不同治則方藥對快速老化小鼠腦組織細胞因子表達的影響

1、不同治則方藥對快速老化小鼠腦組織細胞因子表達的影響                      作者：陳云波，王奇，羅榮敬，馮炯，鹿俊磊，程淑意 【摘要】  目的觀察不同治則方藥對癡呆動物模型腦組織細胞因子表達的影響。方法7月齡快速老化亞系SAMP8小鼠分為癡呆模型組、陽性對照藥腦復康組、六味地黃湯組、四君子湯組、歸脾湯組、當歸芍藥散組等6個組；抗快速老化亞系

2、SAMR1作為正常對照組。給藥4周后，用液相蛋白芯片（Luminex）技術(shù)同時測定腦組織中的10種細胞因子（GM-CSF，IFN-，TNF-，IL-1，IL-2，L-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12）含量。結(jié)果8月齡SAMP8小鼠腦組織中某些細胞因子表達發(fā)生異常改變；當歸芍藥散、四君子湯能分別提高模型小鼠海馬中的IL-4和IFN-的水平（P <0.05），而六味地黃湯組則能使模型小鼠海馬中的10種細胞因子指標恢復到正常水平（P <0.05, P <0.01）。結(jié)論六味地黃湯、當歸芍藥散、四君子湯則能在一定程度上調(diào)節(jié)SAMP8小鼠的異常免疫反應，其中六味地黃湯的作

3、用效果較好。 【關(guān)鍵詞】  阿爾茨海默??； 快速老化小鼠； 中藥復方； 細胞因子； 液相蛋白芯片老年性癡呆即阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease, AD）是目前公認的危害人類健康的主要疾病之一，已成為威脅中國老年人健康，僅位于心臟病、腫瘤、卒中之后的第四大疾病。由于AD病理變化的復雜性，其發(fā)病機制尚未揭示1，盡管世界各國在尋找AD有效治療藥物的研究中投入了大量的人力和物力，但成果卻十分有限。作為天然藥物的中藥尤其是復方，在防治老年性疾病方面則有著豐富的理論和實踐經(jīng)驗以及潛在的優(yōu)勢，因此，闡明中藥復方防治AD的藥理機制，篩選和研制能延緩AD進程、提高患者生活質(zhì)量

4、的中藥新藥將具有重要的現(xiàn)實意義和廣闊的應用前景。     本實驗研究擬采用新引進的液相蛋白芯片（Luminex）技術(shù)2，研究不同治則方藥對癡呆動物模型腦組織細胞因子的影響。首先在文獻檢索和預實驗的基礎(chǔ)上，初篩出10種與AD免疫炎癥病理反應相關(guān)的細胞因子,它們是粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（Granuloyte-macrophage colony stimutaing factor, GM-CSF）、-干擾素（Interferon , IFN-）、腫瘤壞死因子-（Tumour necrosis factor-, TNF-）、白介素-1（Interleukin

5、-1, IL-1）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4）、白介素-5（IL-5）、白介素-6（IL-6）、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)；然后用4種不同治則的經(jīng)典方藥（即六味地黃湯、歸脾湯、當歸芍藥散和四君子湯）對癡呆動物模型進行治療；應用Luminex檢測技術(shù)，比較不同治則方藥各自不同蛋白表達靶點（腦組織的皮質(zhì)和海馬）的細胞因子含量變化，從炎癥與免疫反應方面闡述中藥復方防治AD的藥理機制，為其臨床應用提供實驗依據(jù)。1  材料與儀器1.1  動物 SPF級7月齡雄性快速老化小鼠（senescence accelerated mou

6、se，SAM）購自天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院老年腦病研究室動物中心（動物質(zhì)量合格證號：06F1022），其中快速老化亞系SAM-prone/8（SAMP8）小鼠84只，抗快速老化亞系SAM-resistant/1（SAMR1）小鼠15只，體質(zhì)量約20 g。1.2  藥品和試劑 六味地黃湯（熟地、山萸肉、山藥、澤瀉、丹皮、茯苓按844333的比例配比）；歸脾湯（白術(shù)、茯苓、黃芪、龍眼肉、酸棗仁、木香、炙甘草、當歸、遠志、人參按3344421322的比例配比）；四君子湯（人參，白術(shù)，茯苓，炙甘草按1111的比例配比）；當歸芍藥散（當歸，芍藥，川芎，澤瀉，白術(shù)，茯苓按316884

7、4的比例配比）等4種方藥藥材由廣東省中醫(yī)院藥房提供，按煎煮標準配制，煎煮濃縮至所需濃度（含生藥為1 g/ml）；腦復康片（吡拉西坦片 Piracetam Tablets），廣東華南藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號：051103；氯化鈉滅菌注射液，廣州中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院產(chǎn)品，批號：T051123； Mouse Multi-Cytokine Detection System2 Luminex檢測試劑盒，Upstate公司產(chǎn)品，批號：0604026780。   1.3 儀器液相芯片分析平臺（美國Luminex公司，型號Luminex100）；超低溫冰箱（美國Forma公司，型號8525

