分子生物學綜述2

1、【精品文檔】如有侵權，請聯(lián)系網(wǎng)站刪除，僅供學習與交流分子生物學綜述2.精品文檔.細菌耐藥性的分子生物學機制【摘要】細菌耐藥性（Resistanceto Drug ）又稱抗藥性，系指細菌對于抗菌藥物作用的耐受性，耐藥性一旦產(chǎn)生，藥物的化療作用就明顯下降。耐藥性根據(jù)其發(fā)生原因可分為獲得耐藥性和天然耐藥性。自然界中的病原體，如細菌的某一株也可存在天然耐藥性。當長期應用抗生素時，占多數(shù)的敏感菌株不斷被殺滅，耐藥菌株就大量繁殖，代替敏感菌株，而使細菌對該種藥物的耐藥率不斷升高。目前認為后一種方式是產(chǎn)生耐藥菌的主要原因。為了保持抗生素的有性?！娟P鍵詞】生物學機制 【Abstract 】

2、Bacterial resistance is also called resistance, means the tolerance forantibacterial drug, drug resistance is produced once, chemotherapy effect of drugs is decreased. Drug resistance according to their causes can be divided into 

3、natural resistance and acquired drug resistance. Nature of thepathogens, such as bacteria, a line can also be found natural resistance.When the long-term use of antibiotics, sensitive strains accounted for the majority of the time

4、 kill, resistant strains will multiply, instead of sensitive strain, and makes the bacteria resistant to the drugs rising rate. Now thinkthe latter is the main cause of drug resistant bacteria. In order to keep

5、 thesexual antibiotics.【Key word】 Biological mechanism 隨著新的抗菌藥物的不斷出現(xiàn)和臨床應用，引起醫(yī)院感染的細菌種類也發(fā)生著變化，細菌耐藥性的發(fā)展已成為抗感染治療面臨的一個嚴重問題，特別是對多種抗生素都耐藥的多重耐藥性問題更引起人們的高度關注，現(xiàn)就耐藥性細菌產(chǎn)生的原因和機制論述如下。 耐藥性細菌產(chǎn)生的原因：（1）產(chǎn)生滅活酶和鈍化酶。細菌能產(chǎn)生可破壞抗生素或使之失去抗菌作用的酶，使藥物在作用于菌體前即被破壞或失效。（2）抗菌藥物滲透障礙 1 。細菌外層的細胞膜和細胞壁結(jié)構對阻礙抗生素進入菌體有著重要作用。膜上有親水性的藥物

6、通過蛋白，稱外膜蛋白，主要有2種:分子較大的為OmpF和分子較小的為OmpC;最近又發(fā)現(xiàn)了第三種蛋白PhoE。外膜蛋白的缺失可導致細菌耐藥性的發(fā)生，在某些細菌的外膜上還有特殊的藥物泵出系統(tǒng)，使菌體內(nèi)的藥物濃度不足以發(fā)揮抗菌作用而導致耐藥。（3）藥物使用靶位的改變。菌體內(nèi)有許多抗生素結(jié)合的靶位，細菌可通過靶位的改變使抗生素不易結(jié)合，是耐藥發(fā)生的重要機制。（4）代謝途徑改變。絕大多數(shù)細菌不能利用已有的葉酸及其衍生物，必須自行合成四氫葉酸。腸球菌屬等某些營養(yǎng)缺陷型細菌能利用外源性胸苷或胸腺嘧啶，表現(xiàn)出對磺胺和甲氧嘧啶等藥物的耐藥。 從分子生物學角度認識細菌的耐藥機制，過去主要集中在基因突變的研究中，

7、認為基因突變的積累是細菌產(chǎn)生耐藥性的重要機制。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，沒有接觸過抗生素的病原菌，對抗生素也具有抗性，耐藥性具有轉(zhuǎn)移的特點。整合子（integron）被認為是抗性基因在水平傳播的重要因子 2 ，由兩部分組成:5與3端保守區(qū)域（conserved segments，簡稱CS）以及中間的基因簇，選擇性地整合到整合子上而獲得耐藥性。通過整合子的整合作用，抗性基因之間能夠互相交換，再借助于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導與接合作用，使得耐藥性在畜禽與畜禽、畜禽與人類、人類與人類之間的病原菌上廣泛傳播，給人類健康造成嚴重威脅。1 細菌對-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥機制 -內(nèi)酰胺類抗生素為高效殺菌劑，對人的毒性極小。其中革蘭

