原代細(xì)胞培養(yǎng)與分離

1、原代細(xì)胞的培養(yǎng)與建系凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。細(xì)胞的純化或細(xì)胞克隆技術(shù)是細(xì)胞培養(yǎng)工作的基礎(chǔ)。第一節(jié)原代細(xì)胞的取材人和動(dòng)物細(xì)胞的取材是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的首要條件，直接影響細(xì)胞的體外培養(yǎng)。一、取材的基本要求.1取材要注意新鮮和保鮮.2應(yīng)嚴(yán)格無菌.3防止機(jī)械損傷.4去除無用組織和避免干燥.5應(yīng)注意組織類型、分化程度、年齡等.6作好記錄二、各類組織的取材技術(shù)皮膚和粘膜的取材內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材血液細(xì)胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材動(dòng)物組織取材人胚體組織取材雞（鴨）鳥類胚胎組織取材雞（鴨）鳥類胚胎組織取材皮膚和粘膜的取材.主要取自于手術(shù)過程

2、中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術(shù)操作，但面積一般24平方厘米。內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材.內(nèi)臟除消化道外基本是無菌的，但取材時(shí)要明確和熟悉所需組織的類型和部位，實(shí)體瘤取材時(shí)要取腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域，要避開破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結(jié)締組織。血液細(xì)胞的取材.血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中（如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結(jié)等）分離細(xì)胞，取材時(shí)應(yīng)注意抗凝。骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材.嚴(yán)格無菌，注意抗凝，還要盡快分離培養(yǎng)，離心后，用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不宜低溫存放。動(dòng)物組織取材.1、鼠胚組織取材.首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的

3、動(dòng)物，然后將其整個(gè)浸泡在含有75%酒精的燒杯中，5分鐘后（注意時(shí)間不能太長(zhǎng)，以避免酒精從口或其他通道進(jìn)入體內(nèi)，影響組織活力），取出動(dòng)物，在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開皮膚，用無菌操作法解剖取胚或用無菌止血鉗挾起皮膚、用無菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開皮膚，用止血鉗分別挾住兩側(cè)皮膚拉向頭尾，把動(dòng)物反包，暴露軀干，然后再固定，更換無菌解剖器材，采用無菌操作法解剖取出胚胎。.2、幼鼠胚腎（或肺）取材.幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切開游離毛皮并拉開至兩側(cè)：然后采用無菌法打開胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先將背部毛皮切開游離并拉向兩側(cè)，然后采用無菌法從背部打

4、開腹腔取腎。人胚體組織取材.取材方法與鼠類相同雞（鴨）鳥類胚胎組織取材步驟.（1）取孵化至適當(dāng)胚齡（912天）的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運(yùn)動(dòng)的胚蛋，說明胚體發(fā)育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。.（2）將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干；.（3）經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用無菌法用剪刀或中號(hào)鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼；.（4）用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚；.（5）用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無菌平皿中，解剖取材。第二節(jié)原代細(xì)胞的分離和制作.人或動(dòng)物體內(nèi)（或胚胎組織）由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個(gè)細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長(zhǎng)繁殖

5、，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開，使細(xì)胞解離出來。一、懸浮細(xì)胞的分離方法.組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最簡(jiǎn)單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。二、實(shí)體組織材料的分離方法.對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。（一）機(jī)械分散法.方法:.特點(diǎn):簡(jiǎn)便、快速,但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差,適用于處理纖維成分少的軟組織。（二）消化分離法.組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和

6、非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)。1酶消化分離法.酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶.胰蛋白酶分散原理：胰蛋白酶是一種胰臟制品，對(duì)蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開。影響胰蛋白酶作用的主要因素.細(xì)胞類型.酶的活力.酶的濃度.溫度.pH .無機(jī)鹽離子.消化時(shí)間膠原酶（Collagenase）消化法.膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來的酶，對(duì)膠原有很

