不同治則方藥對(duì)快速老化小鼠腦組織細(xì)胞因子表達(dá)的影響

1、不同治則方藥對(duì)快速老化小鼠腦組織細(xì)胞因子表達(dá)的影響                      作者：陳云波，王奇，羅榮敬，馮炯，鹿俊磊，程淑意 【摘要】  目的觀察不同治則方藥對(duì)癡呆動(dòng)物模型腦組織細(xì)胞因子表達(dá)的影響。方法7月齡快速老化亞系SAMP8小鼠分為癡呆模型組、陽(yáng)性對(duì)照藥腦復(fù)康組、六味地黃湯組、四君子湯組、歸脾湯組、當(dāng)歸芍藥散組等6個(gè)組；抗快速老化亞系

2、SAMR1作為正常對(duì)照組。給藥4周后，用液相蛋白芯片（Luminex）技術(shù)同時(shí)測(cè)定腦組織中的10種細(xì)胞因子（GM-CSF，IFN-，TNF-，IL-1，IL-2，L-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12）含量。結(jié)果8月齡SAMP8小鼠腦組織中某些細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)生異常改變；當(dāng)歸芍藥散、四君子湯能分別提高模型小鼠海馬中的IL-4和IFN-的水平（P <0.05），而六味地黃湯組則能使模型小鼠海馬中的10種細(xì)胞因子指標(biāo)恢復(fù)到正常水平（P <0.05, P <0.01）。結(jié)論六味地黃湯、當(dāng)歸芍藥散、四君子湯則能在一定程度上調(diào)節(jié)SAMP8小鼠的異常免疫反應(yīng)，其中六味地黃湯的作

3、用效果較好。 【關(guān)鍵詞】  阿爾茨海默??； 快速老化小鼠； 中藥復(fù)方； 細(xì)胞因子； 液相蛋白芯片老年性癡呆即阿爾茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是目前公認(rèn)的危害人類(lèi)健康的主要疾病之一，已成為威脅中國(guó)老年人健康，僅位于心臟病、腫瘤、卒中之后的第四大疾病。由于AD病理變化的復(fù)雜性，其發(fā)病機(jī)制尚未揭示1，盡管世界各國(guó)在尋找AD有效治療藥物的研究中投入了大量的人力和物力，但成果卻十分有限。作為天然藥物的中藥尤其是復(fù)方，在防治老年性疾病方面則有著豐富的理論和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)以及潛在的優(yōu)勢(shì)，因此，闡明中藥復(fù)方防治AD的藥理機(jī)制，篩選和研制能延緩AD進(jìn)程、提高患者生活質(zhì)量

4、的中藥新藥將具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和廣闊的應(yīng)用前景。     本實(shí)驗(yàn)研究擬采用新引進(jìn)的液相蛋白芯片（Luminex）技術(shù)2，研究不同治則方藥對(duì)癡呆動(dòng)物模型腦組織細(xì)胞因子的影響。首先在文獻(xiàn)檢索和預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，初篩出10種與AD免疫炎癥病理反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子,它們是粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granuloyte-macrophage colony stimutaing factor, GM-CSF）、-干擾素（Interferon , IFN-）、腫瘤壞死因子-（Tumour necrosis factor-, TNF-）、白介素-1（Interleukin

5、-1, IL-1）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4）、白介素-5（IL-5）、白介素-6（IL-6）、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)；然后用4種不同治則的經(jīng)典方藥（即六味地黃湯、歸脾湯、當(dāng)歸芍藥散和四君子湯）對(duì)癡呆動(dòng)物模型進(jìn)行治療；應(yīng)用Luminex檢測(cè)技術(shù)，比較不同治則方藥各自不同蛋白表達(dá)靶點(diǎn)（腦組織的皮質(zhì)和海馬）的細(xì)胞因子含量變化，從炎癥與免疫反應(yīng)方面闡述中藥復(fù)方防治AD的藥理機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1  材料與儀器1.1  動(dòng)物 SPF級(jí)7月齡雄性快速老化小鼠（senescence accelerated mou

