藥物代謝酶和藥物作用靶點

1、藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術(shù)指南(試行)前言藥物體內(nèi)代謝、轉(zhuǎn)運及藥物作用靶點基因的遺傳變異及其表達水平的變化可通過影響藥物的體內(nèi)濃度和敏感性，導(dǎo)致藥物反應(yīng)性個體差異。近年來隨著人類基因組學(xué)的發(fā)展，藥物基因組學(xué)領(lǐng)域得到了迅猛發(fā)展，越來越多的藥物基因組生物標(biāo)記物及其檢測方法相繼涌現(xiàn)。藥物基因組學(xué)已成為指導(dǎo)臨床個體化用藥、評估嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險、指導(dǎo)新藥研發(fā)和評價新藥的重要工具，部分上市的新藥僅限于特定基因型的適應(yīng)癥患者。美國FDA已批準(zhǔn)在140余種藥物的藥品標(biāo)簽中增加藥物基因組信息，涉及的藥物基因組生物標(biāo)記物42個。此外，部分行業(yè)指南也將部分非FDA批準(zhǔn)的生物標(biāo)記物及其特性（如MGM

2、T基因甲基化）的檢測列入疾病的治療指南。藥物反應(yīng)相關(guān)基因及其表達產(chǎn)物的分子檢測是實施個體化藥物治療的前提。藥理學(xué)與遺傳學(xué)結(jié)合的關(guān)鍵環(huán)節(jié)包括藥物代謝動力學(xué)（pharmacokinetics，PK）和藥物效應(yīng)動力學(xué)（pharmacodynamics，PD）兩方面。藥物代謝動力學(xué)主要是定量研究藥物在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律，側(cè)重于闡明藥物的體內(nèi)過程；藥物效應(yīng)動力學(xué)主要研究藥物對機體的作用、作用規(guī)律及作用機制，其內(nèi)容包括藥物與作用靶位之間相互作用所引起的生化、生理學(xué)和形態(tài)學(xué)變化，側(cè)重于解釋藥物如何與作用靶點發(fā)生作用。對藥物代謝酶和藥物靶點基因進行檢測可指導(dǎo)臨床針對特定的患者選擇合適的藥物和給

3、藥劑量，實現(xiàn)個體化用藥，從而提高藥物治療的有效性和安全性，防止嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)的發(fā)生。目前美國FDA和我國食品藥品監(jiān)督管理局（CFDA）都已批準(zhǔn)了一系列的個體化用藥基因診斷試劑盒。這些試劑盒基本都是對人DNA樣本進行基因檢測。而在基因表達的檢測方面，由于RNA的穩(wěn)定性差，樣本處置不當(dāng)可導(dǎo)致目標(biāo)RNA降解，使得檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，影響臨床判斷。因此，RNA檢測試劑的研發(fā)相對滯后。本指南旨在為個體化用藥基因檢測提供一致性的方法。本指南中所指的藥物基因組生物標(biāo)志物不包括影響抗感染藥物反應(yīng)性的微生物基因組變異。此外，腫瘤靶向治療藥物個體化醫(yī)學(xué)檢測指南見腫瘤個體化治療的檢測技術(shù)指南。本指南起草單位：中南大學(xué)

4、湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所、中南大學(xué)臨床藥理研究所、中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)檢驗所，并經(jīng)國家衛(wèi)生計生委個體化醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)專家委員會、中國藥理學(xué)會藥物基因組學(xué)專業(yè)委員會、中國藥理學(xué)會臨床藥理學(xué)專業(yè)委員會和中華醫(yī)學(xué)會檢驗分會組織修訂。本指南起草人：周宏灝、陳小平、張偉、劉昭前、尹繼業(yè)、李智、李曦、唐潔、俞競、彭靜波、曹杉、成瑜。 目 錄1.本指南適用范圍12.藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測概述13.標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語14.藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測分析前質(zhì)量保證64.1采樣前準(zhǔn)備64.2標(biāo)本采集74.3標(biāo)本的運輸與保存94.4標(biāo)本的接收與保存95.藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測分析中質(zhì)量保證105.1實驗室設(shè)

5、計要求105.2檢測方法115.3儀器設(shè)備的使用、維護與保養(yǎng)175.4人員培訓(xùn)175.5檢測體系的性能驗證186.藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測分析后質(zhì)量保證196.1.檢測報告、解釋及報告發(fā)放196.2檢測后樣本的保存和處理237.藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測的質(zhì)量保證237.1 檢測確認(rèn)和特征描述247.2可操作性的SOP編寫247.3質(zhì)控品與室內(nèi)質(zhì)控247.4室內(nèi)質(zhì)控的評價267.5室間質(zhì)量評價268.制度27附錄A. 基因及突變名稱、核酸信息28附錄B. 縮略語30附錄C. 藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測項目列舉33附錄D. 藥物代謝酶和藥物作用靶點基因相關(guān)的藥物50參考文獻5

