細胞培養(yǎng)基質(zhì)量規(guī)范及檢驗方法

1、歡迎閱讀細胞培養(yǎng)基質(zhì)量標準及檢驗方法中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會二0一一年四月編寫說明1、 根據(jù)中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會 2010年9月20日組織召開的動物細胞培養(yǎng)基生產(chǎn)管理及質(zhì)量控制學(xué)術(shù)研討會紀要，結(jié)合我國的實際情況制定本標準。2、 本標準以中國藥典2010版和哺乳類動物細胞培養(yǎng)基(HG/T3935-2007)行業(yè)標準為依據(jù)，結(jié)合生物制品對細胞培養(yǎng)基原材料的特殊要求制定，增加了牛血清白蛋白殘留量、抗生素殘留量等檢測項目。3、 本標準分為細胞培養(yǎng)基檢驗項目和每個項目的檢驗方法兩部分，為評判細胞培養(yǎng)基產(chǎn)品質(zhì)量提供了依據(jù)和方法，從而規(guī)范我國細胞培養(yǎng)基行業(yè)健康發(fā)展。4、 結(jié)果評定依據(jù)本標準和方法對細胞培養(yǎng)基樣品

2、進行全項檢驗，所有項目均符合標準要求，判 定該樣品為合格；若有一項不符合標準要求，則判定樣品為不合格。細胞培養(yǎng)基質(zhì)量標準及檢驗方法一、細胞培養(yǎng)基質(zhì)量標準細胞培養(yǎng)基質(zhì)量應(yīng)符合表1所示的技術(shù)要求。表1技術(shù)要求檢驗項目限度要求檢驗方法澄清度澄清中華人民共和國藥典 2010年版二部附錄IX B進 行。pH值(每升標示量/L)pH允許偏差范圍為土 0.30中華人民共和國藥典2010年版附錄VIH進行。滲透壓(mOsm/kgH2)滲透壓允許偏差范圍為土5%中華人民共和國藥典2010年版二部附錄IX G滲 透壓摩爾濃度測定法進 行。干燥減量的質(zhì)量分數(shù)(為<5.0按中華人民共和國藥典 2010年版二部附

3、錄VM 干 燥失重測定法進行。細菌內(nèi)毒素（EU/ml）< 10按中華人民共和國約典 2010年版附錄XIE細菌內(nèi) 毒素檢查法中的凝膠法進 行。微生物限度細菌數(shù)(CFU/g)<200按中華人民共和國藥典 2010年版附錄XIJ微生物 限度檢查法進行，檢查項 目為細菌數(shù)、毒菌數(shù)。檢 查法采用平皿法。毒菌數(shù)(CFU/g)<50細胞生長試 驗（vero細 胞）細胞形態(tài)成纖維樣貼壁生長，形態(tài)正 常無變異按中華人民共和國化工行 業(yè)標準哺乳類動物細胞 培養(yǎng)基HG/T3935-2007 第7.7條進行。細胞數(shù)量培養(yǎng)72h細胞數(shù)量不低于1X105cells/ml ；繼續(xù)維持48h細胞數(shù)重不低于

4、 1 X105cells/ml牛血清白蛋白不得檢出依據(jù)中華人民共和國藥典 2010年二部附錄Vffl I牛血 清白蛋白殘留量測定法進 行，不得檢出牛血清白蛋 白。抗生素不得檢出依據(jù)中華人民共和國藥典 2010年二部附錄IX A抗生 素殘留量測定法進行，不 得檢出青霉素、鏈霉素及 慶大毒素。檢驗方法除非另有說明，檢驗中僅使用確認為分析純的試劑和中華人民共和國藥典2010年版中規(guī)定的純化水。2.1 澄清度的測定稱取每升標示量的實驗室樣品，置于1000ml燒杯中，加水950ml,攪拌至溶解，補加水至1000ml, 攪拌均勻。按中華人民共和國藥典 2010年版二部附錄DCB進行。2.2 pH值的測定稱

