基因表達(dá)分析

1、熒光定量PCR在基因表達(dá)分析中的應(yīng)用所謂基因表達(dá)就是指在特定的時(shí)刻某種我們感愛好的基因在組織或細(xì)胞中的mRNA的表達(dá)數(shù)量。眾所周知，很多的疾病（如腫瘤）的發(fā)生進(jìn)展、很多藥物的作用機(jī)理、很多生物的代謝調(diào)控作用等都和基因表達(dá)的變化有關(guān)，因此對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行精確定量是格外重要的。過去為了對(duì)mRNA進(jìn)行定量有了各種各樣的方法，如Southern 雜交、Northern 雜交、原位雜交、傳統(tǒng)PCR等，但是我們也都知道這些技術(shù)靈敏性較差，重復(fù)性不好，操作比較煩瑣，已經(jīng)無法滿足現(xiàn)在科研和檢測(cè)的需要，于是熒光定量PCR技術(shù)也就應(yīng)運(yùn)而生了。熒光定量PCR技術(shù)能對(duì)核酸進(jìn)行精確定量，因此大大提高了在基因表達(dá)的精確性和

2、靈敏度，深受用戶的青睞，廣泛的應(yīng)用于腫瘤爭(zhēng)辯、藥物篩選、功能基因組爭(zhēng)辯等各個(gè)領(lǐng)域，目前已經(jīng)成了很多科研文章發(fā)表的重要試驗(yàn)內(nèi)容。基因表達(dá)分析中常見到的重要問題1、要檢測(cè)的基因 基因表達(dá)分析的目的就是檢測(cè)某種我們感愛好的基因在不同組織或細(xì)胞中的表達(dá)差異。熒光定量PCR技術(shù)可以對(duì)核酸物質(zhì)的含量進(jìn)行精確的定量，也就成了爭(zhēng)辯基因表達(dá)差異的一把利器。在基因表達(dá)分析試驗(yàn)中要檢測(cè)兩個(gè)基因，一個(gè)是目的基因和另一個(gè)是看家基因。之所以要引入看家基因是由于不能確定要比較的樣品所用的組織起始量相同。就是說比如有的老師提取正常樣品的基因時(shí)用了100個(gè)細(xì)胞，而提取病變樣品時(shí)只用了10個(gè)細(xì)胞，這時(shí)候的基因表達(dá)差異可能是由于提

3、取時(shí)候的樣品細(xì)胞數(shù)不同引起的，為了訂正這種誤差，我們選用認(rèn)為在兩個(gè)樣本中表達(dá)量不變的基因作為內(nèi)參照，來去除這帶來的干擾。例如，要爭(zhēng)辯某個(gè)基因在腫瘤樣品和正常樣品中的基因表達(dá)差異。我們?cè)谠囼?yàn)中發(fā)覺我們選擇爭(zhēng)辯的正常樣品中的看家基因的表達(dá)量是腫瘤樣品中的10倍，就認(rèn)為正常樣品的細(xì)胞數(shù)就是腫瘤樣品細(xì)胞數(shù)的10倍，那么在腫瘤樣品中目的基因的基因表達(dá)量應(yīng)當(dāng)乘以10倍，才能和正常樣品進(jìn)行比較。2、計(jì)算基因表達(dá)差異基因表達(dá)差異的計(jì)算是通過所得到的Ct值來計(jì)算的，要計(jì)算兩個(gè)樣品（待測(cè)樣品和對(duì)比樣品）的目的基因的表達(dá)差異必需檢測(cè)得到4個(gè)Ct值：待測(cè)樣品和對(duì)比樣品中目的基因和看家基因的Ct值。對(duì)比樣品待測(cè)樣品 C

4、t1目的基因Ct2看家基因那么基因表達(dá)差異應(yīng)當(dāng)計(jì)算為 基因表達(dá)差異=2（Ct1-Ct2）這個(gè)公式的前提是看家基因和目的基因的擴(kuò)增效率相同并且都為100%。3、標(biāo)準(zhǔn)樣品的預(yù)備從理論上說基因表達(dá)分析試驗(yàn)是不需要標(biāo)準(zhǔn)品的，由于無需精確定出爭(zhēng)辯的組織或細(xì)胞中的某種基因的真實(shí)拷貝數(shù)，我們感愛好的只是目標(biāo)試驗(yàn)組和對(duì)比組的某種基因表達(dá)量的比值，也就是說我們關(guān)懷的只是一個(gè)相對(duì)的數(shù)值和真實(shí)的拷貝數(shù)沒有直接的關(guān)系。那么在一些試驗(yàn)中為什么還要做標(biāo)準(zhǔn)曲線呢？這是為了訂正擴(kuò)增效率不同的問題。從理論上來說PCR的擴(kuò)增應(yīng)當(dāng)依據(jù)2的倍數(shù)向上遞增，這樣的擴(kuò)增效率我們認(rèn)為是100%，但是實(shí)際上的試驗(yàn)不能保證擴(kuò)增效率是100%，尤

5、其在不同的基因的擴(kuò)增中間。由于基因表達(dá)分析試驗(yàn)用到了目的基因和看家基因兩種基因，這樣這兩種基因的擴(kuò)增效率會(huì)有所不同。那么假如用看家基因來校正目的基因就會(huì)帶來誤差，剛才的公式也就不再適用了。這樣考慮到看家基因和目的基因不同的擴(kuò)增效率，就需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線來精確反應(yīng)樣品管中基因的相對(duì)含量。基因表達(dá)分析標(biāo)準(zhǔn)品的預(yù)備相對(duì)比較簡(jiǎn)潔，由于要知道的都是相對(duì)的數(shù)值（對(duì)比樣品和試驗(yàn)樣品中基因表達(dá)的比值），這樣就不需要知道精確的拷貝數(shù)，所以標(biāo)準(zhǔn)品也就無須知道精確的拷貝數(shù)，只需知道稀釋的倍數(shù)就可以了。試驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)品可以是來源比較豐富的細(xì)胞或組織的RNA轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。將這種cDNA進(jìn)行梯度的稀釋，可以是稀釋10倍，

