流式細胞儀常用的幾種檢測方法

1、流式細胞儀常用的幾種檢測方法（轉(zhuǎn)載）一、測定用乙醇固定的DNA的含量1、培育細胞的DNA含量的測定制備單細胞懸液于200l的PBS緩沖液中；加入2ml預(yù)冷的70%乙醇，4保存；附:細胞固定的一般步驟1)        取單細胞懸液12×106個細胞于PBS（PH=7.2）緩沖液中；2)        300g離心5分鐘，棄上清，反復(fù)兩次；3)        重懸細胞于0.5ml PBS緩沖液中；4)

2、0;       將細胞懸液放置于23ml冷70%乙醇中，混勻，保存于4，至少30分鐘。在4條件下可保存23周。留意：²       依據(jù)試驗的要求，固定劑也可選用13%多聚甲醛；²       將乙醇作為固定劑時，乙醇應(yīng)預(yù)冷至04；²       細胞在固定時，固定劑應(yīng)緩慢滴入細胞懸液中，使固定劑的濃度緩慢增加，并不斷震搖，以免細胞成團（特殊是用乙醇固定時）。²   

3、;    300g離心5分鐘，去上清，再重懸于400l PBS中；²       顯微鏡下觀看，若有明顯的黏附，須再用篩網(wǎng)過濾；²       加入PI（含Rnase），避光孵育30分鐘；²       上機檢測。2、新穎組織的DNA含量的測定1)        用200mg濕重組織用機械法制成單細胞懸液；2)      

4、60; 500g離心5分鐘；3)        棄上清，重懸于10ml染色-去污劑中；4)        再過濾，用200目的篩網(wǎng)或7080m的篩網(wǎng)過濾；5)        上機檢測。3、石蠟包埋組織切片的DNA含量的測定1)        從石蠟包埋切取切片50 m厚，23片，制成單細胞懸液；2)      

5、;  用PBS緩沖液洗滌，500g離心5分鐘，棄上清；3)        加入PI液1ml室溫避光30分鐘；4)        調(diào)整細胞濃度為1×106/ml；5)        上機檢測。二、細胞凋亡檢測及相關(guān)分子檢測1、細胞DNA含量分布（由細胞DNA降解方式檢測細胞凋亡）²       收集已固定的單細胞懸液約5×1051

6、×106/ml；²       離心除去固定液，3ml PBS重懸細胞;²       1500rpm離心，5分鐘 ，棄去PBS；²       加PI染液1ml，室溫避光20分鐘；²       調(diào)整細胞濃度5×105/ml；²       上機檢測。2、磷脂酰絲氨酸外翻分析檢測細胞凋亡1)    

7、;    常規(guī)制備單細胞懸液,用PBS洗兩次.(若為全血要先溶                            血),取約5×106個細胞，1500rpm離心,棄上清,用400l 1×Binding Buffer重懸； 2)        分成a、b、c、d、e五管，每管約1×106個細胞a)

8、        陰性對比，不加任何試劑；b)        陽性對比,加2%多聚甲醛固定30分鐘,加AnnexinV 5l,室溫10min,用1×Binding Buffer洗一次,棄上清再加190l 緩沖液、10l PI避光15分鐘    c)        加10l PI，避光孵育15分鐘；d)        加5l Ann

9、exinV液，室溫避光孵育15min；e)        加10l PI和5l AnnexinV液，室溫避光孵育5min；3)        每管各加400l 1×Binding Buffer。4)        上機檢測。留意 a. 操作動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞；b. 操作時留意避光；c. 反應(yīng)完畢后盡快檢測，最好在一小時內(nèi)檢測。3、用單克隆抗體APO2.7檢測細胞凋亡1)   

10、     放置0.51×106個細胞到試管中；2)        室溫離心200g，6min；3)        棄上清，加入100l冷的（4）在PBSF溶液中含100µg/ml的digitonnin，輕輕地重懸細胞，在冰上孵育20min；4)        加入2ml冷的（4）PBSF液，室溫離心200g，6min；5)    