8、）；臺式高速冷凍離心機（德國Beckman公司，型號GS-15R）；電子天平（日本Shimadzu公司，型號AGE120）；純水器（美國Millipore公司，型號Milli-Q）。2  方法2.1  分組84只7月齡SAMP8小鼠按區(qū)組隨機法分為模型組、腦復康組、六味地黃湯組、四君子湯組、歸脾湯組、當歸芍藥散組，每組14只；15只SAMR1作為正常對照組。以各種藥物的臨床用量作為實驗小鼠的用藥量，根據(jù)體重劑量濃度的換算公式3換算成小鼠標準體重劑量，按下列分組連續(xù)灌胃給藥4周。2.2  給藥   正常對照組：每天給予生理鹽水灌胃，0.2 m1/

9、次。 模型組：每天給予生理鹽水灌胃，0.2 m1/次。 六味地黃湯組（0.2 g/20 g）、四君子湯組（0.09 g/20 g）、歸脾湯組（0.23 g/20 g）、當歸芍藥散組（0.34 g/20 g），每天分別按相應的劑量（生藥/體重）灌胃。 腦復康組（陽性藥對照）：每天給予腦復康片生理鹽水溶液灌胃，按 0.5 g/kg體重給藥。2.3 標本制備 各組8月齡SAM小鼠灌胃治療后，斷頭取出其雙側(cè)海馬和雙側(cè)皮質(zhì)作為樣本，分離海馬組織時參照本室4的方法，取出雙側(cè)海馬放置于0.5 ml的Eppendorf管內(nèi)，稱重，封口，置于-70超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?.4 液相蛋白芯片(Lumine

10、x)技術(shù)檢測 腦組織標本正式檢測前從-70超低溫冰箱取出，以每克組織加入15 ml磷酸鹽緩沖液（PBS）的比例，加入0.01 mol/L PBS（內(nèi)含苯甲基氟磺酸100 mg/L）液，在微型組織研磨器中充分研磨，3 000 g，4離心10 min，待測。嚴格按Upstate公司的Luminex檢測試劑盒說明書進行操作。先將50 l的空白對照緩沖液、不同稀釋倍數(shù)的標準品和待測樣品分別加到可抽濾的96孔微孔板對應孔內(nèi)，然后加入25 l抗體交聯(lián)微球進行反應，室溫振蕩4 h后，4過夜；次日進行真空低壓抽濾、緩沖液洗滌，加25l檢測抗體進行反應；室溫振蕩1.5 h，加入25 l鏈親和素藻紅蛋白

11、熒光素進行標記；室溫振蕩30 min，加25 l終止液終止反應，上Luminex 分析平臺進行檢測。檢測完畢后，采用美國MiraiBio公司的MasterPlexTMQT多元數(shù)據(jù)分析軟件（隨Luminex 分析平臺安裝），繪制標準曲線，用四參數(shù)法換算出各細胞因子的含量。2.5  統(tǒng)計學處理實驗結(jié)果用SPSS11.0統(tǒng)計軟件處理，所有數(shù)據(jù)均以 ±s表示，用方差分析對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。3  結(jié)果3.1 各組8月齡SAM小鼠皮質(zhì)勻漿液10種細胞因子含量的比較 結(jié)果見表1。 與正常對照組比較，模型組除了IL-6和IL-10有下降趨勢外，其余8種細胞因子含量均呈升

12、高趨勢，但只有GM-CSF的含量明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。觀察各藥物治療組對皮質(zhì)GM-CSF的影響發(fā)現(xiàn)，六味地黃湯組、當歸芍藥散和陽性對照藥腦復康的GM-CSF含量均與正常對照組水平接近（P0.05），而四君子湯組和歸脾湯組則和模型組一樣，明顯高于正常對照組（P<0.05或P<0.01）。說明前3種藥物能在一定程度上抑制SAMP8小鼠皮質(zhì)GM-CSF含量的升高。表1  各組SAM小鼠皮質(zhì)勻漿液10種細胞因子含量的比較（略）與正常對照組比較,P0.05,P0.01; 與模型組比較, P0.053.2 各組8月齡SAM小鼠海馬勻漿液10種細胞

13、因子含量的比較結(jié)果 見表2。 與正常對照組比較，8月齡SAMP8小鼠所有10種細胞因子含量均呈下降趨勢，除了TNF-和IL-5外，其余8種細胞因子含量均明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。結(jié)果提示8月齡SAMP8小鼠腦組織中某些細胞因子表達發(fā)生了異常改變。從不同藥物組對8月齡SAMP8小鼠海馬勻漿液10種細胞因子的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性對照藥腦復康能提高模型小鼠海馬中的IFN-，IL-4和IL-12的水平（P<0.05或P<0.01）；當歸芍藥散能提高模型小鼠海馬中的IFN-和IL-4的水平（P<0.05）；四君子湯組也能提高