6、se，SAM）購(gòu)自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年腦病研究室動(dòng)物中心（動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：06F1022），其中快速老化亞系SAM-prone/8（SAMP8）小鼠84只，抗快速老化亞系SAM-resistant/1（SAMR1）小鼠15只，體質(zhì)量約20 g。1.2  藥品和試劑 六味地黃湯（熟地、山萸肉、山藥、澤瀉、丹皮、茯苓按844333的比例配比）；歸脾湯（白術(shù)、茯苓、黃芪、龍眼肉、酸棗仁、木香、炙甘草、當(dāng)歸、遠(yuǎn)志、人參按3344421322的比例配比）；四君子湯（人參，白術(shù)，茯苓，炙甘草按1111的比例配比）；當(dāng)歸芍藥散（當(dāng)歸，芍藥，川芎，澤瀉，白術(shù)，茯苓按316884

7、4的比例配比）等4種方藥藥材由廣東省中醫(yī)院藥房提供，按煎煮標(biāo)準(zhǔn)配制，煎煮濃縮至所需濃度（含生藥為1 g/ml）；腦復(fù)康片（吡拉西坦片 Piracetam Tablets），廣東華南藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：051103；氯化鈉滅菌注射液，廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)品，批號(hào)：T051123； Mouse Multi-Cytokine Detection System2 Luminex檢測(cè)試劑盒，Upstate公司產(chǎn)品，批號(hào)：0604026780。   1.3 儀器液相芯片分析平臺(tái)（美國(guó)Luminex公司，型號(hào)Luminex100）；超低溫冰箱（美國(guó)Forma公司，型號(hào)8525

8、）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Beckman公司，型號(hào)GS-15R）；電子天平（日本Shimadzu公司，型號(hào)AGE120）；純水器（美國(guó)Millipore公司，型號(hào)Milli-Q）。2  方法2.1  分組84只7月齡SAMP8小鼠按區(qū)組隨機(jī)法分為模型組、腦復(fù)康組、六味地黃湯組、四君子湯組、歸脾湯組、當(dāng)歸芍藥散組，每組14只；15只SAMR1作為正常對(duì)照組。以各種藥物的臨床用量作為實(shí)驗(yàn)小鼠的用藥量，根據(jù)體重劑量濃度的換算公式3換算成小鼠標(biāo)準(zhǔn)體重劑量，按下列分組連續(xù)灌胃給藥4周。2.2  給藥   正常對(duì)照組：每天給予生理鹽水灌胃，0.2 m1/

9、次。 模型組：每天給予生理鹽水灌胃，0.2 m1/次。 六味地黃湯組（0.2 g/20 g）、四君子湯組（0.09 g/20 g）、歸脾湯組（0.23 g/20 g）、當(dāng)歸芍藥散組（0.34 g/20 g），每天分別按相應(yīng)的劑量（生藥/體重）灌胃。 腦復(fù)康組（陽(yáng)性藥對(duì)照）：每天給予腦復(fù)康片生理鹽水溶液灌胃，按 0.5 g/kg體重給藥。2.3 標(biāo)本制備 各組8月齡SAM小鼠灌胃治療后，斷頭取出其雙側(cè)海馬和雙側(cè)皮質(zhì)作為樣本，分離海馬組織時(shí)參照本室4的方法，取出雙側(cè)海馬放置于0.5 ml的Eppendorf管內(nèi)，稱重，封口，置于-70超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?.4 液相蛋白芯片(Lumine

10、x)技術(shù)檢測(cè) 腦組織標(biāo)本正式檢測(cè)前從-70超低溫冰箱取出，以每克組織加入15 ml磷酸鹽緩沖液（PBS）的比例，加入0.01 mol/L PBS（內(nèi)含苯甲基氟磺酸100 mg/L）液，在微型組織研磨器中充分研磨，3 000 g，4離心10 min，待測(cè)。嚴(yán)格按Upstate公司的Luminex檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。先將50 l的空白對(duì)照緩沖液、不同稀釋倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品分別加到可抽濾的96孔微孔板對(duì)應(yīng)孔內(nèi)，然后加入25 l抗體交聯(lián)微球進(jìn)行反應(yīng)，室溫振蕩4 h后，4過(guò)夜；次日進(jìn)行真空低壓抽濾、緩沖液洗滌，加25l檢測(cè)抗體進(jìn)行反應(yīng)；室溫振蕩1.5 h，加入25 l鏈親和素藻紅蛋白