7、強(qiáng)的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用。表4-1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別項(xiàng)目胰蛋白酶膠原酶消化特性適用于消化軟組織適用于消化纖維多的組織用量0.01%0.5%0.10.3mg/mL(200u/mL)消化時(shí)間0.52小時(shí)（小塊）112小時(shí)pH896.57.0作用強(qiáng)度強(qiáng)烈緩和細(xì)胞影響時(shí)間過長(zhǎng)有影響無大影響血清、鈣、鎂離子有影響無影響較硬組織軟組織4室溫374室溫37胰蛋白酶(0.25%)244816121224120.51膠原酶(200u/mL)兩者聯(lián)合(對(duì)沖)12461224412122461212酶種類表4-2 胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消

8、化各種組織小塊時(shí)所需時(shí)間(小時(shí))(0.51cm3)2非酶消化法（EDTA消化法）.EDTA是一種非酶消化物，又稱螯合劑或Versene，全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液，對(duì)一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學(xué)物質(zhì)能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離。3消化分離法的操作步驟.剪切.加液漂洗.消化.棄去消化液.漂洗.機(jī)械分散4消化分離法的注意事項(xiàng).（1）組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對(duì)胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。.（2）胰蛋白濃度不宜過高，作用時(shí)間不能太長(zhǎng)，以避免毒性

9、作用。.（3）消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動(dòng)作要輕，以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失。三、原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法.原代細(xì)胞的培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)是從供體取得組織細(xì)胞在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)，是建立細(xì)胞系的第一步，是一項(xiàng)基本技術(shù)。.原代細(xì)胞最接近和最能反映體內(nèi)生長(zhǎng)特性，適宜用于藥物敏感性試驗(yàn)、細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)研究。（一）組織塊培養(yǎng)法.組織塊培養(yǎng)是常用、簡(jiǎn)便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法。.其基本方法是將剪成的小組織團(tuán)塊接種于培養(yǎng)瓶（或皿）中，瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長(zhǎng)。（二）消化培養(yǎng)法（三）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法.對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋

10、巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。（四）器官培養(yǎng).器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，.器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對(duì)完整性，可用于重點(diǎn)觀察細(xì)胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。第三節(jié)原代和傳代細(xì)胞的培養(yǎng)和維持.原代細(xì)胞的培養(yǎng)與維持.原代細(xì)胞培養(yǎng)的首次傳代.傳代細(xì)胞的傳代培養(yǎng).傳代細(xì)胞的建系和維持一、原代細(xì)胞的培養(yǎng)與維持.(一)原代細(xì)胞培養(yǎng)：.1靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))培養(yǎng).2懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)

11、)培養(yǎng)要求.細(xì)胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性.細(xì)胞接種時(shí)濃度要稍大一些，至少為5108細(xì)胞/L。.培養(yǎng)基可用Eagle(MEM)或DNEM培養(yǎng)。.小牛血清濃度為10%-80%。.應(yīng)在375% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。.在起始的2天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細(xì)胞發(fā)生脫落，漂浮。.待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，應(yīng)將原代細(xì)胞換液.用骨髓或外周血中的懸浮細(xì)胞經(jīng)靜置培養(yǎng)1周時(shí)，應(yīng)將細(xì)胞懸液經(jīng)低速離心后換液。懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)要求.原代培養(yǎng)時(shí)要盡量去除紅細(xì)胞.短期培養(yǎng)，可在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行.細(xì)胞濃度可在5-8109/L范圍內(nèi)，.進(jìn)行分瓶試驗(yàn)。.長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)，淋巴細(xì)胞

12、中要加入生長(zhǎng)因子，白血病細(xì)胞中要加入少量的原患者血清，以利細(xì)胞生長(zhǎng)。.細(xì)胞換液一般每隔3天需半量換液一次.細(xì)胞傳代一般待細(xì)胞增殖加快、細(xì)胞密度較高時(shí)才能進(jìn)行。 (二)原代細(xì)胞的維持.貼壁細(xì)胞長(zhǎng)成網(wǎng)狀或基本單層時(shí)，未達(dá)到飽和密度，需采取換液方式來更新營(yíng)養(yǎng)成分以滿足細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖的需要。.換入等量完全培養(yǎng)基或換成含2%小牛血清的維持液。.懸浮細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)基中不僅會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化而且會(huì)發(fā)生分裂繁殖，此時(shí)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分并不能維持細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求，需進(jìn)行換液。通常采用半量換液的方法。二、原代細(xì)胞培養(yǎng)的首次傳代.原代培養(yǎng)后由于懸浮細(xì)胞增殖，數(shù)量增加甚至達(dá)飽和密度；貼壁細(xì)胞的相互匯合，使整個(gè)瓶底逐漸被細(xì)胞覆蓋

