表達差異明顯(P 0.05);隨著染毒劑量的增加和染毒時間延長，AhR蛋白表達也相應增加(r分別為0.687、0.442，均P 0.01;表1)。         2.3 CYP1A1在小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中的表達CYP1A1蛋白位于染毒組小鼠子宮內(nèi)膜腺上皮細胞的胞漿，高劑量染毒組CYP1A1蛋白表達明顯增加，和低劑量染毒組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P 0.05)。隨染毒劑量增加，CYP1A1蛋白表達相應增加(r = 0.640，P 0.01)，染毒時間延長和CYP1A1

18、蛋白表達無明顯相關(guān)性(r = 0.038，P 0.01)，對照組小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶上未檢測到CYP1A1蛋白表達(圖2，表2)。2.4 AhR mRNA在小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中表達染毒組小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中AhR mRNA表達明顯增加，和對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P 0.05)，6周和9周時，各染毒劑量之間比較，AhR mRNA表達水平差異明顯，有統(tǒng)計學意義(P 0.05)。隨染毒劑量增加和暴露時間延長，AhR mRNA表達相應增加(r分別為0.565、0.635，P 0.01;表3，圖3)。2.5 CYP1A1 mRNA在小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中的表達染毒組小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中檢測到

19、CYP1A1 mRNA表達，同一時間組內(nèi)(3，6，9周)不同染毒劑量比較其表達差異明顯，有統(tǒng)計學意義(P 0.05)。隨染毒劑量的增加，CYP1A1 mRNA表達明顯增加(r = 0.659， P 0.01)，暴露時間的延長并沒有增加其mRNA表達(r = 0.068， P 0.05)，對照組小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中未檢測到CYP1A1 mRNA。見表4，圖4。3 討 論3.1 TCDD在EMS發(fā)生中的作用近年來，越來越多的學者發(fā)現(xiàn)EMS發(fā)病率的增高可能與現(xiàn)代環(huán)境污染釋放的環(huán)境毒素有關(guān)，其中毒性最強的環(huán)境毒素二英與EMS之間關(guān)系引起世界廣泛關(guān)注1。比利時也是世界二英污染較嚴重的國家之一，研究發(fā)現(xiàn)

20、比利時女性血液中二英的毒性當量(toxic equivalents，TEQ)明顯高于意大利女性，就比利時國家EMS和二英相關(guān)性的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，隨著血液中二英TEQ的升高，腹腔EMS和子宮腺肌癥的發(fā)病危險性也會相應增加，進一步證實了二英可能是EMS發(fā)病的致病因素之一。本實驗EMS小鼠模型研究也證實了TCDD可促進小鼠EMS異位病灶的生長，且有時間和劑量的依賴性。盡管如此，兩者的關(guān)聯(lián)性從動物模型至人群流行病學調(diào)查仍存在爭議9-10。研究結(jié)果的不一致性考慮可能是因為病例組和對照組的篩選標準、研究設(shè)計及分析方法等不同所導致。因此，二英和EMS的相關(guān)性有待  Porpora MG， Medda

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