11、熒光素進(jìn)行標(biāo)記；室溫振蕩30 min，加25 l終止液終止反應(yīng)，上Luminex 分析平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)完畢后，采用美國(guó)MiraiBio公司的MasterPlexTMQT多元數(shù)據(jù)分析軟件（隨Luminex 分析平臺(tái)安裝），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用四參數(shù)法換算出各細(xì)胞因子的含量。2.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，所有數(shù)據(jù)均以 ±s表示，用方差分析對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。3  結(jié)果3.1 各組8月齡SAM小鼠皮質(zhì)勻漿液10種細(xì)胞因子含量的比較 結(jié)果見(jiàn)表1。 與正常對(duì)照組比較，模型組除了IL-6和IL-10有下降趨勢(shì)外，其余8種細(xì)胞因子含量均呈升

12、高趨勢(shì)，但只有GM-CSF的含量明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。觀察各藥物治療組對(duì)皮質(zhì)GM-CSF的影響發(fā)現(xiàn)，六味地黃湯組、當(dāng)歸芍藥散和陽(yáng)性對(duì)照藥腦復(fù)康的GM-CSF含量均與正常對(duì)照組水平接近（P0.05），而四君子湯組和歸脾湯組則和模型組一樣，明顯高于正常對(duì)照組（P<0.05或P<0.01）。說(shuō)明前3種藥物能在一定程度上抑制SAMP8小鼠皮質(zhì)GM-CSF含量的升高。表1  各組SAM小鼠皮質(zhì)勻漿液10種細(xì)胞因子含量的比較（略）與正常對(duì)照組比較,P0.05,P0.01; 與模型組比較, P0.053.2 各組8月齡SAM小鼠海馬勻漿液10種細(xì)胞

13、因子含量的比較結(jié)果 見(jiàn)表2。 與正常對(duì)照組比較，8月齡SAMP8小鼠所有10種細(xì)胞因子含量均呈下降趨勢(shì)，除了TNF-和IL-5外，其余8種細(xì)胞因子含量均明顯低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。結(jié)果提示8月齡SAMP8小鼠腦組織中某些細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)生了異常改變。從不同藥物組對(duì)8月齡SAMP8小鼠海馬勻漿液10種細(xì)胞因子的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性對(duì)照藥腦復(fù)康能提高模型小鼠海馬中的IFN-，IL-4和IL-12的水平（P<0.05或P<0.01）；當(dāng)歸芍藥散能提高模型小鼠海馬中的IFN-和IL-4的水平（P<0.05）；四君子湯組也能提高

14、模型小鼠海馬中的IFN-水平（P<0.05）；而六味地黃湯組則能使模型小鼠海馬中的GM-CSF，IFN-，TNF，IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12等10種細(xì)胞因子指標(biāo)全部顯著升高（P<0.05或P<0.01），大多恢復(fù)到正常水平。結(jié)果表明當(dāng)該時(shí)期SAMP8小鼠海馬中的免疫機(jī)制出現(xiàn)異常反應(yīng)時(shí)，中藥復(fù)方六味地黃湯、當(dāng)歸芍藥散、四君子湯以及陽(yáng)性對(duì)照藥腦復(fù)康均能起到一定的調(diào)節(jié)作用，其中六味地黃湯的作用效果較明顯。表2  各組SAM小鼠海馬勻漿液10種細(xì)胞因子含量的比較（略） 4  討論   &#

15、160; 快速老化小鼠分為快速老化亞系（senescence accelerated mouse/prone，SAM-P）及抗快速老化亞系（senescence accelerated mouse/resistance，SAM-R），由日本京都大學(xué)竹田俊男教授首次培育成功，經(jīng)20多代交配近繁，獲得了遺傳性與病理表型一致，符合近交系標(biāo)準(zhǔn)的新系列5。SAM-P品系除具有一般老化癥狀外，還伴隨著快速老化出現(xiàn)的學(xué)習(xí)記憶力障礙和低恐怖低緊張狀態(tài)，為腦老化癡呆模型小鼠。其具有認(rèn)知障礙，且在渡過(guò)生長(zhǎng)期后，伴快速老化自然發(fā)生，與臨床癡呆的漸進(jìn)性發(fā)生極為相似。大量研究表明，SAM-P品系與其同源對(duì)照R1相比，其