6、100，1000，10000等倍（具體到你的試驗(yàn)要依據(jù)具體的狀況來調(diào)整稀釋倍數(shù)。最好能作一個(gè)預(yù)試驗(yàn)來看看什么樣的稀釋倍數(shù)比較適合你的這種基因的擴(kuò)增）。而對(duì)于各個(gè)稀釋倍數(shù)我們要對(duì)它的拷貝數(shù)進(jìn)行賦值，這個(gè)值當(dāng)然不是標(biāo)準(zhǔn)品中真實(shí)含有的基因數(shù)量（在基因表達(dá)分析中也不需要），而是我們依據(jù)稀釋倍數(shù)給每一個(gè)稀釋度人為賜予的拷貝數(shù)，這只是為了便利試驗(yàn)最終結(jié)果的計(jì)算而已。比如我們把前面稀釋十倍的樣品賦值為10000個(gè)拷貝，100倍的賦值為1000個(gè)拷貝依次類推把10000倍的賦為10等。要留意，賦值的數(shù)目的倍數(shù)差異和你稀釋的倍數(shù)是一樣的，比如前面是10倍稀釋，后面賦值也是10倍變化。最終的試驗(yàn)結(jié)果可以得到樣品的

7、拷貝數(shù)，再通過拷貝數(shù)來分析不同樣品中基因表達(dá)的倍數(shù)差異。需不需要作標(biāo)準(zhǔn)曲線要依據(jù)試驗(yàn)的具體狀況來定，假如通過試驗(yàn)的驗(yàn)證，發(fā)覺目的基因和看家基因的擴(kuò)增效率基本全都并都接近1，并且對(duì)試驗(yàn)的精度要求不高的狀況下就可以不用做標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接通過公式來計(jì)算基因的表達(dá)差異。但是假如爭(zhēng)辯的樣本本身的基因表達(dá)差異就不大，假如進(jìn)行忽視就可能造成較大誤差，這樣就需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線來訂正這種誤差了，作到較為精確的定量。4、接受的定量方法定量一般有兩種方法，一種是探針法，另一種是染料法，即使用SYBR Green染料。由于探針合成的成本比較高，探針設(shè)計(jì)也有肯定的難度，所以在基因表達(dá)分析中經(jīng)常接受SYBR Green染料法進(jìn)

8、行熒光定量檢測(cè)。這種SYBR GreenI染色法的優(yōu)越性是使用便利，不需要針對(duì)不同的基因特地設(shè)計(jì)探針。想檢測(cè)不同的基因只用在PCR體系中加入同一種熒光物質(zhì)就可以。而且價(jià)格格外廉價(jià)。但它主要的缺點(diǎn)是靈敏度不夠，因此在做試驗(yàn)前往往需要對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行摸索。Stratagene熒光定量PCR儀基因表達(dá)分析解決方案Stratagene熒光定量PCR儀和配套的Mxpro軟件在處理基因表達(dá)分析方面的功能比較強(qiáng)大，下面進(jìn)行簡(jiǎn)要的分析。例如要分析IL1基因的表達(dá)狀況，用看家基因GAPDH作為內(nèi)參，接受的是SYBR GreenI染料法。1、板設(shè)置1.1、有特地的基因表達(dá)分析試驗(yàn)?zāi)Ｊ剑蜷_Mxpro程序操作窗口，首

9、先彈出的對(duì)話框是要用戶選擇要進(jìn)行的試驗(yàn)，做基因表達(dá)分析可以選擇其次項(xiàng)Comparative Quantitation (Calibrator)。1.2、便利的類型選擇和孔設(shè)定。在板設(shè)置中選擇樣品的類型，可以將樣品的名稱寫成GAPDH和IL1，并將GAPDH設(shè)為看家基因（每個(gè)樣品重復(fù)三次）?？醇一蚝痛郎y(cè)基因來自同一樣本的用相同的字母來標(biāo)記，假如是對(duì)比樣品則標(biāo)上Calibrator。1.3、便利而快捷的反應(yīng)條件設(shè)定?？梢院芎?jiǎn)潔設(shè)定擴(kuò)增反應(yīng)條件和熔解曲線條件。2、結(jié)果分析2.1、多種分析結(jié)果可供選擇擴(kuò)增曲線，其中紅色表示目的基因，綠色表示看家基因（和板設(shè)置中選擇的顏色相同）標(biāo)準(zhǔn)曲線，看家基因和待測(cè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線都能被作出來，并顯示出分別的擴(kuò)增效率。熔解曲線，其中紅色表示目的基因，綠色表示看家基因，峰代表產(chǎn)物的Tm值的溫度，圖中可以看到看家基因和待測(cè)基因的產(chǎn)物基本具有相像的Tm值。基因表達(dá)差異柱壯圖顯示，程序可以自動(dòng)計(jì)算出基因表達(dá)的差異，并用柱壯圖顯示出來，每一個(gè)柱表示一個(gè)樣本，基因表達(dá)的趨勢(shì)清楚可見，對(duì)比樣本被算為1。柱壯圖還可以表示成Log的形式，這樣可以清楚分開上調(diào)和下調(diào)的樣本。數(shù)據(jù)