心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白膠體金檢測試紙條的制備和初步應(yīng)用.docx

1、,論著.心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白膠體金檢測試紙條的制備和初步應(yīng)用彭林峰，羅廣，席仲興，袁皓加，張正雷，潘憲云，路東，金紅燕，陳國懷(蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司甘市省疫苗工程技術(shù)研究中心，蘭州730046)摘要：目的應(yīng)用膠體金免疫層析法制備檢測全血或血清樣本中心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)的檢測試紙條，用于急性心肌梗塞(AMI)的早期輔助診斷。方法采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，標(biāo)記鼠抗心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體，噴于玻璃纖維膜上制成膠體金結(jié)合物墊，將另一株鼠抗心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體和抗鼠二抗分別包被檢測線和質(zhì)控線，組裝成試紙條進行靈敏性、特異性、精密性、穩(wěn)定性及臨床樣品檢測。

2、結(jié)果該試紙條的檢測靈敏度為10ng/mL,15min內(nèi)可判定結(jié)果；與肌鈣蛋白I、C反應(yīng)蛋白、肌酸激酶、人心肌肌紅蛋白無交叉反應(yīng)。檢測240份臨床標(biāo)本，與臨床診斷結(jié)果進行配對分析，陽性符合率95.83%、陰性符合率100%、總符合率97.92%。結(jié)論制備的H-FABP檢測試紙條有良好的靈敏性、特異性，可用于早期AMI的輔助診斷、關(guān)鍵詞:心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP);急性心肌梗塞(AMI)；膠體金免疫層析中圖分類號：R392-33文獻標(biāo)志碼：A文章編號：10055673(2013)06-0035-05Preparationandpreliminaryuseofagoldimmuno-chr

3、omatographyassaytodetecttheH-FABPPENGLin-feng,LUOGuang,XIZhong-xing,YUANHao-jia,ZHANGZheng-lei,PANXian-yun,LUDong,JINHong-yan,CHENGuo-huai(LcuizhouInsliluteofBiologicalProductsCo.,Ltd.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Ijanzhou730046,China)Abstract：ObjectiveTodevelopthedetectionkito

4、fhumanheart-typefattyacidbindingprotein(H-FABP)fromthewholebloodorserumsamplesusingcolloidalgoldimmunochromatographytechnology,fortheearlydiagnosisofacutemyocardialinfarction(AMI).MethodsThecolloidalgoldwasobtainedbytrisodiumcitratereductionmethod.Colloidalgoldparticleslabelledwithmonoclonalantibody

5、ofH-FABPwereusedasthedetectorreagentandcoatedonsomeglassfiberanddried.TheothermonoclonalantibodyofH-FABPandpurifiedanti-mouseIgGwereblottedonthetestlineandcontrolregionsofnitrocellulosemembrane.Thenthestripwasfinishedandthedetectionsensitivity,specificity,precision,stabilityweremeasured,andclinicals

6、amplesweredoneaswell.ResultsThedetectionsensitivityofthismethodwas10ng/mLandtheanalysisprocesscanbecompletedwithin15min.TherearenocrossreactionswithcardiactroponinI,C-reactiveproteinjhumancreatinekinaseMBandmyocardialmyoglobin.Tocomparelheagreementofpositivity/negativitybetweenclinicalsamplesandresu

7、ltswith240cases,wefoundthatthepositivecoincidencerateis95.83%andnegativecoincidencerateis100%,andthetotalcompliancerateis97.92%.ConclusionsTheteststripfortherapiddetectionofH-FABPhavebeenmadewithgoodsensitivityandspecificity,canbeusedforearlydiagnosisofAMI.Keywords：Humanheart-typefattyacidbindingpro

8、tein(H-FABP);Acutemyocardialinfarction(AMI);Colloidalgoldimmunochromatographytechnology急性心肌梗死(Acutemyocardialinfarction,收稿日期：2OI3-O7-Q5;修回日期：2013-10-10作者簡介:彭林峰(1975-)，男，醫(yī)學(xué)生物學(xué)工程師，主要從事診斷試削生產(chǎn)和研發(fā)。通信作者：席仲興,E-mail:xiyue8342181AMI)發(fā)生后迅速明確診斷、盡早治療是降低死亡率、改善預(yù)后的關(guān)鍵。AMI早期生化標(biāo)志物是診斷的必要指標(biāo)，其中的心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白(Hearttypefatty