8、陽性細菌產(chǎn)生的耐藥主要通過青霉素結(jié)合蛋白（PBP）的改變介導，而革蘭陰性細菌產(chǎn)生的耐藥則主要通過-內(nèi)酰胺酶介導。 1.1 PBP改變介導的細菌耐藥 青霉素結(jié)合蛋白（penicillin binding proteins，PBP）位于細菌細胞質(zhì)膜外壁，是細胞壁肽聚糖合成后期具有轉(zhuǎn)肽酶、轉(zhuǎn)糖苷酶及羧基肽酶等作用的一系列酶，也是-內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶點。當-內(nèi)酰胺類抗菌藥物與PBP結(jié)合后，PBP便失去酶的活性，使細胞壁的合成受到阻礙，最終造成細胞溶解、細菌死亡 3 。-內(nèi)酰胺類抗生素的抗菌活力，一是根據(jù)與PBP親和性的強弱，二是根據(jù)其對PBP及其亞型的選擇即對細菌的作用特點而決定的。PBP基因的變

9、異，使-內(nèi)酰胺類抗生素無法與之結(jié)合或結(jié)合能力降低，是形成耐藥的根本原因。PBP改變包括獲得的對抗生素低親和力的PBP和本身發(fā)生修飾導致對抗生素的親和力下降的PBP，前者主要發(fā)生在葡萄球菌中，后者主要發(fā)生在肺炎鏈球菌中。PBP按分子量的不同分為5種，每種又有若干亞型。PBP1A、PBP2X、PBP2B的基因排序已經(jīng)證明13個位點基因變異，位點變異造成PBP結(jié)構變化，使-內(nèi)酰胺類抗生素不易與之結(jié)合，使其之間的親和力下降，導致抗菌力低下。 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）對所有-內(nèi)酰胺類抗生素均耐藥，其原因是由于獲得了未知起源DNA編碼的新的耐-內(nèi)酰胺PBP，這種PBP由細菌染色體mecA基因編

10、碼，被命名為PBP2a。mecA基因的表達受多種因素的影響，包括pH、溫度、滲透性、上游調(diào)節(jié)序列和抗生素的誘導。mecA的轉(zhuǎn)錄有3種形式:非誘導持續(xù)表達型，此型MRSA缺少mecR1-mecI基因和-內(nèi)酰胺酶質(zhì)粒;即刻誘導型，此型缺少mecR1-mecI基因而具有-內(nèi)酰胺酶質(zhì)粒，通過-內(nèi)酰胺酶的調(diào)控基因來調(diào)控mecA的表達;延遲表達型，此型MRSA具有mecR1-mecI基因，其耐藥性在甲氧西林誘導后48h才能充分表達，臨床常規(guī)藥敏試驗常誤將此型菌株判斷為敏感，因此具有重要的臨床意義。 1.2 -內(nèi)酰胺酶介導的細菌耐藥 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)4種新的臨床上重要-內(nèi)酰胺酶 5 :超廣譜-內(nèi)酰胺酶（extend

11、ed-spectrum-lactamases，ESBLs）;金屬-內(nèi)酰胺酶;質(zhì)粒介導的AmpC-內(nèi)酰胺酶;OXA型-內(nèi)酰胺酶。 1.2.1 超廣譜-內(nèi)酰胺酶（ESBLs） ESBLs屬于Bush分類法的A組，最早由克雷伯菌屬和大腸埃希菌等腸桿菌科細菌產(chǎn)生，由質(zhì)粒介導，從TEM、SHV突變而來。臨床對-內(nèi)酰胺類藥物耐藥者包括青霉素類、第三代和第四代頭孢霉素以及氨曲南，但對酶抑制劑敏感。ESBLs種類最多的是TEM族酶（已超過90種）、SHV族酶（已超過25種）和CTX-M族6。 TEM族超廣譜-內(nèi)酰胺酶:TEM-1是革蘭陰性菌最常見的-內(nèi)酰胺酶。超過90%大腸埃希氏菌對氨芐西林耐藥的原因是由于其

12、產(chǎn)TEM-1。越來越多耐氨芐西林和青霉素的流感嗜血桿菌，淋病奈瑟氏球菌也產(chǎn)TEM-1。TEM-1能水解青霉素和頭孢噻吩、頭孢拉定等第一代頭孢菌素。發(fā)生在個別位點的氨基酸取代對ESBLs表型至關重要。Glu-104Lyx，Arg-164Ser/His，Gly-238Ser及Glu-240Lys7。 SHV族超廣譜-內(nèi)酰胺酶:產(chǎn)SHV-1最常見的細菌是肺炎克雷伯桿菌。肺炎克雷伯桿菌質(zhì)粒介導的氨芐西林耐藥的原因超過20%是其產(chǎn)SHV-1。Ser-238Gey及Lys-240Glu是SHV型ESBLs的最常見情況。 CTX-M族超廣譜-內(nèi)酰胺酶。近年來，一個新的質(zhì)粒介導的ESBLs家族CTX-M（以高

