基因表達分析

1、熒光定量PCR在基因表達分析中的應(yīng)用所謂基因表達就是指在特定的時刻某種我們感愛好的基因在組織或細胞中的mRNA的表達數(shù)量。眾所周知，很多的疾?。ㄈ缒[瘤）的發(fā)生進展、很多藥物的作用機理、很多生物的代謝調(diào)控作用等都和基因表達的變化有關(guān)，因此對基因表達進行精確定量是格外重要的。過去為了對mRNA進行定量有了各種各樣的方法，如Southern 雜交、Northern 雜交、原位雜交、傳統(tǒng)PCR等，但是我們也都知道這些技術(shù)靈敏性較差，重復(fù)性不好，操作比較煩瑣，已經(jīng)無法滿足現(xiàn)在科研和檢測的需要，于是熒光定量PCR技術(shù)也就應(yīng)運而生了。熒光定量PCR技術(shù)能對核酸進行精確定量，因此大大提高了在基因表達的精確性和

2、靈敏度，深受用戶的青睞，廣泛的應(yīng)用于腫瘤爭辯、藥物篩選、功能基因組爭辯等各個領(lǐng)域，目前已經(jīng)成了很多科研文章發(fā)表的重要試驗內(nèi)容?；虮磉_分析中常見到的重要問題1、要檢測的基因 基因表達分析的目的就是檢測某種我們感愛好的基因在不同組織或細胞中的表達差異。熒光定量PCR技術(shù)可以對核酸物質(zhì)的含量進行精確的定量，也就成了爭辯基因表達差異的一把利器。在基因表達分析試驗中要檢測兩個基因，一個是目的基因和另一個是看家基因。之所以要引入看家基因是由于不能確定要比較的樣品所用的組織起始量相同。就是說比如有的老師提取正常樣品的基因時用了100個細胞，而提取病變樣品時只用了10個細胞，這時候的基因表達差異可能是由于提

3、取時候的樣品細胞數(shù)不同引起的，為了訂正這種誤差，我們選用認為在兩個樣本中表達量不變的基因作為內(nèi)參照，來去除這帶來的干擾。例如，要爭辯某個基因在腫瘤樣品和正常樣品中的基因表達差異。我們在試驗中發(fā)覺我們選擇爭辯的正常樣品中的看家基因的表達量是腫瘤樣品中的10倍，就認為正常樣品的細胞數(shù)就是腫瘤樣品細胞數(shù)的10倍，那么在腫瘤樣品中目的基因的基因表達量應(yīng)當乘以10倍，才能和正常樣品進行比較。2、計算基因表達差異基因表達差異的計算是通過所得到的Ct值來計算的，要計算兩個樣品（待測樣品和對比樣品）的目的基因的表達差異必需檢測得到4個Ct值：待測樣品和對比樣品中目的基因和看家基因的Ct值。對比樣品待測樣品 C

4、t1目的基因Ct2看家基因那么基因表達差異應(yīng)當計算為 基因表達差異=2（Ct1-Ct2）這個公式的前提是看家基因和目的基因的擴增效率相同并且都為100%。3、標準樣品的預(yù)備從理論上說基因表達分析試驗是不需要標準品的，由于無需精確定出爭辯的組織或細胞中的某種基因的真實拷貝數(shù)，我們感愛好的只是目標試驗組和對比組的某種基因表達量的比值，也就是說我們關(guān)懷的只是一個相對的數(shù)值和真實的拷貝數(shù)沒有直接的關(guān)系。那么在一些試驗中為什么還要做標準曲線呢？這是為了訂正擴增效率不同的問題。從理論上來說PCR的擴增應(yīng)當依據(jù)2的倍數(shù)向上遞增，這樣的擴增效率我們認為是100%，但是實際上的試驗不能保證擴增效率是100%，尤

5、其在不同的基因的擴增中間。由于基因表達分析試驗用到了目的基因和看家基因兩種基因，這樣這兩種基因的擴增效率會有所不同。那么假如用看家基因來校正目的基因就會帶來誤差，剛才的公式也就不再適用了。這樣考慮到看家基因和目的基因不同的擴增效率，就需要做標準曲線來精確反應(yīng)樣品管中基因的相對含量。基因表達分析標準品的預(yù)備相對比較簡潔，由于要知道的都是相對的數(shù)值（對比樣品和試驗樣品中基因表達的比值），這樣就不需要知道精確的拷貝數(shù)，所以標準品也就無須知道精確的拷貝數(shù)，只需知道稀釋的倍數(shù)就可以了。試驗中的標準品可以是來源比較豐富的細胞或組織的RNA轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。將這種cDNA進行梯度的稀釋，可以是稀釋10倍，