5、取每升標示量的實驗室樣品，置于 1000ml燒杯中，加水950ml,攪拌至溶解，補加水至1000ml,攪拌均勻。按中華人民共和國藥典 2010年版三部附錄V A進行。2.3 干燥減量的測定按中華人民共和國藥典2010年版三部附錄叫L干燥失重測定法進行。2.4 滲透壓的測定稱取每升標示量的實驗室樣品，置于 1000ml燒杯中，加水950ml,攪拌至溶解，補加水 至1000ml,攪拌均勻。按中華人民共和國藥典 2010年版三部附錄V H滲透壓摩爾濃度測定法 進行。取兩次平行測定結(jié)果的算術(shù)平均值為測定結(jié)果,兩次平行測定結(jié)果的絕對差值不大于這 兩個測定值的算術(shù)平均值的5%2.5 細菌內(nèi)毒素的測定按中華

6、人民共和國藥典2010年版三部附錄刈E細菌內(nèi)毒素檢查法中的凝膠法進行。2.6 微生物限度的測定I / .按中華人民共和國藥典2010年三部附錄刈G散生物限度檢查法進行，檢查項目為細菌數(shù)、 霉菌數(shù)。檢查法采用平皿法。2.7 細胞生長試驗2.7.1 貼壁型細胞生長試驗2.7.1.1 方法提要1）本試驗所用容器具及溶液均為無菌，試驗操作過程均為無菌操作。2）細胞在37c恒溫條件下，在含體積分數(shù)3%£ 10%勺小牛血清的細胞培養(yǎng)液中生長 72h, 觀察細胞形態(tài)并進行細胞計數(shù)；細胞生長72h后，更換不含小牛血清的細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h,觀察細胞形態(tài)并進行細胞計數(shù)。2.7.1.2 試劑和材料

7、1）牛血清：符合中華人民共和國藥典 2010年版三部附錄Xin d I I2）平衡鹽溶液：稱取氯化鉀0.2g ,精確至0.01g ;無水磷酸二氫鉀0.2g ,精確至0.01g ; 氯化鈉8.0g,精確至0.01g;無水磷酸氫二鈉1.15g,精確至0.001g;加純化水1000ml,混 勻，測pH值，pH值應(yīng)在7.5 ±0.3,過濾除菌即得。3）細胞：vero細胞（或根據(jù)不同的細胞培養(yǎng)基種類選擇適應(yīng)的細胞 ）:細胞代次不超過150 代。4）細胞培養(yǎng)液：按產(chǎn)品使用說明書要求配制；3）胰蛋白酶溶液：稱取胰蛋白酶（1:250） 2.5g,精確至0.01g,力口 1000ml平衡鹽溶液， 混勻

8、、測pH值，用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)pH值7.67.8 ,過濾除菌即得。2.7.1.3 儀器1）醫(yī)用凈化工作臺：潔凈級別為百級.2）二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱：能通二氧化碳氣體并且保持二氧化碳體積分數(shù)為（5±0.1） %,能在（37±1） C恒溫。歡迎閱讀3）細胞培養(yǎng)瓶：T25型、無菌。4）顯微鏡：倒置、相差。5）血球計數(shù)板。6）蓋玻片：無水乙醇浸泡并擦干。2.7.1.4 試驗步驟1）制備細胞懸液A取長成致密單層的細胞種子，將原細胞培養(yǎng)液從細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)吸出，用適量平衡鹽溶 液洗細胞一次，棄洗液（去除死細胞）。B向細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加入胰蛋白酶溶液 1ml,消化一定時間