14、模型小鼠海馬中的IFN-水平（P<0.05）；而六味地黃湯組則能使模型小鼠海馬中的GM-CSF，IFN-，TNF，IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12等10種細胞因子指標全部顯著升高（P<0.05或P<0.01），大多恢復到正常水平。結(jié)果表明當該時期SAMP8小鼠海馬中的免疫機制出現(xiàn)異常反應時，中藥復方六味地黃湯、當歸芍藥散、四君子湯以及陽性對照藥腦復康均能起到一定的調(diào)節(jié)作用，其中六味地黃湯的作用效果較明顯。表2  各組SAM小鼠海馬勻漿液10種細胞因子含量的比較（略） 4  討論   &#

15、160; 快速老化小鼠分為快速老化亞系（senescence accelerated mouse/prone，SAM-P）及抗快速老化亞系（senescence accelerated mouse/resistance，SAM-R），由日本京都大學竹田俊男教授首次培育成功，經(jīng)20多代交配近繁，獲得了遺傳性與病理表型一致，符合近交系標準的新系列5。SAM-P品系除具有一般老化癥狀外，還伴隨著快速老化出現(xiàn)的學習記憶力障礙和低恐怖低緊張狀態(tài)，為腦老化癡呆模型小鼠。其具有認知障礙，且在渡過生長期后，伴快速老化自然發(fā)生，與臨床癡呆的漸進性發(fā)生極為相似。大量研究表明，SAM-P品系與其同源對照R1相比，其

16、行為學、形態(tài)學、神經(jīng)生化、多種酶類以及組織蛋白和基因表達均出現(xiàn)異常。     SAM-P小鼠各種生化指標的異常變化促使一些學者深入到分子水平探討其機理。日本學者Tha等6研究認為，SAM-P腦中致炎因子表達的升高可能與P8衰老相關(guān)的神經(jīng)功能紊亂或認知功能缺陷有關(guān)。本實驗用Luminex技術(shù)對8月齡SAM-P小鼠腦組織勻漿液同時進行多種細胞因子的檢測，結(jié)果表明，在被檢測的8月齡SAMP8小鼠皮質(zhì)勻漿液10種細胞因子指標中，與正常對照組比較，除了IL-6和IL-10有下降趨勢外，其余8種細胞因子含量均呈升高趨勢，但差異都不明顯（P0.05），只有GM-CSF

17、的含量明顯高于正常對照組（P<0.05）。GM-CSF最先由Bradley等7在澳大利亞發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)由T細胞、巨噬細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞等在抗原刺激下產(chǎn)生， 是一種調(diào)節(jié)粒系祖細胞增殖分化和成熟的糖蛋白的因子，能增加中性粒細胞和巨噬細胞的數(shù)量及生理功能，發(fā)揮抗感染免疫效應；但在大腦中也能刺激小膠質(zhì)細胞的生長，介導其它炎癥因子（TNF、IL-2等）的分泌。瑞典學者Tarkowski E等8曾對一批早期AD患者血清和腦脊液中的一些促炎癥和抗炎癥細胞因子進行過檢測，研究結(jié)果同樣表明，除了GM-CSF的含量明顯升高外，其它細胞因子則無明顯變化，與本次實驗對小鼠皮質(zhì)勻漿液的檢測結(jié)果一致。

18、0;    本次實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，8月齡SAMP8小鼠海馬勻漿液中所有10種細胞因子含量均呈下降趨勢，除了TNF-和IL-5外，其余8種細胞因子含量均明顯低于正常對照組（P<0.05或P<0.01），這與其他同樣檢測AD動物模型海馬細胞因子的文獻報道結(jié)論不大一致9。設(shè)想有2種可能，一是本次實驗取材時SAMP8小鼠尚未滿10月齡的原因所致。因為Tha等6研究曾發(fā)現(xiàn)2月齡SAMP8小鼠腦中IL-1均比5月齡高，但與同時期的R1對照小鼠相比沒有明顯的差異，至10月齡以后SAMP8小鼠腦中IL-1才明顯高于R1對照小鼠；二是天津中醫(yī)藥大學從日本