13、，細(xì)胞難以繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，需要進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，這種使原代細(xì)胞經(jīng)分散接種的過程稱之為傳代。首次傳代應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：.(1)細(xì)胞生長(zhǎng)密度不高時(shí)，不能急于傳代。.(2)原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞需控制消化時(shí)間。.(3)吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機(jī)械損傷。.(4)首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些。.(5)首次傳代培養(yǎng)的pH應(yīng)偏低些。小牛血清濃度可加大至15%20%左右三、傳代細(xì)胞的傳代培養(yǎng).傳代細(xì)胞，可根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法進(jìn)行細(xì)胞傳代。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用消化法傳代，部分貼壁的細(xì)胞用直接吹打或用硅膠軟刮的刮除法傳代。懸浮細(xì)胞可采用加入等量新鮮培養(yǎng)基后直接吹打分散進(jìn)行傳代，或用自然沉降法加入新培養(yǎng)基后再吹打分散進(jìn)行傳代

14、。貼壁細(xì)胞的消化傳代步驟.(1)吸除或倒掉原瓶中的舊培養(yǎng)基（以25mL培養(yǎng)瓶為例）。.(2)每瓶加入2mL，無鈣、鎂PBS，漂洗一次后倒掉。.(3)每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液），輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，經(jīng)消化液鋪滿所有細(xì)胞表面，待細(xì)胞層略有松動(dòng)，肉眼可觀察到“薄膜”現(xiàn)象時(shí)，倒掉消化液，再繼續(xù)作用23分鐘，輕輕搖動(dòng)，細(xì)胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來，在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮變圓，細(xì)胞間隙增大，此時(shí)應(yīng)立即終止消化。.(4)加入完全培養(yǎng)基5mL，用吸管反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，吹打時(shí)要按順序進(jìn)行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，不要用力過大，盡可能

15、不要出現(xiàn)泡沫，以避免細(xì)胞的機(jī)械損傷。.(5)用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞的濃度，并用培養(yǎng)基調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)。四、傳代細(xì)胞的建系和維持.細(xì)胞系的維持通過換液傳代再換液、再傳代和細(xì)胞種子凍存來實(shí)現(xiàn)。.對(duì)每一個(gè)細(xì)胞系來說都有其自身的特點(diǎn)，要做好建系的維持必須記錄好細(xì)胞檔案,換液傳代和做好細(xì)胞系（或株）的鑒定和管理工作。第四節(jié)原代細(xì)胞的純化和克隆.體外培養(yǎng)的細(xì)胞絕大多數(shù)都呈混合生長(zhǎng)，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性、一致性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，要求采用單一種類細(xì)胞來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因而培養(yǎng)細(xì)胞的純化就成為實(shí)驗(yàn)研究的重要一步。一、細(xì)胞的純化.細(xì)胞的純化分為(一)自然純化：長(zhǎng)期傳代過程中靠自然淘汰法，不斷排擠其他

16、生長(zhǎng)慢的細(xì)胞，最后留下生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)旺的細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。如腫瘤突變細(xì)胞通過此方法建立細(xì)胞系。(二)人工純化：利用人為手段造成某一細(xì)胞生長(zhǎng)有利的環(huán)境條件，抑制其他細(xì)胞的生長(zhǎng)從而達(dá)到純化細(xì)胞的目的。主要有以下5種方法。.1細(xì)胞因子依賴純化法：通過加入某些特殊的細(xì)胞因子而純化出只依賴于這種細(xì)胞因子生長(zhǎng)的細(xì)胞系。.2酶消化法：利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同，使兩者分開，達(dá)到純化的目的。另外對(duì)貼壁細(xì)胞與半貼壁及粘附細(xì)胞間的分離純化也是十分有效的。例1 .，例2.（1）上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的分離純化.兩者在胰蛋白酶的作用下，由于成纖維細(xì)胞先脫壁，而上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間才脫壁，特別