9、acidbindingprotein,H-FABP)是心肌細胞胞漿中的小分子蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量約1500011o健康人血液中心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白含量極低，當(dāng)心肌細胞受損時，心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白可從心肌細胞迅速釋放進入血液中。近年來研究發(fā)現(xiàn)，心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白在AMI發(fā)生1.5h后出現(xiàn)在血漿中,6h達到高峰,隨后逐漸下降，到24h后恢復(fù)到正常水平。而且,H-FABP對早期AMI的診斷敏感性顯著高于cTnl（肌鈣蛋白I）和CK-MB（肌酸激酶同工酶），其診斷發(fā)病3h內(nèi)的AMI亦明顯優(yōu)于cTnl.CK-MB和MYO,表明H-FABP可作為早期急性心肌梗死更適宜的檢測指標(biāo)*句。研究制備的H-FAB

10、P檢測試紙條，為急性心肌梗塞的診斷提供一種快速、簡便的方法，有良好的臨床應(yīng)用價值。1材料和方法1.1材料1.1.1試劑、活性材料及耗材氯金酸、檸檬酸三鈉、牛血清白蛋白購自SIGMA公司；硝酸纖維素膜、聚酯膜、全血濾膜、吸水濾紙購自Millipore公司；PVC膠板購自上海金標(biāo)生物科技有限公司；H-FABP、兔抗鼠IgG多克隆抗體、抗H-FABP單克隆抗體7C8和2G4由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司診斷用品室制備并經(jīng)過鑒定C1.1.2主要儀器設(shè)備CM4000型切條系統(tǒng)、XYZ3O5O型噴點系統(tǒng)購自美國BIODOT公司,RC-6PLUS型超速離心機購自美國ThemoFisher公司，Milli-

11、QUFPLUS型超純水器購自美國Millipore公司，EF4型愛德華冷凍干燥機購自英國EdwardsHighVacuum公司，加熱磁力攪拌器購自德國IKA公司,TLM810DSPC型紫外可見分光光度計購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。1.2方法1.2.1膠體金的制備采用檸檬酸三鈉還原法制備，有研究表明"粒徑在1070nm的膠體金最大吸收峰與粒徑之間存在線性關(guān)系：丫=0.4271X+514.56（式中丫為最大吸收峰,X為膠體金粒徑）。用量筒量取500mL去離子水加至1000mL三角燒瓶中，用磁力攪拌器加熱系統(tǒng)攪拌加熱至沸騰。取1%檸檬酸三鈉溶液8.75mL加入三角燒瓶中，繼續(xù)攪拌加熱

12、煮沸，在攪拌下快速準(zhǔn)確加入1%氯金酸溶液5.0mL,繼續(xù)攪拌煮沸10min后，停止加熱。紫外可見分光光度計用去離子水校零，取3.0mL冷卻至2224龍的膠體金溶液，在波長400700nm范圍進行連續(xù)光譜掃描，測膠體金溶液的最大吸收蜂波長，由上述回歸方程計算膠體金粒徑。1.2.2膠體金最佳標(biāo)記蛋白量及最佳標(biāo)記pH的確定將抗H-FABP單抗7C8用0.01mol/LpH7.4磷酸緩沖液稀釋至5.0mg/mLo將制備好的膠體金溶液分裝11管，每管1-0mL。將待標(biāo)記抗體按110piL的量分別加入對應(yīng)的上述各管中，混勻。對照管中不加抗體。5min后，在上述各管中加入0.1mL10%NaCl溶液，混勻后

13、靜置5min,觀察結(jié)果O將制備好的膠體金溶液分裝8管，每管1.0mLc用0.1mol/L的碳酸鉀緩沖液分別調(diào)節(jié)pH至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5,加入足量單抗7C8,混勻。5min后，在上述各管中加入0.1mL10%NaCl溶液，混勻后靜置5min,觀察結(jié)果。1.2.3膠體金標(biāo)記物的制備按前述試驗確定好的最佳標(biāo)記蛋白量及最佳標(biāo)記pH進行標(biāo)記，將抗H-FABP單抗7C8逐滴加入膠體金溶液中，于28乞振蕩4h后加入牛血清白蛋白（BSA）,其終濃度為1%,繼續(xù)振蕩30min。標(biāo)記好的膠體金結(jié)合物溶液于2000r/min、28乞離心30min,棄沉淀。上清8000r/

