淀粉酶菌株的選育發(fā)酵工藝的研究和酶的純化

1、淀粉酶菌株的選育、發(fā)酵工藝的研究和酶的純化摘要：淀粉酶是最早用于工業(yè)生產(chǎn)并且迄今仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一，為了提高淀粉酶的生產(chǎn)水平，首先通過淀粉培養(yǎng)基從土壤中篩選出產(chǎn)淀粉酶的活性菌株，對菌株初步鑒定后進行紫外線誘變，篩選出產(chǎn)量高、性狀優(yōu)良的突變菌株，再用正交試驗的方法對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，實驗最后采用硫酸銨沉淀法初步純化發(fā)酵得到的淀粉酶并對酶活性進行了測定。關(guān)鍵詞：淀粉酶；分離篩選；紫外線誘變；優(yōu)化；提純1、 引言淀粉酶是能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，包括-淀粉酶、-淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶，是最早用于工業(yè)生產(chǎn)并且迄今仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一。淀粉酶種類繁多，特

2、點各異，在造紙、印染、釀造、果汁和食品加工、醫(yī)藥、洗滌劑、工業(yè)副產(chǎn)品及廢料的處理、青貯飼料及微生態(tài)制劑等多種領(lǐng)域具有廣闊的用途。我國是傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)大國，發(fā)展淀粉深加工工業(yè)是解決當前淀粉生產(chǎn)積壓的好出路，而幾乎所有淀粉深加工工業(yè)的基礎(chǔ)都是以淀粉質(zhì)原料的水解作為第一步，因此淀粉質(zhì)原料的液化情況直接關(guān)系到產(chǎn)品后期的加工工藝和產(chǎn)品的質(zhì)量。所以，改進淀粉液化工藝也是降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品市場競爭能力的一種重要手段。顯然，改進淀粉液化工藝首要任務就是提高淀粉酶的生產(chǎn)水平。那如何提高淀粉酶的生產(chǎn)水平呢？我們知道，現(xiàn)在淀粉酶主要來源于植物和微生物，并通過發(fā)酵完成生產(chǎn)，因此篩選出高產(chǎn)、穩(wěn)定的淀粉酶產(chǎn)生菌是淀粉酶生

3、產(chǎn)的頭等大事。本文試圖從土壤中分離出產(chǎn)淀粉酶的枯草桿菌，通過紫外線誘變育種及發(fā)酵條件優(yōu)化來得到高產(chǎn)、穩(wěn)定的淀粉酶產(chǎn)生菌株，并對發(fā)酵得到的淀粉酶進行初步提純，以達到加深對發(fā)酵工程上游技術(shù)中菌種選育的認識、掌握紫外線誘變育種的原理和方法、了解發(fā)酵條件對產(chǎn)物形成的影響、熟悉發(fā)酵條件的優(yōu)化方法、掌握分光光度法測液化型淀粉酶活力的基本原理和方法、掌握初步純化淀粉酶的方法的實驗目的。2、 材料與方法2. 1 實驗材料211 樣品：貴師大綜合樓附近的土壤212 培養(yǎng)基和試劑：淀粉培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨（斜面）、牛肉膏蛋白胨（液體）種子培養(yǎng)基、淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基、生理鹽水、碘液、2可溶性淀粉、硫酸銨、乙酸溶液、磷

4、酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、標準糊精溶液213 儀器設(shè)備：全自動高壓滅菌鍋、培養(yǎng)皿、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、恒溫搖床、離心機、分光光度計、恒溫水浴鍋、移液管、PH試紙、吸耳球、玻璃棒、量筒、試管、試管架、酒精燈、電子天平、三角燒瓶、洗瓶、接種針、接種環(huán)、直尺、記號筆等。2. 2 實驗方法221 細菌的分離與初步鑒定：將土壤系列稀釋，把10-3 、 10-4、10-5分別涂布到淀粉培養(yǎng)基上，27倒置培養(yǎng)2天，將長出的菌落接入斜面。將細菌從斜面接種到淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)2天，用碘液染色，記錄透明圈大小和菌落直徑，計算D/d值。保菌供下次實驗用。222 紫外線誘變育種：取活化后的菌種配成菌懸液、稀釋；倒淀粉培

5、養(yǎng)基平板，將菌懸液涂布其表面；用紫外線處理平板0、2min、4min、6min、8min、10min，每個處理2次重復；放到黑暗中倒置培養(yǎng)，37培養(yǎng)48h，分別計數(shù)誘變組和對照組平板上的菌落數(shù)，并計算致死率；加入碘液，分別測量誘變組和對照組菌落的透明圈直徑和菌落直徑，計算D/d值；將D/d值最大的菌種保存到斜面培養(yǎng)基上。223 生產(chǎn)菌株搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化2231 培養(yǎng)基初始pH值和裝液量對產(chǎn)酶的影響：用1mol/L鹽酸或1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值，使培養(yǎng)基的pH值為5.0、7.0、9.0，分裝至250mL三角瓶中，每瓶25mL，滅菌，冷卻后編號1、2、3，再接種，37下恒溫搖床培養(yǎng)4