16、行為學(xué)、形態(tài)學(xué)、神經(jīng)生化、多種酶類(lèi)以及組織蛋白和基因表達(dá)均出現(xiàn)異常。     SAM-P小鼠各種生化指標(biāo)的異常變化促使一些學(xué)者深入到分子水平探討其機(jī)理。日本學(xué)者Tha等6研究認(rèn)為，SAM-P腦中致炎因子表達(dá)的升高可能與P8衰老相關(guān)的神經(jīng)功能紊亂或認(rèn)知功能缺陷有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)用Luminex技術(shù)對(duì)8月齡SAM-P小鼠腦組織勻漿液同時(shí)進(jìn)行多種細(xì)胞因子的檢測(cè)，結(jié)果表明，在被檢測(cè)的8月齡SAMP8小鼠皮質(zhì)勻漿液10種細(xì)胞因子指標(biāo)中，與正常對(duì)照組比較，除了IL-6和IL-10有下降趨勢(shì)外，其余8種細(xì)胞因子含量均呈升高趨勢(shì)，但差異都不明顯（P0.05），只有GM-CSF

17、的含量明顯高于正常對(duì)照組（P<0.05）。GM-CSF最先由Bradley等7在澳大利亞發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)由T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等在抗原刺激下產(chǎn)生， 是一種調(diào)節(jié)粒系祖細(xì)胞增殖分化和成熟的糖蛋白的因子，能增加中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量及生理功能，發(fā)揮抗感染免疫效應(yīng)；但在大腦中也能刺激小膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，介導(dǎo)其它炎癥因子（TNF、IL-2等）的分泌。瑞典學(xué)者Tarkowski E等8曾對(duì)一批早期AD患者血清和腦脊液中的一些促炎癥和抗炎癥細(xì)胞因子進(jìn)行過(guò)檢測(cè)，研究結(jié)果同樣表明，除了GM-CSF的含量明顯升高外，其它細(xì)胞因子則無(wú)明顯變化，與本次實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠皮質(zhì)勻漿液的檢測(cè)結(jié)果一致。

18、0;    本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，8月齡SAMP8小鼠海馬勻漿液中所有10種細(xì)胞因子含量均呈下降趨勢(shì)，除了TNF-和IL-5外，其余8種細(xì)胞因子含量均明顯低于正常對(duì)照組（P<0.05或P<0.01），這與其他同樣檢測(cè)AD動(dòng)物模型海馬細(xì)胞因子的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論不大一致9。設(shè)想有2種可能，一是本次實(shí)驗(yàn)取材時(shí)SAMP8小鼠尚未滿10月齡的原因所致。因?yàn)門(mén)ha等6研究曾發(fā)現(xiàn)2月齡SAMP8小鼠腦中IL-1均比5月齡高，但與同時(shí)期的R1對(duì)照小鼠相比沒(méi)有明顯的差異，至10月齡以后SAMP8小鼠腦中IL-1才明顯高于R1對(duì)照小鼠；二是天津中醫(yī)藥大學(xué)從日本

19、引進(jìn)的SAM小鼠（包括P/8、R/1系列）身體狀況可能因衰老發(fā)生了某些變化，導(dǎo)致海馬中神經(jīng)元凋亡而數(shù)量減少、蛋白表達(dá)發(fā)生改變。但8月齡SAM小鼠海馬細(xì)胞因子含量下降的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。     根據(jù)AD發(fā)病的主要病因病機(jī)為腎虛和氣血兩虛，本研究選擇了補(bǔ)腎的六味地黃湯、補(bǔ)氣的四君子湯、益氣補(bǔ)血的歸脾湯3個(gè)針對(duì)AD本虛的病機(jī)起作用的經(jīng)典方藥，另外選擇了既往在AD方面研究較多的當(dāng)歸芍藥散來(lái)作為針對(duì)標(biāo)實(shí)起作用的方藥。在與本實(shí)驗(yàn)同步進(jìn)行的該4種經(jīng)典名方對(duì)SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶功能影響的研究中發(fā)現(xiàn)，六味地黃湯、四君子湯、歸脾湯均可以明顯改善SAMP8小鼠