14、min、28T離心30min后棄上清，沉淀用原體積含1%BSA的0.01mol/LpH7.4的磷酸緩沖液重懸后，8000r/min、28T離心30min后棄上清，沉淀用適量膠體金標(biāo)記物重懸液重懸，測膠體金標(biāo)記物溶液的最大吸收峰波長，然后用重懸液將膠體金標(biāo)記物稀釋至該波長處的4值為2.0。1.2.4H-FABP參考品的制備用5%牛血清溶液稀釋基因工程表達的H-FABP,含量分別為80、40、20、10、5、0ng/mL制成靈敏度參考品；用10份無傳染性疾病、無心臟病史、無腎臟病史、無糖尿病的健康人血漿制成陰性參考品;用4份臨床確診為AMI并且用ELISA定量試劑盒檢測H-FABP含量分別為50.

15、4、37.9.28.6.17.7ng/mL的血清制成陽性參考品；用5%牛血清溶液稀釋基因工程表達的H-FABP,含量為20ng/mL,制成精密性參考品。1.2.5硝酸纖維素膜的包被抗H-FABP單抗2G4及兔抗鼠IgG多克隆抗體用0.01mol/LPH7.4的磷酸緩沖液均稀釋至2.0mg/mLo稀釋好的抗體用0.22pjn的一次性濾器過濾后，用BIODOT噴點系統(tǒng)包被在硝酸纖維素膜上，包被批為1訝/cm,2224弋、相對濕度10%干燥1224ho干燥后的硝酸纖維素膜放在裝有硅膠的干燥皿中2224T保存。1.2.6H-FABP快速檢測試紙條的組裝將硝酸纖維素膜、金結(jié)合墊、濾血膜、樣品墊、吸水墊依

16、次貼在PVC膠板上，用CM4000型切條系統(tǒng)按照5mm/條的寬度進行切割后裝入塑料外殼中,裝袋,加入干燥劑封口后于230T保存?zhèn)溆谩?.2.7H-FABP檢測試紙條性能驗證特異性:將C反應(yīng)蛋白、人肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶、人心肌肌紅蛋白用5%牛血清溶液稀釋至不同濃度，各取100皿滴加到試紙條的樣品墊上，15min內(nèi)觀察結(jié)果;靈敏性：用H-FABP質(zhì)量濃度分別為80、40、20、10、5、0ng/mL的靈敏度參考品檢測試紙條，設(shè)立陰性對照和空白對照，在15min時觀察T線顏色變化，確定T線出現(xiàn)紅色條帶時的參考品濃度；穩(wěn)定性：制備的試紙條放置于3638幻，分別于第3、6、9、15、21天，用參考

17、品檢測其性能;將試紙條放置于2224T,分別于第1、4、8、12、16、20月，用參考品檢測其性能;精密性:將兩批試紙條用精密性參考品重復(fù)檢測20次，觀察在同一濃度下,每條試紙T線的顏色變化。1.2.8臨床樣本檢測陽性樣本為中國人民解放軍總醫(yī)院和中國人民解放軍第305醫(yī)院住院及門診就診的AMI患者共120例的血清,入選標(biāo)準(zhǔn)為所有患者均經(jīng)臨床表現(xiàn)、心電圖動態(tài)演變和心肌生化標(biāo)志物檢查確診。陰性樣本為中國人民解放軍總醫(yī)院和中國人民解放軍第305醫(yī)院門診健康體檢者的血清，入選標(biāo)準(zhǔn)為：血脂、血壓、血糖、肝腎功能以及心電圖均正常，排除外傷、肌肉病變、心血管疾病、糖尿病和其他內(nèi)分泌疾病共120例。應(yīng)用H-F

18、ABP快速檢測試紙條檢測120份臨床陽性樣本、120份臨床陰性樣本，與臨床診斷結(jié)果進行配對分析，計算陽性符合率、陰性符合率、總符合率。陽性符合率=4/(4+B)xl00%,陰性符合率=D/(C+D)xl00%，總符合率=(4+D)/(4+fi+C+D)xlOO%,見表1。表1試紙條檢測結(jié)果與臨床診斷結(jié)果Tab.1ConformitybetweenH-FABPkitandclinicaldiagnosisresults試紙條檢測結(jié)果合計陽性陰性陽性AB臨床診斷結(jié)果陰性CDC+D合計A+CB+D4+B+C+D結(jié)臬有渾濁或表面漂浮物，呈酒紅色。紫外可見分光光綃果度計連續(xù)掃描，制備的膠體金在524.2