6、8h（搖瓶裝液量分別30、40、50），最后測定發(fā)酵液酶活。 編號處理項1號2號3號PH579裝液量304050A66010-110-2.2 培養(yǎng)基碳源對產(chǎn)酶的影響：在不含可溶性淀粉的培養(yǎng)基中，分別加入0.5的各種碳源（可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖），以硝酸銨作為唯一氮源，進行碳源對產(chǎn)酶的影響的發(fā)酵試驗。 處理 結(jié)果可溶性淀粉葡萄糖蔗糖A66010-110-2.3 正交試驗設(shè)計：通過三因素兩水平的正交試驗對高產(chǎn)菌的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，建立高產(chǎn)菌株的最佳搖瓶發(fā)酵條件。因素處理接種量淀粉含量蛋白胨含量處理一35g/L5g/L處理二310g/L10g/L處理三55g/L10g/L處理四510g/L5g/L

7、224 淀粉酶的初步提純及酶活性的測定.1 淀粉酶的初步提純：收集發(fā)酵液，3000r/min離心10min，去除菌體，在上清液中加入65飽和度的硫酸銨，待硫酸銨充分溶解后于4鹽析2h，然后5000r/min離心20min，得到初步純化的淀粉酶。.2 標準曲線的制作和酶活性的測定：將可溶性淀粉稀釋成0.2、0.5、1、1.5和2的稀釋液，按下表進行標準曲線的制作和酶活性的測定。管號12345671727374淀粉稀釋液/mL2（0）2（0.2）2（0.5）2（1）2（1.5）2（2）2（2）2（2）2（2）2（2）緩沖液/mL111111111140水浴保溫5min蒸餾水/mL111111000

8、0粗酶液/mL000000111140水浴保溫30min，然后加入0.5mol/L乙酸10 mL，混均吸取反應液1 mL碘液/mL10101010101010101010A660（平均值）（71、72、73、74中加入的粗酶液，即為正交試驗設(shè)計中處理一、處理二、處理三、處理四所得的淀粉酶液）注：前6組的數(shù)據(jù)用于標準曲線的制作：以淀粉濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，作標準曲線；后4組的數(shù)據(jù)用于酶活性的測定：測得吸光度后，可從標準曲線中查出相應的淀粉濃度，求出被消耗的淀粉量，這里的酶活即為每毫升粗酶液于40，PH6.0的條件下，每小時液化可溶性淀粉的毫克數(shù)【mg可溶性淀粉/mL·h】。3、

9、 結(jié)果與分析3. 1 菌落的形態(tài)特征菌落在以淀粉為唯一碳源的分離培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)48 h形成白色圓形菌落，菌落背面乳白色，邊緣不光滑，形態(tài)規(guī)則，質(zhì)地較密，有透明圈，無沉淀。3. 2 計算D/d值321 分離篩選時，大部分菌落水解圈都粘連在一起，無法準確測得D/d值，只得到少部分數(shù)據(jù):單菌落透明圈直徑/mm(D)菌落直徑/mm(d)D/d4.03.01.314.07.12.0表A 透明圈直徑和菌落直徑及比值 分析：無法準確測得D/d值，可能是所采土樣中產(chǎn)淀粉酶的細菌含量較多，涂平板之前稀釋倍數(shù)不夠?qū)е聠尉溥^于密集，水解圈粘連；也可能是實驗操作不當所致。322 紫外誘變后，得到單菌落的透明圈直

10、徑和菌落直徑及比值：單菌落透明圈直徑/mm(D)菌落直徑/mm(d)D/d4.83.01.66.45.51.214.87.42.016.04.93.311.84.52.69.84.02.525.05.05.08.84.02.214.07.81.8分析：通過結(jié)果，可看出經(jīng)過紫外誘變后，有的菌株產(chǎn)酶活能力有所提高，有的減小，篩選產(chǎn)酶活能力最高的菌株，保存供后續(xù)試驗使用。我們挑號菌，將其保存到斜面培養(yǎng)基上供后續(xù)試驗使用。3. 3 計算菌株紫外誘變的致死率對菌株分別用紫外線處理，得到下表：誘變時間/min菌落數(shù)/個致死率(平均值)09800210-130663.310-2414410-112482.3

