兩種細(xì)胞系用于建立體外脂肪肝模型的比較

1、兩種細(xì)胞系用于建立體外脂肪肝模型的比較                                作者：潘雪豐，溫彩霞，許建華【摘要】  目的 對(duì)比油酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株HepG2、正常肝細(xì)胞株L02建立的肝細(xì)胞脂肪變性模型,通過檢驗(yàn)復(fù)方蛋氨酸膽堿的防治作用，尋找簡(jiǎn)便、穩(wěn)定的體外

2、藥物篩選模型。方法 設(shè)正常組、HepG2模型組、HepG2不同濃度給藥組、L02模型組、L02不同濃度給藥組、用油酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變,復(fù)方蛋氨酸膽堿干預(yù)，以油紅O染色鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴形成狀況,并檢測(cè)細(xì)胞上清中的ALT、AST、GT水平。結(jié)果 油酸刺激HepG2、L02 肝細(xì)胞24 h,細(xì)胞內(nèi)典型脂肪滴形成。復(fù)方蛋氨酸膽堿2次給藥，藥物難以使HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴減少，L02細(xì)胞在加油酸48 h后油紅O 染色證明細(xì)胞內(nèi)脂滴可減少，脂滴表達(dá)的紅色I(xiàn)OD值，各給藥組與模型組比較，差異有極顯著性(P<0.01)。細(xì)胞上清液中ALT、AST、GT，復(fù)方蛋氨酸膽堿各組與模型組比較差異有顯著性，證實(shí)其

3、對(duì)肝細(xì)胞損傷較小。結(jié)論 L02比HepG2更適合作為體外的篩藥細(xì)胞模型，油酸刺激L02細(xì)胞形成脂肪變，藥物提前24 h干預(yù)，24 h后再給藥1次，這種造模和給藥方案可作為一種可行的脂肪肝細(xì)胞篩藥模型使用。 【關(guān)鍵詞】  肝癌細(xì)胞株HepG2;L02肝細(xì)胞株;油酸;脂肪肝;模型;體外;復(fù)方蛋氨酸膽堿Abstract:Objective To compare two models of hepatocytic steatosis in vitro，which were established by treating hepatocarcinoma cell HepG2 and human

4、 liver cell L02 with oleic acid in vitro. Through examination the role of compound methionine and choline bitartrate,to find a convenient and stable model in vitro for drug screening.Methods Normal group,HepG2 model group,groups of HepG2 cells treated with compound methionine and choline bitartrate

5、at different concentrations,L02 model group,and model groups of L02 cells treated with drug at different concentratrions were set up. The hepatocytic steatosis models were established by treating HepG2 and L02 with oleic acid in vitro. The fatty droplets in cells could be observed by oil red O stain

6、ing under light microscope. ALT,AST,and GT in cell supernatant were detected by reactant kits.Results After treated with oleic acid for 24 hours,the fatty droplets in cells were observed by oil red O staining under light microscope. With the prevention with compound methionine and choline bitartrate

7、,the amount of lipid droplet in HepG2 cells did not decrease,but decreased in L02 cells after treated with oleic acid for 48 hours. Compared with the model group,the integral optical density (IOD) value of positive of red fatty droplets in the group treated with drugs decreased markedly (P<0.01).

8、 There were significant differences in ALT, AST, and GT in cell supernatant in the groups treated withcompound methionine and choline bitartrate and model groups,indicating that the damage to hepatocyte L02 was small.Conclusion L02 cell line was more suitable in the developing of in vitro model of h

9、epatocytic steatosis,the model with oleic oilinduced steatosis,intervened with compound methionine and choline bitartrate for 24 hours,and treated with oleic acid 24 hours later,the method could be used to develop an in vitro model of hepatocytic steatosis model for drug screen.Key words:hepatocarci