19、nm出現(xiàn)最大2.1膠體金的鑒定吸收峰，其余波長無吸收峰出現(xiàn)。由K=0.4271X+制備的膠體金溶液肉眼觀察清亮透明，液體沒514.56回歸方程計算可得平均粒徑為22.57nmo波長/nm圖1膠體金400700nm吸收光譜Fig.1Visible-lightspectrum(400-700nm)ofcolloidalgold2.2膠體金最佳標(biāo)記蛋白量及最佳標(biāo)記pH未加抗體的對照管和加入抗體的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管均呈現(xiàn)出由紅變藍或灰的聚沉現(xiàn)象,而加入抗體量達到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定1.0mL膠體金溶液紅色不變的最低抗體用量為標(biāo)記抗體的最低用量。確定標(biāo)記抗體的最低用量后在進

20、行標(biāo)記時須增加20%的抗體量。因此每毫升膠體金溶液確定加入單抗7C8的最低用量為6|1L,最佳標(biāo)記鼠為每毫升膠體金溶液需加入36jig抗體。觀察不同pH膠體金溶液標(biāo)記前后的顏色變化，pH為6.0.6.5、7.0的膠體金溶液在標(biāo)記后呈現(xiàn)出由紅變藍或灰的聚沉現(xiàn)象，pH在7.5以上的膠體金溶液，其顏色在標(biāo)記前后無顯著變化。因此,確定pH為7.5為單抗7C8的最佳標(biāo)記pH。2.3H-FABP快速檢測試紙條的性能驗證2.3.1特異性將50瞄/mL的C反應(yīng)蛋白、10jig/mL的人肌鈣蛋白I、5jig/mL的肌酸激酶同工酶、15必/mL的人心肌肌紅蛋白各取100滴加到試紙條的樣品墊上,15min內(nèi)觀察，結(jié)

21、果均為陰性，均無交叉反應(yīng)。2.3.2靈敏性H-FABP質(zhì)量濃度分別為80、40.20ng/mL的參考品在T線均出現(xiàn)明顯紅色條帶，10ng/mL的參考品在T線出現(xiàn)隱約可見的紅色條帶，判定為陽性。5ng/mL的參考品、陰性對照在T線均未出現(xiàn)紅色條帶。因此，試紙條的最低檢測靈敏度為10ng/mL。2.3.3穩(wěn)定性制備的試紙條放置于3638分別于第3、6、9、15、21天用參考品檢測，結(jié)果符合參考品要求;將試紙條放置于22-24X,分別于第1、4、8、12、16、20月用參考品檢測，結(jié)果符合參考品要求。因此，試紙條在3638Y及2224P條件下，性能穩(wěn)定。2.3.4精密性兩批試紙條用精密性參考品重復(fù)檢

22、測，每條試紙T線顏色無明顯變化，試紙條批問、批內(nèi)精密性良好。2.4臨床樣本檢測應(yīng)用H-FABP快速檢測試紙條檢測120份臨床陽性樣本、120份臨床陰性樣本，檢測結(jié)果與臨床診斷結(jié)果進行配對分析,陽性符合率95.83%,陰性符合率100%、總符合率97.92%（表2）°表2試紙條檢測結(jié)果與臨床診斷結(jié)果Tab.2ConformitybetweenH-FABPkitandclinicaldiagnosisresults試紙條檢測結(jié)果合計陽性陰性臨床診斷結(jié)果陽性陰性11505120120120合計1151252403討論急性心肌梗死發(fā)病后03h是治療的黃金時間。因此，通過病史、查體、心電圖和心