11、;    棄上清，加入20l PE標記的Apo2.7 單克隆抗體和80l PBSF液，用vortex輕輕震蕩，室溫避光孵育15分鐘；6)        加入2ml PBSF液，室溫離心200g，6min；7)        棄上清，加入1ml PBSF液重懸細胞；8)        避光保存，直到流式細胞儀檢測。        

12、PBSF：含2.5% FCS（v/v）和0.01%NaN3（w/v）的PBS。三、用流式細胞術(shù)進行DNA周期分析     1、方法：同DNA含量檢測      2、留意：單細胞濃度應(yīng)約106/ml，以免影響檢測的CV值和檢測結(jié)果；制備完成后的標本應(yīng)用光學(xué)顯微鏡檢查其質(zhì)量（如細胞是否聚集或過多碎片），以保證得到足夠的細胞含量；醛類固定會影響PI與核酸的結(jié)合。四、免疫熒光標記法1、細胞膜上的免疫熒光檢測法間接標記法1)        制備單細胞懸液；2)

13、60;       細胞計數(shù)，取出1×106個細胞于試管中；3)        用臺盼藍染色計活細胞數(shù)，要求活細胞數(shù) >9095%；4)        在試管中加入一抗，（劑量依據(jù)說明書的要求），孵育3060分鐘；5)        PBS洗滌12次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清；6)       

14、; 加入二抗，孵育2030分鐘；7)        PBS洗一次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清;8)        加300l PBS，上機檢測(若不能準時上機檢測，可加1ml 1%多聚甲醛固定，可放置1周)。直接標記法同間接標記法在試管中加入熒光標記的抗體，混勻，孵育30分鐘；用PBS洗2次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清;加300l PBS(PH=7.4)，上機檢測。2、細胞膜內(nèi)的免疫熒光標記法間接免疫熒光標記法1)    

15、;    取已制備好的單細胞懸液，用13%的多聚甲醛固定30分鐘（也可4保存過夜）；2)        用PBS洗兩次，棄上清；3)        細胞膜打孔，加入0.1%皂素 200l，室溫10分鐘；4)        用PBS洗滌兩次；5)        加入第一抗體，室溫3060分鐘，或4過夜，同時須設(shè)陰性對比或同型對比管

16、；6)        用PBS洗滌兩次；7)        加入二抗（熒光標記的抗體）室溫20分鐘，避光；8)        用PBS洗滌12次，棄上清；9)        重懸細胞于500lPBS中，上機檢測。直接熒光標記法同間接熒光標記法；加入熒光素標記好的抗體，避光30分鐘（同時做同型對比管）；用PBS洗滌次，棄上清；加300l PBS上機檢測。細胞膜

17、上及細胞內(nèi)雙標記法（直標法）1)        取出已制備好的未固定的單細胞懸液1×10 6個細胞于試管中；2)        用PBS洗滌兩次；3)        加入用熒光素標記的抗體來標記細胞膜上的抗原，同時加上陰性對比管，室溫孵育20分鐘；4)        在試管中加入13多聚甲醛1ml，固定30分鐘；5)   

18、60;    PBS洗滌兩次1500rpm 3分鐘，棄上清;6)        打孔，加入0.1皂素200l室溫10分鐘;7)        用PBS洗滌兩次，棄上清;8)        加入用熒光素標記的抗體，標記膜內(nèi)的抗原（標記膜內(nèi)的抗體的熒光素的顏色與膜上標記的熒光素的顏色務(wù)必不相同）室溫20分鐘孵育;9)        用PBS洗一遍棄上清；10)    用300lPBS重懸細胞，上機檢測五、流式細胞術(shù)中的幾點留意事項：1、對比組的設(shè)置：       在流式細胞術(shù)中所測得的量都是相對值，不是確定值。如需知道確定值時必需設(shè)置對比組樣品。對比組樣品包括有陰性對比和陽性對比。（1）、陰性對比的設(shè)置²       在試驗過程中，如做間接標記法，可設(shè)置與一抗無關(guān)的試驗，即在試驗中不加一抗而只加上帶有熒光標記的其次抗體作為陰性對比管，作為陰性對比。²