17、是在原代細(xì)胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯，故可采用多次差別消化方法將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開，（2）骨髓基質(zhì)肌樣細(xì)胞的純化.在血液細(xì)胞和骨髓細(xì)胞靜置培養(yǎng)時(shí)，常有許多肌樣細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，但也有許多淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞粘附其上，種類混雜，鑒于粘附細(xì)胞貼壁不牢固，也可用酶消化法使粘附細(xì)胞脫壁分離，以達(dá)到骨髓基質(zhì)細(xì)胞或血液中肌樣細(xì)胞與淋巴細(xì)胞分開和純化的目的。3機(jī)械刮除法.原代培養(yǎng)時(shí),如果上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為分區(qū)成片混雜生長(zhǎng)，每種細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長(zhǎng)在瓶壁上?？刹捎脵C(jī)械的方法去除不需要的細(xì)胞區(qū)域而保留需要的細(xì)胞區(qū)域，4反復(fù)貼壁法.成纖維細(xì)胞其貼壁過程快，能在短

18、時(shí)間內(nèi)完成附著過程，而上皮細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，利用此差別可以純化細(xì)胞。5電烙篩選法.在貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)，在培養(yǎng)瓶的細(xì)胞層中會(huì)出現(xiàn)分散的轉(zhuǎn)化灶，細(xì)胞密集、排列規(guī)則，有明顯生長(zhǎng)趨勢(shì)，與周邊未能轉(zhuǎn)化的細(xì)胞有明顯的區(qū)域界限，可用機(jī)械刮除法去除或用電烙篩選法燙死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞而保留轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞。二、細(xì)胞的克隆化.細(xì)胞克隆技術(shù)又稱單個(gè)細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)，即從細(xì)胞群體中分離出一個(gè)細(xì)胞，并使其在體外培養(yǎng)體系中能繁殖成新的細(xì)胞群體，這種由單個(gè)細(xì)胞所形成的細(xì)胞群（或集落）稱為一個(gè)克隆，這種純化后的細(xì)胞群體稱為細(xì)胞株。主要的克隆方法有5種.（一）毛細(xì)管克隆法.（二）有限稀釋克隆法.（三）平皿克

19、隆分離法.（四）軟瓊脂克隆分離法.（五）單細(xì)胞顯微克隆法毛細(xì)管克隆法：.（1）將一定量的細(xì)胞懸液（如105/mL或更低）稀釋至1個(gè)細(xì)胞/mL；.（2）取10mL稀釋的細(xì)胞懸液，用直徑為0.5mm，長(zhǎng)為8mm的毛細(xì)玻璃管若干（3050只），在負(fù)壓作用下，使懸液吸入各毛細(xì)管中；.（3）在倒鏡下檢查出每管只進(jìn)入一個(gè)細(xì)胞的毛細(xì)管，然后放入適應(yīng)性培養(yǎng)基或有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶（或培養(yǎng)板）內(nèi)；.（4）在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，由一個(gè)細(xì)胞在毛細(xì)管繁殖后，并向管外擴(kuò)展，并形成單個(gè)克隆的細(xì)胞群體。有限稀釋克隆法：.(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成懸液(貼壁細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成)，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，測(cè)

20、定活細(xì)胞數(shù)及濃度（細(xì)胞存活率及單個(gè)細(xì)胞百分率應(yīng)高于90%以上）。.（2）將細(xì)胞懸液在試管中稀釋，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至50個(gè)細(xì)胞/mL、10個(gè)細(xì)胞/mL、5個(gè)細(xì)胞/mL，將3種稀釋度的細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔為0.1mL，于375%CO2下培養(yǎng)。.（3）次日在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)板各孔中的細(xì)胞數(shù)，挑選只含一個(gè)細(xì)胞的孔，做好標(biāo)記并補(bǔ)加0.1mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。.（4）培養(yǎng)期間，視pH值的變化決定是否換液或補(bǔ)加培養(yǎng)液，一周左右，孔中有明顯克隆出現(xiàn)。.（5）待克隆長(zhǎng)至孔底面的1/31/2時(shí)，可用消化法將96孔中的單一克隆的細(xì)胞分別移至24孔板中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。平皿克隆分離法：.(1)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)