23、肌損傷標(biāo)志物的檢測快速識別出早期急性心肌梗死（發(fā)病時間6h內(nèi)）患者并及時治療是提高其存活率、改善預(yù)后的關(guān)鍵。臨床常用的心肌損傷標(biāo)志物有cTnI、CK-MB,它們在AMI癥狀出現(xiàn)46h才開始升高，診斷窗口常存在于AMI的中晚期，適用于回顧性診斷不適用于早期對AMI的輔助診斷：購。研究結(jié)果顯示,H-FABP在胸痛發(fā)作后12h內(nèi)對AMI診斷均有較好的敏感性（86%97%）.特別是對胸痛03h病人診斷敏感性為86%,特異性為76%,SROC曲線下而積為0.8892,H-FABP在胸痛發(fā)作后06h患者有最好的診斷效能SROC（AUC=0.915）,而這正是胸痛患者入院就診的關(guān)鍵時間窗。因此，無論是在敏感

24、性和特異性上，還是在時效性上，HFABP都具有綜合優(yōu)勢,可作為AMI早期篩查比較敏感且特異的指標(biāo),尤其是臨床對AMI發(fā)生3h之內(nèi)的早期患者的診斷更具有實用價值.目前，國內(nèi)外檢測H-FABP的方法有：雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法、時間分辨免疫熒光測定法、光柵耦合傳感器技術(shù)、微粒增強免疫濁度測定法、免疫傳感器測定法等，這些方法雖然可以定量檢測，但檢測時限K操作復(fù)雜,且需要專業(yè)的檢測設(shè)備和專業(yè)的工作人員，不能檢測單份樣本,不適宜床邊或急診室的快速檢測。研究制備的人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白（H.FABP）快速定性檢測試紙條，采用雙抗體夾心固相免疫膠體金層析法定性檢測人血清、血漿或全血中的H-FABP。檢測時，樣本

25、中的H-FABP先與膠體金標(biāo)記的抗H-FABP單克隆抗體7C8結(jié)合成復(fù)合物，該復(fù)合物隨著硝酸纖維素膜的毛細管作用遷移至檢測區(qū)（T線），與包被在檢測區(qū)的抗H-FABP單克隆抗體2G4結(jié)合.如果待測樣本中的H-FABP質(zhì)量濃度大于10ng/mL,則出現(xiàn)一條色帶，而且樣本中H-FABP的濃度越高，檢測線區(qū)出現(xiàn)色帶的時間越短、顯色越深。不論待測樣本中是否存在H.FABP,當(dāng)液面繼續(xù)遷移至包被兔抗鼠IgC抗體的質(zhì)控區(qū)（C線）時，在該區(qū)出現(xiàn)另一條色帶。該試紙條操作簡便（不需儀器設(shè)備、僅用肉眼即可判讀結(jié)果），適合在任何場所檢測（采用手指血檢測，病人無須做任何其他處理，僅備一個指尖采血針即可在家里、醫(yī)院的急診

26、室及床邊進行檢測），快速（檢測全過程僅需15min）,-步完成（用指尖采血針采手指血點樣后等待15min肉眼看結(jié)果即完成檢測）。由于臨床樣本中可能含有膽固隔、甘油三酯、edta、肝素鈉等物質(zhì),檢測這些樣本時T線均未顯色,C線顯色明顯，未對檢測結(jié)果造成影響.檢測含有血紅蛋白的樣本時，硝酸纖維素膜背景變紅，無法觀察結(jié)果。因此，發(fā)生溶血的樣本不能用于檢測。通過對試紙條的性能驗證，結(jié)果表明試紙條有良好的敏感性、特異性、穩(wěn)定性，可用于早期AMI的輔助診斷。試紙條的不足之處是不能定量，限制了在評估心肌梗死面積及動態(tài)觀察進行性心肌梗死方面的應(yīng)用。參考文獻1Pe&rsMM,HermensWT,Glat

27、zJF,etal.Fattyacid-bindingproteinsasplasmamarkersoftissueinjuryJ.ClinChimActa,2005,352(1/2):15-35.2AlhadiHA.FoxKA.Doweneedadditionalmarkersofmyocytenecrosis:thepotentialvalueofheaitfattyacid-bindingproteinJ.QJM,2004,97(4)：187-198.3NakataT,HashimotoA,HaseM9eta).Humanheart-tjpefattyacid-bindingproteinasanearlydiagnosticandprognosticmarkerinacutecoronarysyndromeJ.Cardiology,2003,99(2):96-104.4SeinoY,TomitaY,TakanoT.etal.Officecardiologistscooperativesludyonwholebloodrapidpaneltestsinpatientswithsuspiciousacutemyocardialin