13、度水解頭孢噻肟為特征）的數(shù)量也在不斷增加。這類酶主要由鼠傷寒沙門菌、大腸埃希菌或腸桿菌屬某些種產(chǎn)生，包括CTX型酶和Toho-1，28。CTX-M型酶對頭孢噻肟、頭孢他啶的水解能力比對青霉素強，相對頭孢他啶來說，更優(yōu)先水解頭孢噻肟。盡管這族酶中的一些也能水解頭孢他啶，但通常不引起臨床耐藥。所有CTX-M族酶都有Ser 237 ，提示該位點對其超廣譜酶活性起重要作用10。 驅(qū)動ESBLs進化的選擇壓力通常要歸因于氧亞胺-內(nèi)酰胺類抗生素的使用強度。-內(nèi)酰胺類抗生素的強選擇壓力不僅對ESBLs基因的編碼區(qū)而且對啟動子、拷貝數(shù)以及其它基因起作用。這些改變可明顯增加菌株的耐藥水平和擴大底物譜。細菌高產(chǎn)E

14、SBLs通常是諸如啟動子上調(diào)突變，可轉(zhuǎn)座因子插入啟動子區(qū)域附近，ESBL基因拷貝數(shù)增加或產(chǎn)生2種不同的ESBLs等原因造成。目前，已發(fā)現(xiàn)不少菌株產(chǎn)ESBL同時伴有AmpC酶去阻遏突變。產(chǎn)ESBL菌株常常也對氨基糖苷類、喹諾酮類等其它類抗菌藥物耐藥。編碼ESBLs的基因常與編碼氨基糖苷類純化酶的基因在同一接合性質(zhì)粒上，因而可以一起在菌株間傳播。這意味著只使用其中一類抗菌藥物便可產(chǎn)生對2類不同藥物耐藥性的共選擇。 1.2.2 金屬-內(nèi)酰胺酶 屬于Bush分類法的B組，是一組活性部位為金屬離子，且必須依賴少數(shù)金屬離子（主要為Zn 2+ ）存在而發(fā)揮催化活性的酶類。大多數(shù)編碼金屬酶的基因序列已被確認，

15、包括來源于脆弱類桿菌的cfiA基因、臘樣芽孢桿菌的Bc-基因、嗜麥芽寡食單胞菌的L-1基因、以及銅綠假單胞桿菌及粘質(zhì)沙雷菌為主的部分革蘭陰性桿菌攜帶的IMP基因和VIM基因11。除IMP及VIM外，幾乎所有的金屬酶編碼基因都位于染色體上，其中cfiA基因和L-1基因的表達與藥物誘導有關。TMP-1基因是目前所有金屬酶基因研究的熱點，介導IMP-1基因水平傳遞的機制已基本明確，即IMP-1基因位于可移動的基因元件整合子上。一個整合子可捕獲多個基因盒（gene cassette），目前已發(fā)現(xiàn)60多種基因盒，大多為耐藥基因，除TMP-1金屬酶基因盒外，還有與-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、氯霉素及磺胺類抗菌

16、藥物耐藥有關的基因盒，新近發(fā)現(xiàn)部分超廣譜-內(nèi)酰胺酶基因也存在于整合子上，這些基因借助于整合子上的啟動子得以轉(zhuǎn)錄、表達、并可能介導細菌的多重耐藥性。 1.2.3 AmpC-內(nèi)酰胺酶 質(zhì)粒AmpC酶可見于克雷伯菌、沙門菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、奇異變形桿菌和大腸埃希菌等，常攜帶大質(zhì)粒，同時編碼對其它抗生素的耐藥性，表現(xiàn)為對第一三代頭胞菌素、頭霉素、氨基糖苷類及抗假單胞菌青霉素均耐藥，但對碳青霉烯類、四代頭孢和氟喹諾酮類敏感。現(xiàn)已報道的AmpC酶至少有25種，根據(jù)遺傳學關系，可分為5個家族:枸櫞酸桿菌起源的LAT-族（包括LAT-14、CMY-29和BIL-1）;未知起源的FOX-族（包括F