21、胞制備單個(gè)細(xì)胞懸液（懸浮細(xì)胞用吸管吹打分散，貼壁細(xì)胞先用0.25%胰蛋白酶消化后，再用培養(yǎng)基吹打分散）計(jì)數(shù)并用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，使5mL培養(yǎng)液內(nèi)含有50200個(gè)細(xì)胞（細(xì)胞存活率及單個(gè)細(xì)胞百分率應(yīng)大于90%以上）。.(2)將上述細(xì)胞懸液迅速移入60mm平皿中，在375% CO2下培養(yǎng)1周或更長(zhǎng)。若有明顯的克隆形成時(shí)方可進(jìn)行克隆分離，方法有兩種：.套環(huán)法：在倒置顯微鏡下觀察克隆形成的情況，標(biāo)記單個(gè)克隆周邊，吸干培養(yǎng)基，用涂有少量無菌硅脂的無菌金屬套環(huán)，套住標(biāo)記的克隆，在套環(huán)內(nèi)滴加少量0.25%胰蛋白酶，待細(xì)胞脫離時(shí)，用注射器針頭輕輕吹打分散后，轉(zhuǎn)入小平皿或24孔板或6孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。.玻片法：在

22、接種細(xì)胞懸液前，預(yù)先在60mm平皿中放入無菌小玻片，加入細(xì)胞懸液，培養(yǎng)一定時(shí)間后，在倒置顯微鏡下標(biāo)記上含一個(gè)克隆的玻片，然后用無菌鑷子取出標(biāo)記玻片轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。軟瓊脂克隆分離法：.(1)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單個(gè)細(xì)胞懸液?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞)作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1106細(xì)胞/L，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求再作梯倍稀釋。通常以15104個(gè)細(xì)胞/L為佳。.(2)制備底層瓊脂取5%瓊脂置沸水中，使瓊脂完全溶化，取出一份5%瓊脂，移入小燒杯中，待冷至50，迅速加入9份預(yù)溫37的新鮮培養(yǎng)液（即成為0.5%瓊脂），混勻后立即注入24孔培養(yǎng)板中，每孔含0.5% 瓊脂0.8mL，置室溫使瓊脂凝固備用（此層也可

23、以省略）。.(3)制備上層瓊脂取37保溫的、不同濃度的細(xì)胞懸液9.4mL，移入小燒杯中，加入505% 瓊脂0.6mL迅速混勻，即配成0.3%瓊脂培養(yǎng)基，立即澆入鋪有底層瓊脂的24孔培養(yǎng)板中，每孔0.8ml，置室溫使瓊脂凝固。.(4)于375% CO2下培養(yǎng)12周或更長(zhǎng)，若需培養(yǎng)更長(zhǎng)時(shí)間可補(bǔ)加0.8mL/孔含瓊脂的培養(yǎng)液，待有明顯集落形成為止。.(5)集落（克?。┯?jì)數(shù)在倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)直徑大于75m或含有50個(gè)細(xì)胞以上的克隆。生成克隆數(shù)集落(克隆)形成率(%)= 100%每皿接種細(xì)胞數(shù) 單個(gè)細(xì)胞的數(shù)目單個(gè)細(xì)胞百分率(%) = 100%單個(gè)細(xì)胞數(shù)目+2個(gè)以上細(xì)胞群數(shù)目單細(xì)胞顯微克隆法：.是借

24、助顯微操縱器，在顯微鏡監(jiān)控下將單個(gè)細(xì)胞逐個(gè)吸出，移入含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)克隆的方法。.（1）飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備：.用0.25%胰蛋白酶消化單層貼壁生長(zhǎng)的3T3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為108細(xì)胞/L，在96孔板中每孔加入0.1mL細(xì)胞懸液于375% CO2中培養(yǎng)至單層。.將已形成單層的3T3細(xì)胞板，用60Co 線以40006000拉得輻射或在培養(yǎng)液中加入絲裂霉素（終濃度為10-6mol/L）作用16h。其目的是使細(xì)胞有絲分裂能力喪失，但仍可短期存活，有代謝功能，不僅可維持pH而且還可為克隆細(xì)胞提供必要的養(yǎng)分及刺激生長(zhǎng)的因子。.(2)制備單個(gè)細(xì)胞懸液方法同上。.(3)分離單個(gè)細(xì)胞方法多樣，如