10、noma cell HepG2; human liver cell L02; oleic acid; fatty liver; model; in vitro; compound methionine and choline bitartrate近年來,非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的發(fā)病率不斷上升,由于它是肝硬化、肝癌的重要病因1,2,已成為肝病領(lǐng)域的新挑戰(zhàn)。目前對(duì)脂肪肝的研究主要采用的是動(dòng)物模型，存在個(gè)體差異較大、實(shí)驗(yàn)條件不好控制、周期較長(zhǎng)、材料耗費(fèi)較多等缺點(diǎn)。而細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)卻可以很好地克服上述缺點(diǎn)，不僅能針對(duì)性地探究細(xì)胞水平的脂肪肝發(fā)病機(jī)制，并且能有效地縮短篩選藥物的進(jìn)程，有助于篩選大

11、量的藥物。由于脂肪肝篩藥細(xì)胞模型報(bào)道較少，本研究擬采用油酸作用于在體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞HepG23和人正常肝細(xì)胞(L02細(xì)胞株)4的方式，建立脂肪肝的體外模型，結(jié)合油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂肪滴變化情況，來驗(yàn)證該肝細(xì)胞是否產(chǎn)生脂肪變性，并觀察復(fù)方蛋氨酸膽堿的防治作用，以期尋找簡(jiǎn)便、穩(wěn)定的體外藥物篩選模型。1 材料與方法1.1 材料人正常肝細(xì)胞(L02株)由中科院上海細(xì)胞研究所提供;人肝癌細(xì)胞株HepG2由福建醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所提供。復(fù)方蛋氨酸膽堿片(主要成分：蛋氨酸0.1 g、重酒石酸膽堿0.1 g、維生素B1 2 mg、維生素B2 2 mg、維生素B6 2 mg、泛酸鈣3 mg、煙酰胺6 mg

12、等)，通化東寶藥業(yè)股份有限公司。油酸，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;RPMI1640培養(yǎng)基，美國(guó)GIBCO公司;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司;小牛血清，美國(guó)GIBCO公司;胰蛋白酶，美國(guó) Hyclone 公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT),上海華舜生物工程公司;油紅O，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GT)試劑盒均購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司。A/B3 1285型超凈工作臺(tái)，美國(guó)Forma公司;371型直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)Forma公司;550 型酶標(biāo)儀，美國(guó)BioRad公司;SD811L半自

13、動(dòng)生化儀，上海迅達(dá)醫(yī)療儀器廠。1.2 方法抑制率IR(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/空白對(duì)照組平均A值)×100%2 結(jié)果2.1 DMSO、復(fù)方蛋氨酸膽堿對(duì)HepG2、L02細(xì)胞增殖的影響DMSO 體積分?jǐn)?shù)0. 4%時(shí)對(duì)作用了48 h的HepG2、L02細(xì)胞增殖無明顯影響(表1)，可作為溶劑使用。復(fù)方蛋氨酸膽堿200、300、400 g·mL-1組作用于HepG2、L02 48 h后對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)無明顯影響(表2)。表1 不同濃度的DMSO對(duì)HepG2、L02細(xì)胞生長(zhǎng)的影響1         2.2

14、 油酸作用濃度的確定HepG2細(xì)胞組，油酸刺激24 h后，20、40 g·mL-1胞漿內(nèi)有少量被染成桔紅色或紅色的顆粒狀脂滴，分布在靠近細(xì)胞膜的區(qū)域，使整個(gè)細(xì)胞的形態(tài)表2 不同濃度的復(fù)方蛋氨酸膽堿對(duì)HepG2、L02細(xì)胞生長(zhǎng)的影響呈現(xiàn)出“印戒”狀，隨著濃度的遞增，細(xì)胞內(nèi)的紅色脂滴數(shù)量逐漸增多。80 g·mL-1細(xì)胞內(nèi)的紅色脂滴較明顯，120 g·mL-1存在活細(xì)胞數(shù)減少明顯，且在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞邊緣不清晰，細(xì)胞內(nèi)顆粒較多，細(xì)胞大量浮起和壞死。48 h后各組細(xì)胞內(nèi)的紅色脂滴開始減少。故選擇80 g·mL-1，2448 h作為HepG2脂肪肝體外模型的刺激

