果蠅唾腺染色體的制片與觀察

1、果蠅唾腺染色體的制片與觀察一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、 練習(xí)果蠅幼蟲唾腺分離技術(shù)及唾腺染色體的制片方法；2、 觀察果蠅的唾腺染色體。二、 實(shí)驗(yàn)原理1、 唾腺染色體：唾腺染色體是雙翅類昆蟲唾腺細(xì)胞的間期核中所看到的巨型染色體。唾腺染色體的顯著特征是：（1）形狀為帶狀，寬達(dá)5微米，長達(dá)2000微米它相當(dāng)于普通染色體的100200倍；（2）核不分裂，由于染色體不斷復(fù)制，形成了多線性染色體，寬度增加，同時(shí)長度也增加，成為巨型染色體；（3）帶的全長幾乎都有明顯的嗜堿性的橫紋，橫紋的寬度有大有小，密度有疏有密，但是它的數(shù)目，位置等等對于同源染色體來說卻都是同樣的。唾腺染色體的DNA含量達(dá)4，0008，000c。橫紋

2、被認(rèn)為是染色小粒橫向排列而成的。橫紋是詳細(xì)研究染色體的部分缺失、倒位、重復(fù)、反復(fù)、易位等現(xiàn)象的標(biāo)記；（4）由于2條同源體細(xì)胞染色體聯(lián)會，在黑腹果蠅（2n= 8）中，V形的第二染色體和第三染色體各有兩條臂，又各條染色體在異染色質(zhì)多的著絲粒附近互相靠攏，與核仁一起在核的中央形成一個(gè)染色中心。唾腺染色體的一條或幾條橫紋常顯著膨起，這部分稱為Bal- biani環(huán)。一般把多線性的巨大染色體中的這種膨大起稱為疏松結(jié)構(gòu)。許多雙翅類以及二、三種脈翅類昆蟲的食道、腸、馬氏管和神經(jīng)細(xì)胞中，以及在植物界的Rhinanthus（胡麻科）的胚盤細(xì)胞、虞美人草的反足細(xì)胞等都能看到具有這樣特征的染色體（巨大染色體或多線染

3、色體）。果蠅唾液腺：2、 果蠅三齡幼蟲的唾腺發(fā)育到一定階段后，細(xì)胞的有絲分裂停留在間期，構(gòu)成一個(gè)永久間期系統(tǒng)。唾腺細(xì)胞數(shù)目不增加，但體積增大，其中每條染色體的常染色質(zhì)區(qū)的核蛋白纖維（染色質(zhì)纖維）不斷復(fù)制，多則可達(dá)2的10次方至15次方次復(fù)制，其復(fù)制產(chǎn)物不分開，成千上萬條染色質(zhì)纖維平行而精巧地排列形成一大束寬而長的帶狀物，稱為多線染色體。由于細(xì)胞分裂停止在間期，核物質(zhì)螺旋化程度低而充分伸展，這種染色體比普通染色體大得多，寬約5um，長約2000um，是其體細(xì)胞中期染色體長度的100200倍。伸展形式的DNA長度約為40000um，只需簡單的染色和壓片，就可以很容易地在光學(xué)顯微鏡下觀察到。唾腺染色

4、體處于體細(xì)胞染色體聯(lián)會配對狀態(tài)。并且唾腺染色體經(jīng)過多次復(fù)制而并不分開，每條染色體大約有10004000根染色體絲的拷貝，經(jīng)染色后，出現(xiàn)深淺不同、密疏各別的橫紋，這些橫紋的數(shù)目和位置往往是恒定的，代表著果蠅等昆蟲的種的特征；如染色體有缺失、重復(fù)、倒位易位等，很容易在唾腺染色體上識別出來。在染色體臂上還可看到某些帶紋通過染色體的界旋、膨大形成的疏松區(qū)和巴爾比尼環(huán)，其富含轉(zhuǎn)錄出來的RNA ，因此不著色，是基因活動的區(qū)域。 在個(gè)體發(fā)育的不同階段，疏松區(qū)或巴爾比尼環(huán)在染色體上出現(xiàn)的部位不同，因此可以研究基因的表達(dá)，開展各種染色體變異的研究等等。 果蠅共有4對染色體。其中一對為性染色體（XY或XX），XX