20、的學(xué)習(xí)記憶能力，當(dāng)歸芍藥散組的學(xué)習(xí)記憶能力則有改善趨勢(shì)（另文發(fā)表）。本實(shí)驗(yàn)選的4種經(jīng)典名方除了以對(duì)老年性癡呆的中醫(yī)治則治法認(rèn)識(shí)作為選擇依據(jù)外，還由于這4種中藥復(fù)方對(duì)免疫系統(tǒng)改善都有一定的作用。     六味地黃湯的功用為滋補(bǔ)肝腎，現(xiàn)代常用本方治療慢性腎炎、高血壓病、神經(jīng)衰弱等種疾病。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)10六味地黃湯能影響花生四烯酸大鼠脾臟Th1細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的水平，發(fā)揮糾正機(jī)體平衡紊亂的作用。四君子湯有益氣健脾的功效，主治脾胃氣虛證，能使脾胃之氣健旺，為補(bǔ)氣的基本方，故臨床中多以之加減來(lái)治療氣虛證。有研究表明11四君子湯可通過(guò)益氣健脾調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的水平和功能，

21、從而達(dá)到增強(qiáng)免疫功能的作用。歸脾湯有益氣補(bǔ)血、健脾養(yǎng)心的功效。有研究證實(shí)12歸脾湯治療慢性肝炎患者能降低血清免疫球蛋白，升高補(bǔ)體及CD3+、CD4+淋巴細(xì)胞。當(dāng)歸芍藥散出自金匱要略，能養(yǎng)血柔肝，活血化瘀，健脾利水，臨床中主要應(yīng)用于婦科疾病，20世紀(jì)80年代日本學(xué)者在臨床上首次將當(dāng)歸芍藥散用于治療老年性癡呆13，取得初步療效。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明14，當(dāng)歸芍藥散明顯升高D半乳糖所致亞急性衰老小鼠降低的胸腺指數(shù)，體外對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖有一定促進(jìn)作用，提示能增強(qiáng)衰老小鼠細(xì)胞免疫功能。      本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，當(dāng)SAMP8小鼠海馬中的免疫機(jī)制出現(xiàn)異常反應(yīng)時(shí)，中藥

22、復(fù)方六味地黃湯、當(dāng)歸芍藥散、四君子湯以及陽(yáng)性對(duì)照藥腦復(fù)康對(duì)體內(nèi)與免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)的各種細(xì)胞因子都有一定的影響，即均能起到一定的調(diào)節(jié)作用，其中六味地黃湯的作用效果較明顯。六味地黃湯為滋陰補(bǔ)腎之經(jīng)典名方，在中醫(yī)臨床中被廣為應(yīng)用于上百種疾病的治療。實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)研究表明，六味地黃湯具有廣泛的藥理學(xué)作用，包括延緩衰老、調(diào)節(jié)免疫和內(nèi)分泌功能。腎為先天之本，主生長(zhǎng)發(fā)育，腎氣盛則長(zhǎng)壽，腎氣虛則早衰?，F(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合研究認(rèn)為，“腎”在維持機(jī)體免疫功能的穩(wěn)定性中具有重要作用，“腎虛”是老年人生理機(jī)能衰退的外象，其具有一定的物質(zhì)基礎(chǔ)，而免疫機(jī)能衰退則是其中之一。因而，運(yùn)用補(bǔ)腎法調(diào)整衰老機(jī)體的免疫功能，對(duì)防治老年性癡呆的

23、發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。     綜上所述，本研究初步證實(shí)了SAMP8小鼠海馬中的免疫機(jī)制出現(xiàn)異常反應(yīng)時(shí)，中藥復(fù)方六味地黃湯、當(dāng)歸芍藥散、四君子湯均能起到一定的調(diào)節(jié)作用，而各用藥組對(duì)SAM癡呆小鼠異常免疫狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用與改善其認(rèn)知功能障礙可能有關(guān)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1盛樹(shù)力. 老年性癡呆的治療和護(hù)理，第1版 M. 北京:科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社, 2000：4.2陳云波，鄧元江. 液相蛋白芯片技術(shù)及其在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用J. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23(4)：360.3陳奇. 中藥藥理研究方法學(xué)，第1版M. 北京: 人民衛(wèi)生出版社，1993：33. 4張大鵬，陳云波，王奇，等. 人參皂苷Rg1對(duì)淀粉樣蛋白誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)J. 中國(guó)臨床康復(fù)，2006,23(10)：39.5Takeda T. Senescence-accelerated mouse (SAM): a biogerontological resource in aging research J. Neurobiol Aging, 1999,20:105.6Tha KK, Okuma Y, Miyazaki H, et al.