9、，在顯微鏡下觀察，當細胞變圓 接近脫壁時，將胰蛋白酶溶液倒掉。C根據(jù)細胞數(shù)量加入一定量細胞培養(yǎng)液，用吸管吹打，使細胞脫壁制成細胞懸液Ao2）細胞培養(yǎng)A吸取一定量的細胞懸液 A,加到細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)。B向細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加至10ml含體積分數(shù)為3%£ 10%勺小牛血清的細胞培養(yǎng)液，使細胞接 種數(shù)量為5X104細胞/ml。C將細胞培養(yǎng)瓶送入培養(yǎng)箱，在（37± 1） C溫度條件及（5±0.1） %二氧化碳條件下進 行培養(yǎng)。D培養(yǎng)72h,觀察細胞形態(tài)，按照2.7.1.4步驟1）方法制備細胞懸液，進行活細胞計數(shù)。E培養(yǎng)72h后，更換不含牛血清的細胞培養(yǎng)液10ml,繼續(xù)培養(yǎng)48h,觀

10、察細胞形態(tài)，按照2.7.1.4 I .試驗步驟1）方法制備細胞懸液，進行活細胞計數(shù)。3）細胞計數(shù)A等需要計數(shù)的細胞按按照2.7.1.4步驟1）方法制備細胞懸液Bo吸取細月fi懸液B100N l轉(zhuǎn)移至離心管中，視細胞量確定是否稀釋及稀釋倍數(shù)。等蓋玻片蓋于計數(shù)板中心的計數(shù)室上方。調(diào)整計數(shù)板中的細胞數(shù)量在（100300）個。沿蓋玻片邊緣點加細胞懸液使其通過毛細作用自然滲入，不要留有氣泡，不要外溢，顯微鏡 下計數(shù)。匚觀察計數(shù)板四角大方格中的細胞數(shù)，細胞壓中線時，一般遵循“計左不計右，計上不計下”的原則。將計數(shù)板觀察細胞數(shù)代入下列公式：計數(shù)板觀察細胞數(shù)X 104 X稀釋倍數(shù)/4 =細胞數(shù)/ml2.7.1

11、.5分析結(jié)果的表述歡迎閱讀培養(yǎng)72h的細胞，細胞形態(tài)應(yīng)正常，活細胞數(shù)量應(yīng)達到 1X105個/ml以上。繼續(xù)維持培養(yǎng) 48h的細胞形態(tài)應(yīng)正常，活細胞數(shù)量應(yīng)不小于 1X105個/ml以上。2.7.2 懸浮型細胞生長試驗2.7.2.1 方法提要本試驗所用容器具及溶液均為無菌，試驗操作過程均為無菌操作。細胞在37c恒溫條件下，在細胞培養(yǎng)液中懸浮生長 72h,觀察細胞形態(tài)，進行72h細胞計 數(shù)。試劑和材料I / _1）細胞：已適應(yīng)待檢細胞培養(yǎng)基的懸浮細胞株。2）細胞培養(yǎng)液：按產(chǎn)品使用說明書要求配制；儀器1）醫(yī)用凈化工作臺：潔凈級別為百級；2）恒溫震蕩培養(yǎng)箱：能在（37 ± 1） C恒溫；3）細

12、胞培養(yǎng)瓶：250ml搖瓶，應(yīng)無菌；4）顯微鏡：倒置、相差；細胞培養(yǎng)1）用方瓶或搖瓶擴增細胞；2）離心細胞，用待測細胞培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)，計算出所需要的細胞數(shù)；3）將細胞轉(zhuǎn)至搖瓶中，細胞數(shù)量接種數(shù)量為 2.5X105個/ml,加液量20ml左右；4）將搖瓶細胞移至恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速 90100rpm,溫度37C；5）培養(yǎng)72h,記錄細胞數(shù)量和活率（采用0.4%的臺盼藍染色法計數(shù)及計算活率）。1）細胞染色：取吸管1支，伸入培養(yǎng)瓶中，輕輕反復(fù)吹打細胞懸液使細胞重懸均勻后，立 即吸細胞懸液少許，向另一離心管中滴入細胞懸液 1份，冉滴入臺盼藍染液1份，混勻，置2 3分鐘。2）計數(shù)：步驟1）進行。鏡下觀察可見細胞分散各處，健康細胞胞體完整，透明不著色， 凡著色細胞均為死細胞。記錄活細胞數(shù)及細胞總數(shù)。3）活率計算細胞活率二（活細月fi數(shù)量/細胞總