19、引進的SAM小鼠（包括P/8、R/1系列）身體狀況可能因衰老發(fā)生了某些變化，導致海馬中神經(jīng)元凋亡而數(shù)量減少、蛋白表達發(fā)生改變。但8月齡SAM小鼠海馬細胞因子含量下降的具體機制還有待進一步研究證實。     根據(jù)AD發(fā)病的主要病因病機為腎虛和氣血兩虛，本研究選擇了補腎的六味地黃湯、補氣的四君子湯、益氣補血的歸脾湯3個針對AD本虛的病機起作用的經(jīng)典方藥，另外選擇了既往在AD方面研究較多的當歸芍藥散來作為針對標實起作用的方藥。在與本實驗同步進行的該4種經(jīng)典名方對SAMP8小鼠學習記憶功能影響的研究中發(fā)現(xiàn)，六味地黃湯、四君子湯、歸脾湯均可以明顯改善SAMP8小鼠

20、的學習記憶能力，當歸芍藥散組的學習記憶能力則有改善趨勢（另文發(fā)表）。本實驗選的4種經(jīng)典名方除了以對老年性癡呆的中醫(yī)治則治法認識作為選擇依據(jù)外，還由于這4種中藥復方對免疫系統(tǒng)改善都有一定的作用。     六味地黃湯的功用為滋補肝腎，現(xiàn)代常用本方治療慢性腎炎、高血壓病、神經(jīng)衰弱等種疾病。有報道發(fā)現(xiàn)10六味地黃湯能影響花生四烯酸大鼠脾臟Th1細胞表達細胞因子的水平，發(fā)揮糾正機體平衡紊亂的作用。四君子湯有益氣健脾的功效，主治脾胃氣虛證，能使脾胃之氣健旺，為補氣的基本方，故臨床中多以之加減來治療氣虛證。有研究表明11四君子湯可通過益氣健脾調(diào)節(jié)細胞因子的水平和功能，

21、從而達到增強免疫功能的作用。歸脾湯有益氣補血、健脾養(yǎng)心的功效。有研究證實12歸脾湯治療慢性肝炎患者能降低血清免疫球蛋白，升高補體及CD3+、CD4+淋巴細胞。當歸芍藥散出自金匱要略，能養(yǎng)血柔肝，活血化瘀，健脾利水，臨床中主要應用于婦科疾病，20世紀80年代日本學者在臨床上首次將當歸芍藥散用于治療老年性癡呆13，取得初步療效。有實驗結(jié)果表明14，當歸芍藥散明顯升高D半乳糖所致亞急性衰老小鼠降低的胸腺指數(shù)，體外對小鼠脾淋巴細胞增殖有一定促進作用，提示能增強衰老小鼠細胞免疫功能。      本次實驗結(jié)果證實，當SAMP8小鼠海馬中的免疫機制出現(xiàn)異常反應時，中藥

22、復方六味地黃湯、當歸芍藥散、四君子湯以及陽性對照藥腦復康對體內(nèi)與免疫炎癥反應相關(guān)的各種細胞因子都有一定的影響，即均能起到一定的調(diào)節(jié)作用，其中六味地黃湯的作用效果較明顯。六味地黃湯為滋陰補腎之經(jīng)典名方，在中醫(yī)臨床中被廣為應用于上百種疾病的治療。實驗藥理學研究表明，六味地黃湯具有廣泛的藥理學作用，包括延緩衰老、調(diào)節(jié)免疫和內(nèi)分泌功能。腎為先天之本，主生長發(fā)育，腎氣盛則長壽，腎氣虛則早衰?，F(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合研究認為，“腎”在維持機體免疫功能的穩(wěn)定性中具有重要作用，“腎虛”是老年人生理機能衰退的外象，其具有一定的物質(zhì)基礎(chǔ)，而免疫機能衰退則是其中之一。因而，運用補腎法調(diào)整衰老機體的免疫功能，對防治老年性癡呆的

23、發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。     綜上所述，本研究初步證實了SAMP8小鼠海馬中的免疫機制出現(xiàn)異常反應時，中藥復方六味地黃湯、當歸芍藥散、四君子湯均能起到一定的調(diào)節(jié)作用，而各用藥組對SAM癡呆小鼠異常免疫狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用與改善其認知功能障礙可能有關(guān)?！緟⒖嘉墨I】  1盛樹力. 老年性癡呆的治療和護理，第1版 M. 北京:科學技術(shù)文獻出版社, 2000：4.2陳云波，鄧元江. 液相蛋白芯片技術(shù)及其在中醫(yī)藥研究中的應用J. 廣州中醫(yī)藥大學學報，2006，23(4)：360.3陳奇. 中藥藥理研究方法學，第1版M. 北京: 人民衛(wèi)生出版社，1993：33. 4張大鵬，陳云波，王奇，等. 人參皂苷Rg1對淀粉樣蛋白誘導大鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護J. 中國臨床康復，2006,23(10)：39.5Takeda T. Senescence-accelerated mouse (SAM): a biogerontological resource in aging research J. Neurobiol Aging, 1999,20:105.6Tha KK, Okuma Y, Miyazaki H, et al.