25、：.毛細(xì)管吸入法同上述毛細(xì)管法，在顯微鏡下將只有一個(gè)細(xì)胞的毛細(xì)管取出。.微滴法將經(jīng)稀釋至103個(gè)細(xì)胞/L的單個(gè)細(xì)胞懸液，用無菌的1mL注射器逐滴加在平皿中制成散滴，在顯微鏡下挑選出單個(gè)細(xì)胞的液滴，再用毛細(xì)管取出單個(gè)細(xì)胞懸滴。.液體石蠟法將經(jīng)稀釋至103個(gè)細(xì)胞/L的單個(gè)細(xì)胞懸液，用無菌的1mL注射器逐滴加入充滿無菌液體石蠟的平皿底部，在倒置顯微鏡下挑選只有一個(gè)細(xì)胞液滴，仔細(xì)用毛細(xì)吸管取出有一個(gè)細(xì)胞的液滴。.玻璃小球附著法將稀釋至103個(gè)細(xì)胞/L的細(xì)胞懸液加入表面涂有無菌凡士林石蠟的小玻璃珠的平皿中，混勻后，在倒置顯微鏡下挑選玻璃珠表面只粘附一個(gè)細(xì)胞的玻珠，仔細(xì)用鑷子取出。.(4)將采用上述方法分

26、離出的單個(gè)細(xì)胞，放入預(yù)先制備飼養(yǎng)層細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，于375% CO2下培養(yǎng)12周或更長(zhǎng)。.(5)待細(xì)胞克隆明顯，并使孔底覆蓋1/31/2時(shí)，即可將細(xì)胞轉(zhuǎn)種于24孔板進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)（貼壁細(xì)胞仍需用0.25%胰酶消化法取出轉(zhuǎn)種）。人或動(dòng)物體內(nèi)(或胚胎組織)由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個(gè)細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長(zhǎng)繁殖，即使采用1mm3的組織塊，也只有少量處于周邊的細(xì)胞可能生存和生長(zhǎng)，若需獲取大量細(xì)胞，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開，使細(xì)胞解離出來，常采用的方法如下：一、懸浮細(xì)胞的分離方法組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最簡(jiǎn)單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘，若懸液量大，可

27、適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間，但速度不能太高，延時(shí)也不能太長(zhǎng)，以避免擠壓或機(jī)械損傷細(xì)胞，離心沉淀用無鈣、鎂PBS洗兩次，用培養(yǎng)基洗一次后，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)，若選用懸液中某些細(xì)胞，常采用離心后的細(xì)胞分層液，因?yàn)椋?jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。不同比重的分層液的配制和具體分離方法詳見淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)的章節(jié)。二、實(shí)體組織材料的分離方法對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法(物理裂解)和消化分離法。(一)機(jī)械分散法所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織

28、細(xì)胞或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)(用九號(hào)針)，使細(xì)胞通過針頭壓出，或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠(常用注射器鈍端)使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此法分離細(xì)胞雖然簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織。(二)消化分離法組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊(或糊狀)，應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)。1、酶消化分離法酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠

29、原酶，其分離方法如下：(1) 胰蛋白酶分散技術(shù)胰蛋白酶(簡(jiǎn)稱胰酶)是廣泛應(yīng)用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品，對(duì)蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開，在常用的蛋白酶中由于產(chǎn)品的活力和純度不同，對(duì)細(xì)胞的消化能力也不同，胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的作用，取決于細(xì)胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無機(jī)鹽離子、pH以及消化時(shí)間的長(zhǎng)短等。細(xì)胞類型 胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對(duì)含結(jié)締組織較豐富的組織，如 乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等就無效，但若與膠原酶合用，就能增加其對(duì)組織

30、的分離作用。酶的活力 市售的胰蛋白酶，其活力都經(jīng)過測(cè)定而有效，但配制時(shí)必須新鮮，需保存在低溫冰箱中，消化時(shí)的pH和溫度都要適宜，否則會(huì)影響活力，細(xì)胞的分散直接與酶的活力有關(guān)，最終使用活力為1:200或1:250,56pH8.0時(shí)活力最強(qiáng)。該酶為粉劑，保藏時(shí)要防潮，室內(nèi)溫度不宜過高，保存時(shí)間不能太長(zhǎng)，若粉劑結(jié)團(tuán)塊，說明該部分受潮或失效。酶的濃度 胰蛋白酶一般采用的濃度為0.1%-0.25%(活力1:200或1:250)，但遇到難消化的組織時(shí)，濃度可適當(dāng)提高，消化時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)。濃度高對(duì)細(xì)胞有毒性，而較低濃度的胰蛋白酶在培養(yǎng)液中可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，若培養(yǎng)液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶

31、因子所清除。溫度 一般認(rèn)為胰蛋白酶在56時(shí)活性最強(qiáng)，但由于對(duì)細(xì)胞有損害而不能被采用，常使用的溫度為37，通常在37進(jìn)行消化比室溫作用快。pH pH8pH9是胰蛋白酶活力適宜范圍，但隨堿性的增加其活力也隨之減少，活性強(qiáng)分散快，細(xì)胞也容易被消化下來，消化分離細(xì)胞時(shí)PH只能選用7.68.0之間，否則對(duì)細(xì)胞有損傷。無機(jī)鹽離子 若用含有鈣和鎂的鹽類溶液來配制胰蛋白酶時(shí)，可以發(fā)生抑制胰蛋白的消化作用。因此，在配制時(shí)應(yīng)采用無鈣鎂離子的PBS配制。消化時(shí)間 如果細(xì)胞消化時(shí)間過長(zhǎng)，可以損害細(xì)胞的呼吸酶，從而影響細(xì)胞的代謝，一般消化時(shí)間為20分鐘為宜，冷消化時(shí)使用低濃度消化液，于4過夜也可。分離方法如下：過夜冷消

32、化 將取得的組織用Hanks液洗三次，剪成碎塊大小為4毫米左右，用Hanks液洗23次以除去血球和脂肪組織，再加入0.25%的胰蛋白酶，搖勻后放4過夜，次日再用Hanks液洗滌，棄去上清，共洗23次，然后，加入少量營(yíng)養(yǎng)液吹打分散，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按適當(dāng)?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。多次提取消化法 多次提取消化法有以下三種：熱消化多次提取-將剪碎的細(xì)胞塊加入0.25%胰蛋白酶37水浴中消化1520分鐘，然后經(jīng)洗滌后用營(yíng)養(yǎng)液分散制成細(xì)胞懸液，按合適的濃度分瓶培養(yǎng)，然后將留下的未徹底消化的組織按上述方法操作，再消化提取細(xì)胞。冷消化多次提取-方法同上，只是消化溫度為4。先熱消化后冷消化-將組織塊先用胰蛋白酶于37下消化2

33、0分鐘經(jīng)洗滌后用營(yíng)養(yǎng)液分散，制成懸液，剩余未消化的小組織塊經(jīng)洗滌后用胰酶于4下過夜，次日再提取細(xì)胞，分散成懸液，分瓶培養(yǎng)。(2) 膠原酶(Collagenase)消化法膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來的酶，對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用，對(duì)細(xì)胞本身影響不大，可使細(xì)胞與膠原成分脫離而不受傷害。該酶分離效果好，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制，即操作簡(jiǎn)便又可提高細(xì)胞成活率，最終濃度200u/mL或0.10.3mg/mL.此酶消化作用緩和，無需機(jī)械振蕩，但膠原酶價(jià)格較高，大量使用將增加實(shí)驗(yàn)成本。經(jīng)過膠原酶消化后的上皮組織，由于上皮細(xì)胞對(duì)酶有耐受性，可能有一些上皮細(xì)胞團(tuán)塊尚未被完全消化開。成小團(tuán)塊的上皮細(xì)胞比分散的單個(gè)上皮細(xì)胞更易生長(zhǎng)，因此不必要再進(jìn)一步消化處理。鑒于胰蛋白酶和膠原酶的生物學(xué)活性(見表4-1)和在不同濃度下消化各種組織小塊所需的時(shí)間(小時(shí))有差異(見表4-2)，以及兩者價(jià)格不等，有人采用膠原酶與胰蛋白酶并用，同時(shí)還可加透明質(zhì)酸酶(對(duì)細(xì)胞表面糖基有作用)，采用兩者的聯(lián)合消化作用，對(duì)分散大鼠和兔肝、癌