15、濃度和觀察時(shí)間。L02細(xì)胞空白組可見少量紅色的脂滴。油酸刺激24 h后，20、40 g·mL-1細(xì)胞內(nèi)可見少量染成紅色的脂滴，隨著濃度的遞增，細(xì)胞內(nèi)的紅色脂滴數(shù)量逐漸增多。60 g·mL-1細(xì)胞內(nèi)的紅色脂滴較明顯，100 g·mL-1存在活細(xì)胞數(shù)減少明顯，且在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞邊緣不清晰，細(xì)胞內(nèi)顆粒較多，細(xì)胞大量浮起和壞死。72 h后各組細(xì)胞內(nèi)的紅色脂滴開始減少。故選擇60 g·mL-1，2472 h作為L(zhǎng)02脂肪肝體外模型的刺激濃度和觀察時(shí)間。2.3 復(fù)方蛋氨酸膽堿對(duì)脂肪肝細(xì)胞模型的影響以80 g·mL-1油酸作為HepG2脂肪肝體外模型的刺

16、激濃度，24、48 h，見HepG2細(xì)胞脂肪肝變性，見圖1。復(fù)方蛋氨酸膽堿200、300、400 g·mL-1，24、48 h，均未見細(xì)胞內(nèi)的脂滴明顯減少。以60 g·mL-1油酸作為L(zhǎng)02脂肪肝體外模型的刺激濃度，24 h，復(fù)方蛋氨酸膽堿200、300、400 g·mL-1均未見明顯的脂滴減少， 48 h復(fù)方蛋氨酸膽堿各組脂滴有不同程度減少，見圖2。2.4 L02細(xì)胞脂滴表達(dá)的油紅O染色圖片采用ImagePro Plus 6.0 圖像分析軟件，分析油酸刺激48 h對(duì)L02細(xì)胞內(nèi)脂滴的影響。每組隨機(jī)選取3個(gè)具有代表性的高倍視野，脂滴表達(dá)的紅色I(xiàn)OD值，各給藥組與模

17、型組比較，脂滴減少，差異有極顯著性(P<0.01),見圖3。2.5 細(xì)胞培養(yǎng)液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、AST天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GT) 的活性變化通過檢測(cè)細(xì)胞上清液中的ALT、AST、GT，可以反映肝細(xì)胞的損傷程度，復(fù)方蛋氨酸膽堿隨劑量加大對(duì)肝細(xì)胞損傷加大，但都較模型組小，中、低劑量組ALT，低劑量組AST、GT與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。3 討論NAFLD 是一種無過量飲酒史、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征。近年來，我國(guó)由高脂血癥、高血壓、肥胖、糖尿病等引起的非酒精性脂肪肝的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。積極研究開

18、發(fā)脂肪肝的高效、價(jià)廉、方便、安全的藥物意義重大。建立脂肪肝細(xì)胞模型能有效地縮短篩選治療藥物的進(jìn)程，有助于篩選大量的藥物。日本學(xué)者Yasuyuki O等應(yīng)用0.10 mmol/L，1.0 mmol/L濃度的油酸作用于HepG2細(xì)胞24 h后，成功造成肝細(xì)胞脂肪變性模型5。Ariel EF6還用油酸和亞油酸的混合物也造成原代鼠肝細(xì)胞和HepG2肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積。Yasuyuki Fujimoto等7研究表明，在鏈長(zhǎng)為C12-C18的長(zhǎng)鏈脂肪酸能使人源性的肝細(xì)胞株形成明顯的脂滴。肝細(xì)胞攝取長(zhǎng)鏈脂肪酸并將其酯化成中性脂滴后儲(chǔ)存于細(xì)胞內(nèi)。因此，增加細(xì)胞外的長(zhǎng)鏈脂肪酸能增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)脂肪的生成，從而引起肝細(xì)