5、染色體為頂端著絲粒染色體，呈桿狀，Y染色體為“J”形；第二對、第三對染色體均為中 央著絲粒染色體，呈“V”形；第四對染色體短小，為頂端著絲粒染色體，呈點(diǎn)狀，附在染色盤邊緣。由于唾腺染色體的假聯(lián)會，X染色體的一端在異染中心上，另一端游離；而第二對、第三對染色體著絲粒在中央，可以從異染中心呈“V”字形向外伸展出四條臂（2L、2R、3L、3R），Y染色體著絲粒附近的異染色質(zhì)參與了染色中心的形成，所以理想的片子，不管雌雄果蠅的唾腺細(xì)胞在顯微鏡下均可見五條長臂（X、2L、2R、3L、3R)和一條短臂（第四條染色體臂不易觀察）。雄果蠅唾腺細(xì)胞中的X染色體臂比雌果蠅的稍細(xì)。在染色體臂上可觀察到許多明暗相間的

6、帶。三、 材料與器材實(shí)驗(yàn)儀器：解剖鏡、顯微鏡、鑷子、解剖針、載玻片、蓋玻片、吸水紙等實(shí)驗(yàn)材料：果蠅三齡幼蟲、醋酸洋紅、生理鹽水、1M鹽酸等四、 方法與步驟1、幼蟲培養(yǎng)：置于16-18下飼養(yǎng)，當(dāng)幼蟲爬上瓶壁準(zhǔn)備化蛹前，即為三齡幼蟲，此時(shí)蟲體肥大，便于解剖，是制備唾腺染色體的最理想時(shí)期；2、幼蟲解剖：將載玻片置于解剖鏡下，滴一滴生理鹽水。將幼蟲置于生理鹽水內(nèi)，一手持解剖針按住幼蟲前端的1/3處，固定幼蟲。另一手持針撳住幼蟲頭部正中，用力向前拉，把頭部從身體拉開，腺體即隨之而出： 唾腺為半透明小囊狀，其上附有脂肪帶，食道兩側(cè)各一個(gè)。找到唾腺后盡可能把腺體上的脂肪剔除；3、染色前處理：清除脂肪體等殘?bào)w

7、，使載片上只留下唾腺；4、酸解：把腺體放入1N HCl中浸泡2-3分鐘，水洗3次；5、染色：滴上幾滴醋酸洋紅于唾腺上，染色30分鐘；6、壓片：在載片上加蓋玻片，蓋片上覆蓋一吸水紙，然后以拇指適當(dāng)用力壓片，要求將唾腺細(xì)胞核壓破，染色體伸展開來而不破碎為好；7、顯微鏡觀察：壓好的玻片標(biāo)本，用顯微鏡觀察四對染色體。五、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果染色中心染色中心可觀察到5條長臂（壓片時(shí)局部用力過大導(dǎo)致臂部分?jǐn)嗔眩喝旧w十分巨大，每條臂的橫紋有深淺、數(shù)目、疏密的不同，各個(gè)染色體中異染色質(zhì)多的著絲粒部分相互靠攏形成顏色較深的染色中心。六、 實(shí)驗(yàn)討論 制片時(shí)操作要點(diǎn)： 1、本次制片一份染色較淺，但尚可觀察到橫紋，臂伸展開

8、但由于局部用力過大導(dǎo)致臂部分?jǐn)嗔?，而另一份伸展不夠，所以，好的裝片染色適中，壓片時(shí)用力均勻適中，使五條臂充分展開而不斷裂； 2、一定要加生理鹽水，否則唾液腺容易干，影響其正常形態(tài)，進(jìn)而影響觀察。但生理鹽水不可加太多，否則幼蟲會漂浮而且活躍。如水多了，小心吸水，在剝離唾腺前吸走些，唾腺剝離后勿吸水，以防將唾腺一起吸走。；3、 避免將幼蟲腸道扯出，否則不易找到唾液腺；4、 將脂肪組織清除干凈，若脂肪真的很難去除，則可用解剖針截取一部分沒有脂肪的唾液腺細(xì)胞，不必一定要完整的唾液腺；5、 水洗鹽酸時(shí)，要洗凈，否則不易染色；6、 染色液勿過多，否則壓片時(shí)唾腺易隨染色液漂走。如染色時(shí)間到后，染色液已干，應(yīng)再少加些染色液，再蓋上蓋波片，避免氣泡產(chǎn)生；7、 染色時(shí)間不要太長，否則背景會著色，影響觀察效果；8、 用吸水紙吸取液體時(shí)，注意不要將唾液腺吸到吸水紙上。實(shí)驗(yàn)中，可傾斜載玻片，讓載玻片上的液體慢慢流下，而唾液腺粘在載玻片上游，用吸水紙?jiān)谙掠屋p輕吸取溶液。向唾液腺組織滴加染液或蒸餾水時(shí)，若滴管口距離載玻片太近，滴下液體時(shí)，由于水的表面張力作用，唾液腺會被水帶到滴管口上，可將滴管