17、OX-16、CMY-1、MOX-12和CMY-8）;陰溝腸桿菌起源的Entb-族（包括MIR-1、ACT-1）;摩根菌起源的Morg-族（目前僅發(fā)現(xiàn)DHA-1一個酶）;蜂房哈夫尼起源的Haf-族（ACC-1）。產(chǎn)CMY-1和MOX-1酶的菌株對頭孢他啶的MICs比頭孢噻肟小，而其它類型的AmpC-內(nèi)酰胺酶對頭孢他啶和頭孢噻肟的MICs值相等12。 1.2.4 OXA型內(nèi)酰胺酶 OXA型內(nèi)酰胺酶以高度水解苯唑西林、氯唑西林、活性被克拉維酸僅輕微抑制為特 征。OXA型酶主要由銅綠假單胞菌產(chǎn)生，產(chǎn)賦予細菌對頭孢他啶等氧亞胺頭孢菌素高水平耐藥，當將其編碼基因轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌時則對氧亞胺頭孢菌素呈微弱耐

18、藥。OXA型酶可被氯離子強烈抑制，100mmol/L的氯離子可以完全抑制OXA型酶的活性。 OXA型酶的耐藥性與整合子有關13。大多數(shù)腸桿菌科細菌和假單孢菌中的OXA型酶位于可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上，質(zhì)粒能攜帶可移動元件轉(zhuǎn)座子。有些轉(zhuǎn)座子只編碼單個耐藥性，編碼多重耐藥的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子常常還有另一基因元件，即整合子。整合子是一個遺傳結(jié)構，可位于質(zhì)粒、染色體或轉(zhuǎn)座子上，具有整合獨立的耐藥基因盒的能力。基因盒中存在整合子可解釋為什么質(zhì)?？煞e累不同的耐藥基因，為什么OXA型酶常與其他抗生素耐藥性關聯(lián)。2 細菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥機制 氨基糖苷類抗生素因其具有濃度依賴性快速殺菌作用、與-內(nèi)酰胺類抗菌藥物產(chǎn)生協(xié)同作

19、用、細菌的耐藥性低、臨床有效和價廉等優(yōu)點，它仍是目前臨床常用藥物，廣泛用于革蘭陰性桿菌所致的敗血癥、細菌性心內(nèi)膜炎和其它嚴重感染。其作用機制是通過抑制細菌細胞膜蛋白質(zhì)的合成并改變膜結(jié)構的完整性而發(fā)揮強有力的殺菌作用。對生長繁殖旺盛的細菌，氨基糖苷類通過細菌的細胞外膜擴散后，與其內(nèi)（細胞質(zhì)）膜上具有跨膜攝取功能的一種能量依賴性（限速）轉(zhuǎn)運系統(tǒng)“I相轉(zhuǎn)運”蛋白呈低親和力結(jié)合;敏感細菌與其胞膜相連的核蛋白體30S亞基的高親和力位點上不斷集聚藥物，由此觸發(fā)第二種能量依賴性轉(zhuǎn)運系統(tǒng)“II相轉(zhuǎn)運”而明顯加速藥物在細胞內(nèi)的集聚，抑制細菌蛋白質(zhì)合成，破壞細胞質(zhì)膜結(jié)構，導致細菌內(nèi)容物外漏直至細菌死亡 14 。細

20、菌對氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生耐藥性的機制牽涉到以下幾個方面: 2.1 藥物攝取的減少 氨基糖苷類藥物主要通過寡核系統(tǒng)轉(zhuǎn)運至體內(nèi)，寡核結(jié)合蛋白（oligopeptide binding protein，OPPA）是寡核轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的重要組成部分，而大腸埃希氏菌耐卡那霉素突變株的OPPA數(shù)目明顯減少，有的突變株甚至不含OPPA。前者是因為在翻譯水平上OPPA發(fā)生了OPPA合成的減少，后者則是由于編碼OPPA的基因OPPA發(fā)生了無義突變。 2.2 酶的修飾鈍化作用 這是細菌對氨基糖苷類抗生素發(fā)生耐藥的主要機制。氨基糖苷類藥物修飾酶催化氨基糖苷類藥物氨基或羥基的共價修飾，使得氨基糖苷類藥物與核糖體的結(jié)合減少，