6、100，1000，10000等倍（具體到你的試驗要依據(jù)具體的狀況來調(diào)整稀釋倍數(shù)。最好能作一個預(yù)試驗來看看什么樣的稀釋倍數(shù)比較適合你的這種基因的擴增）。而對于各個稀釋倍數(shù)我們要對它的拷貝數(shù)進行賦值，這個值當然不是標準品中真實含有的基因數(shù)量（在基因表達分析中也不需要），而是我們依據(jù)稀釋倍數(shù)給每一個稀釋度人為賜予的拷貝數(shù)，這只是為了便利試驗最終結(jié)果的計算而已。比如我們把前面稀釋十倍的樣品賦值為10000個拷貝，100倍的賦值為1000個拷貝依次類推把10000倍的賦為10等。要留意，賦值的數(shù)目的倍數(shù)差異和你稀釋的倍數(shù)是一樣的，比如前面是10倍稀釋，后面賦值也是10倍變化。最終的試驗結(jié)果可以得到樣品的

7、拷貝數(shù)，再通過拷貝數(shù)來分析不同樣品中基因表達的倍數(shù)差異。需不需要作標準曲線要依據(jù)試驗的具體狀況來定，假如通過試驗的驗證，發(fā)覺目的基因和看家基因的擴增效率基本全都并都接近1，并且對試驗的精度要求不高的狀況下就可以不用做標準曲線，直接通過公式來計算基因的表達差異。但是假如爭辯的樣本本身的基因表達差異就不大，假如進行忽視就可能造成較大誤差，這樣就需要做標準曲線來訂正這種誤差了，作到較為精確的定量。4、接受的定量方法定量一般有兩種方法，一種是探針法，另一種是染料法，即使用SYBR Green染料。由于探針合成的成本比較高，探針設(shè)計也有肯定的難度，所以在基因表達分析中經(jīng)常接受SYBR Green染料法進

8、行熒光定量檢測。這種SYBR GreenI染色法的優(yōu)越性是使用便利，不需要針對不同的基因特地設(shè)計探針。想檢測不同的基因只用在PCR體系中加入同一種熒光物質(zhì)就可以。而且價格格外廉價。但它主要的缺點是靈敏度不夠，因此在做試驗前往往需要對試驗條件進行摸索。Stratagene熒光定量PCR儀基因表達分析解決方案Stratagene熒光定量PCR儀和配套的Mxpro軟件在處理基因表達分析方面的功能比較強大，下面進行簡要的分析。例如要分析IL1基因的表達狀況，用看家基因GAPDH作為內(nèi)參，接受的是SYBR GreenI染料法。1、板設(shè)置1.1、有特地的基因表達分析試驗?zāi)Ｊ?，打開Mxpro程序操作窗口，首

9、先彈出的對話框是要用戶選擇要進行的試驗，做基因表達分析可以選擇其次項Comparative Quantitation (Calibrator)。1.2、便利的類型選擇和孔設(shè)定。在板設(shè)置中選擇樣品的類型，可以將樣品的名稱寫成GAPDH和IL1，并將GAPDH設(shè)為看家基因（每個樣品重復(fù)三次）?？醇一蚝痛郎y基因來自同一樣本的用相同的字母來標記，假如是對比樣品則標上Calibrator。1.3、便利而快捷的反應(yīng)條件設(shè)定?？梢院芎啙嵲O(shè)定擴增反應(yīng)條件和熔解曲線條件。2、結(jié)果分析2.1、多種分析結(jié)果可供選擇擴增曲線，其中紅色表示目的基因，綠色表示看家基因（和板設(shè)置中選擇的顏色相同）標準曲線，看家基因和待測基因的標準曲線都能被作出來，并顯示出分別的擴增效率。熔解曲線，其中紅色表示目的基因，綠色表示看家基因，峰代表產(chǎn)物的Tm值的溫度，圖中可以看到看家基因和待測基因的產(chǎn)物基本具有相像的Tm值?；虮磉_差異柱壯圖顯示，程序可以自動計算出基因表達的差異，并用柱壯圖顯示出來，每一個柱表示一個樣本，基因表達的趨勢清楚可見，對比樣本被算為1。柱壯圖還可以表示成Log的形式，這樣可以清楚分開上調(diào)和下調(diào)的樣本。數(shù)據(jù)