11、10-2223610-12596.710-240810-1599.310-291 00100由此數(shù)據(jù)，可作出紫外線誘變的致死曲線分析：由圖可知，淀粉酶菌株對紫外線比較敏感，而且致死率與誘變劑劑量存在正相關(guān)。當紫外線照射時間為6min時，致死率為96.7，進一步提高照射時間，則致死率隨之上升，當照射10min時，致死率為100 。一般認為，進行紫外誘變時，致死率為95左右時突變效果最好 。因此，紫外線誘變的最適劑量為6min。3. 4 菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化341 培養(yǎng)基初始pH值和裝液量對產(chǎn)酶的影響： 編號處理項1號2號3號PH579裝液量304050A66010-1無無無10-2無無無分析：未得

12、到數(shù)據(jù)的原因有三點：操作不當，可能是取液過程中加錯體積，也可能是將試管序號弄混了；將發(fā)酵液從搖床取出的過程中有少量溢出，導致濃度降低，影響實驗結(jié)果；發(fā)酵過程中有雜菌產(chǎn)生，發(fā)酵液被污染了。342 培養(yǎng)基碳源對產(chǎn)酶的影響： 處理 結(jié)果可溶性淀粉葡萄糖蔗糖A66010-100110969064510-2016412681204分析：由上表數(shù)據(jù)可知，培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖時酶活性最大。從而得出結(jié)論：三種碳源中最佳碳源是葡萄糖。343 標準曲線的制作：分析：標準曲線的精確度不高，原因主要有三點：淀粉濃度為0.5%時，A660明顯偏高，可能是稀釋淀粉的時候操作不當所致；在測酶活時，還未等到分光光度計穩(wěn)定就開

13、始讀數(shù)，造成測量結(jié)果有誤差；由于操作失誤，忘記每個試管做平行測量，造成測量結(jié)果不精確。344 正交試驗酶活力的測定試管編號1（對照）71727374A66000.0040.0470.0190.063酶消耗的淀粉濃度（%）01.9991.9301.9531.975酶活力（mg /mL·h）039.9838.6039.0639.50表1 試驗號因素酶活力（mg /mL·h）ABC111139.98212238.60321239.06422139.50表2 試驗結(jié)果分析分析：對正交試驗結(jié)果進行方差分析，可知最佳培養(yǎng)基配方為A1B1C1，即接種量3%、淀粉含量5g/L、蛋白胨含量5

14、g/L。3. 5 淀粉酶的初步提純正交試驗得到酶液分別加入65飽和度的硫酸銨，待硫酸銨充分溶解后于4鹽析2h，然后5000r/min離心20min，去除上清液，再加水稀釋測酶活。試管編號1（對照）71727374A66000.0150.0970.0490.033酶消耗的淀粉濃度（%）01.9811.8491.9261.952酶活力（mg /mL·h）039.6236.9838.5239.04表3 分析：實驗的目的旨在掌握初步純化淀粉酶的方法和進一步掌握分光光度法測液化型淀粉酶活力的基本原理和方法。表3 A660和表1相比，71、72、73均比表1大，74卻比表1小，可能是加水稀釋時混

15、合不均勻所致。4、 討論本實驗的設(shè)計方案具有一定的理論依據(jù)，如果操作得當，各方面條件滿足，會得到產(chǎn)淀粉酶的枯草桿菌高產(chǎn)菌株，及該菌株的最佳搖瓶發(fā)酵條件。但操作過程存在很多缺陷，主要問題有：分離篩選淀粉酶菌株時，稀釋度不夠?qū)е滤馊φ尺B；在進行pH值和裝液量對產(chǎn)酶影響的實驗過程中，取液操作不當，將試管序號都弄混了；發(fā)酵過程中有雜菌產(chǎn)生，發(fā)酵液被污染；制作標準曲線時，由于操作失誤，忘記每個試管做平行測量，造成測量結(jié)果不精確；在測酶活時，還未等到分光光度計穩(wěn)定就開始讀數(shù)，造成測量結(jié)果有誤差；由于考慮到時間的限制，實驗過程中分離時的復篩及突變后的復篩都沒做，若要得到精確可靠的實驗數(shù)據(jù)，應該操作完善。此外，紫外線誘變育種簡便易行、對條件和設(shè)備要求較低并能較好地提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，故在微生物育種中仍廣泛應用 。但實驗中發(fā)現(xiàn)紫外線誘變存在很大的不確定性，為使誘變效率提高，運用分子生物學技術(shù)對菌株進行基因操作和定向改造，會使菌株選育朝著快捷、高效的方向發(fā)展。以上幾點可以作為今后該實驗改進的幾點建議，及操作過程中應注意的問題。附錄（一）、培養(yǎng)基的配制1、淀粉培養(yǎng)基：蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏5g，可溶性淀粉2g，蒸餾水1000mL，瓊脂20g，pH 7.22、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏3g，蒸餾水1