19、胞脂肪變。因此，本研究采用油酸刺激HepG2和L02細(xì)胞油紅O染色鏡下觀察脂滴形成的時(shí)量和時(shí)效關(guān)系。發(fā)現(xiàn)一定濃度油酸刺激HepG2和L02細(xì)胞24 h后，肝細(xì)胞內(nèi)積聚了大量的中性脂滴,但同時(shí)發(fā)現(xiàn)48 h后HepG2內(nèi)脂滴開始減退，L02細(xì)胞72 h后脂滴開始減退，表明采用油酸刺激HepG2和L02細(xì)胞能成功地在體外復(fù)制脂肪肝模型，是一個(gè)比較簡(jiǎn)便的方法。實(shí)驗(yàn)觀察藥物對(duì)HepG2和L02脂肪肝體外模型的影響，選用復(fù)方蛋氨酸膽堿(東寶肝泰)作為陽性藥。復(fù)方蛋氨酸膽堿是以蛋氨酸、重酒石酸膽堿、葉酸、B族維生素等藥物配制而成的復(fù)方制劑，膽堿是卵磷脂的組成成分，可促進(jìn)磷脂的合成，加速肝內(nèi)脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)，它和體內(nèi)

20、甲基轉(zhuǎn)換作用和脂代謝密切相關(guān)，而蛋氨酸可提供甲基以合成膽堿。重酒石酸膽堿、葉酸、B族維生素是供給甲基的前體物質(zhì)，是合成膽堿的重要成分，B族維生素和蛋氨酸又有驅(qū)脂作用。故本藥能降血脂，改善肝功能和肝病患者的消化系癥狀，是臨床治療脂肪肝的首選藥物。以其作為陽性對(duì)照藥物有一定的說服力8。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的油紅O染色圖片及圖像分析軟件分析結(jié)果證明了復(fù)方蛋氨酸膽堿的作用。通過檢測(cè)細(xì)胞上清液中ALT、AST、GT可以反映肝細(xì)胞損傷情況，本實(shí)驗(yàn)顯示模型組培養(yǎng)上清中的ALT、AST、GT顯著升高,與對(duì)照組差異明顯,表明肝細(xì)胞損害較重。發(fā)生這些變化的原因可能是:由于FFA 攝入增加,TG合成增多,使線粒體氧化速度代償性

21、增加,為脂質(zhì)過氧化提供了足夠的反應(yīng)基質(zhì),產(chǎn)生了大量具有反應(yīng)活性和細(xì)胞毒性的活性氧簇(ROS)9。ROS使細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)大量消耗,細(xì)胞損害加重。復(fù)方蛋氨酸膽堿組與模型組比較差異較小，表明復(fù)方蛋氨酸膽堿組對(duì)肝細(xì)胞損傷較小，是一個(gè)較好的抗脂肪肝藥。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞的脂肪肝模型藥物難以使細(xì)胞內(nèi)脂滴減少，可能是因?yàn)樵撃Ｐ椭?，?xì)胞內(nèi)脂滴消失較快，藥物作用的時(shí)間太短而無法觀察到藥效。對(duì)于HepG2細(xì)胞的脂肪肝模型48 h就可見脂滴減退，這可能與腫瘤細(xì)胞代謝較快有關(guān)。而對(duì)于L02細(xì)胞在2次給藥后，油酸刺激48 h后給藥組脂滴可見減少，可見藥物對(duì)脂肪的干預(yù)作用需要有足夠的作用時(shí)間，這與臨床上降脂藥普遍需要長(zhǎng)療程相吻合。本實(shí)驗(yàn)通過比較HepG2、L02兩種細(xì)胞系，給予同樣的造模方式和給藥方式，可見L02細(xì)胞比HepG2細(xì)胞更適合作為體外的篩藥模型。油酸刺激L02細(xì)胞形成脂肪變，藥物提前24 h干預(yù)，24 h后再給藥一次，這種造模和給藥方案可作為一種可行的脂肪肝細(xì)胞篩藥模型使用?！尽?#160; 1 曾民德.脂肪肝J.中華消化雜志，1999，19(2)：120.2 FARRELL G C,LARTER C Z. Nonalcoholic fatty liver disease :from steatosis to cirrh