21、促進藥物攝取EDP-II也被阻斷，因而導致耐藥。根據(jù)反應類型，氨基糖苷類藥物修飾酶有N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（N-acetyltransferases，AAC）、0-核苷轉(zhuǎn)移酶（0-nucleotidyltransferase，ANT）和0-磷酸轉(zhuǎn)移酶（0-phosphotransferases，APH）。這些酶的基因決定族即使在沒有明顯遺傳關系的細菌種群間也能傳播。AAC以乙酰輔酶A為供體，乙?；被擒疹愃幬锏?、3、6、2位氨基，而APH和ANT兩者均以ATP為供體，APH作用于氨基糖苷類藥物的3位和4位、3和6位-OH，ANT作用于氨基糖苷類藥物的2、4位和3位、6位、9位-OH使之磷酸化，從而

22、使氨基糖苷類藥物鈍化15。3 細菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機制 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素主要通過與細菌核糖體結(jié)合，抑制細菌蛋白質(zhì)合成，而發(fā)揮抗菌作用。細菌核糖體由大亞基（50S）、小亞基（30S）構成，亞基中mRNA及蛋白質(zhì)的改變，可引起與抗菌藥物親和力的變化，而產(chǎn)生耐藥性。 3.1 靶粒修飾 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)生耐藥常常因為獲得了erm基因（紅霉素耐藥的甲基化酶），erm基因編碼產(chǎn)生的酶能將23S rRNA上一個特異性腺嘌呤殘基N6位雙甲基化，甲基化改變了核糖體的構象，通過使抗生素結(jié)合位點發(fā)生重疊而降低對抗生素的親和力。核蛋白體的甲基化亦導致對大環(huán)內(nèi)酯類和林可霉素交叉耐藥。 對各種臨床菌株運用核酸序

23、列分析和DNA-DNA雜交技術至少可以得到9種不同的erm基因，其中部分還有交叉性?？蓪⑴R床分離株劃分為4個雜交群:ermA、ermAM、ermC、ermF。不同雜交群產(chǎn)生的甲基化酶的氨基酸序列高度一致，提示它們可能來源于一個共同的親代耐藥株。 3.2 抗生素滅活與活性泵出 16 靶粒修飾是對結(jié)構不同的抗生素的耐藥，抗生素的酶滅活僅導致對結(jié)構相同藥物的耐藥。從口服紅霉素的胃腸炎患者身上可分離到對紅霉素高度耐藥的腸桿菌，這些耐藥株通過產(chǎn)生紅霉素酯酶或通過2-磷酸轉(zhuǎn)移酶催化的磷酸化反應破壞大環(huán)內(nèi)酯類藥物的酯環(huán)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)由ereA和ereB基因編碼的酯酶I和II，在對紅霉素高度耐藥的腸桿菌中亦發(fā)現(xiàn)e

24、reA和ereB的復合物（編碼rRNA甲基化酶）。另有約20%的肺炎鏈球菌和相當數(shù)量的化膿性鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥，其耐藥機制不是酶滅活作用，而是存在編碼產(chǎn)生抗生素泵出系統(tǒng)的mefE和mefA決定因子。金黃色葡萄球菌和部分凝固酶陰性葡萄球菌中msrA基因騙碼產(chǎn)生一種具有轉(zhuǎn)運功能的蛋白，導致對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥。參考文獻 1 Cui L，Ma X，Sato K，Okuma K，et al.Cell wall thickening is a common feature of vancomycin resistance in Staphylococcus aureus.J Clin Micr

25、obiol，2009，41:5. 2 Depardieu F，Reynolds PE，Courvalin P.VanD-type vancomycin-resistant Enterococcus faecium10/96A.Antimicrob Agents Chemother，2010，47:7. 3 Dasukva G J，Clrreia，Vital C，et al.Molecular characterization of bla（IMP-5），a new integron-bome metallo-beta-lactamase gene from an Acinetobacter b

26、aumannii nosocomial isolate in Portugal.FEMS Microbial Lett，2012，215:33. 4 Gniadkowski M.Evolution and epidemiology of wxtended-spectrum beta-lactamases（ESBLs）and ESBL-producing microorganisms.Clin Microbiol Infect，2011，7:597. 5 Chiosis G，Boneca IG.Selective cleavage of D-Ala-D-Lac by small molecules:re-sensitizing resistant bacteria to vancomycin.Science，2011，293（5534）:1484. 6 Akasaka T，Tanaka M，Yamaguchi A，et al.Typetopoisomerase mutations in fluroquinolone-resistant clinical strains of Psevdomonas aeruginosa isolated in1998and1999;role of target enzyme in mechanism of flu