6、2551. 本指南適用范圍本指南由國家衛(wèi)生計生委個體化醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)專家委員會制定，旨在為臨床檢驗實驗室進行藥物代謝酶和藥物靶點基因的檢測提供指導(dǎo)。本指南的主要適用對象為開展個體化醫(yī)學(xué)分子檢測的醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室。2. 藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測概述藥物代謝酶和藥物作用靶點基因特性的變化可通過影響藥物的體內(nèi)濃度和靶組織對藥物的敏感性，導(dǎo)致藥物反應(yīng)性（包括藥物的療效和不良反應(yīng)發(fā)生）個體差異。藥物基因組生物標(biāo)志物的檢測是臨床實施個體化藥物治療的前提。從藥物代謝酶和藥物作用靶點基因出發(fā)，對個體化用藥基因檢測的適應(yīng)人群、標(biāo)本采集、運輸、接收、處理、樣本檢測、結(jié)果報告與解釋、室內(nèi)室間質(zhì)控需遵循的基本

7、原則，以及可能出現(xiàn)的問題與應(yīng)對措施等方面的內(nèi)容進行介紹，可為基于藥物代謝酶和藥物作用靶點的基因檢測提供標(biāo)準(zhǔn)化指導(dǎo)。3. 標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語3.1 Ct值（threshold cycle）熒光定量PCR反應(yīng)的熒光強度超過設(shè)定的閾值所需的循環(huán)數(shù)。Ct值位于PCR反應(yīng)的指數(shù)期初期，與標(biāo)本中待測核酸分子的原始拷貝數(shù)呈反比，即樣本中原始拷貝數(shù)越多，熒光強度升高的就越快，相應(yīng)的Ct值就越小。3.2 RNA（ribonucleic acid）核糖核酸，與DNA類似的單鏈核酸，由核糖核苷酸按照一定的順序排列而成，含尿嘧啶而不含胸腺嘧啶，存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，在細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成及其他化學(xué)活動中起重要的作用。RNA分子包

8、含信使RNA（mRNA）、轉(zhuǎn)運RNA（tRNA）、核糖體RNA（rRNA）和其他小RNA等多種類型，分別行使不同的功能。各種RNA的混合物稱為總RNA。3.3 rs和ss體系SNP由美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）建立、dbSNP數(shù)據(jù)庫制定的SNP命名體系，rs體系的SNP代表已獲得官方認(rèn)可和推薦的參考SNP（reference SNP），ss體系的SNP代表用戶新遞交但尚未得到認(rèn)可的SNP（submitted SNP）。 3.4 TE緩沖液TE緩沖液由Tris和EDTA配置而成，主要用于溶解DNA

9、，能穩(wěn)定儲存DNA。 3.5錯配修復(fù)（mismatch repair，MMR）在含有錯配堿基的DNA分子中，使正常核苷酸序列恢復(fù)的核甘酸修復(fù)方式，這種類型的修復(fù)可糾正DNA雙螺旋上錯配的堿基對，還可修復(fù)因復(fù)制打滑而產(chǎn)生的核苷酸插入或缺失。MMR的過程需要區(qū)分母鏈和子鏈，做到只切除子鏈上錯誤的核苷酸，而不會切除母鏈上的正常核苷酸。修復(fù)的過程是：識別出正確的鏈，切除掉不正確的部分，然后通過DNA聚合酶III和DNA連接酶的作用，合成正確配對的雙鏈DNA。3.6單核苷酸多態(tài)性（SNP）是指由單個核苷酸A、T、C或G的改變而引起的DNA序列的改變，造成包括人類在內(nèi)的物種之間染色體基因組的多樣性。3.7

10、等位基因一般是指位于一對同源染色體相同位置上控制某一性狀的不同形態(tài)的一對基因。若成對的等位基因中兩個成員完全相同，則該個體對此性狀來說是純合子。若兩個等位基因各不相同，則該個體對該性狀來說是雜合子。3.8 5-氟尿嘧啶一種嘧啶類似物，作為胸苷酸合成酶抑制劑，阻斷DNA復(fù)制的必需原料胸腺嘧啶的合成。主要用于腫瘤的治療。3.9光密度表示紫外光照射下被檢測物吸收的光密度，260nm波長下的吸光值（DNA吸收峰值）可用來表示DNA的相對濃度，具體換算公式為：DNA濃度（ng/ml）=OD260 X 50 X 稀釋倍數(shù)。3.10基因芯片將大量（通常每平方厘米點陣密度高于400）的核酸探針分子固定于支持物

11、上并與標(biāo)記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。3.11基因是遺傳物質(zhì)的最小功能單位，是指具有一定生物學(xué)意義的一段DNA。3.12基因型又稱遺傳型，是某一生物個體全部基因組合的總稱，它反映生物體的遺傳構(gòu)成，即從雙親獲得的全部基因的總和。據(jù)估計，人類的結(jié)構(gòu)基因有3萬個。因此，整個生物的基因型是無法表示的，遺傳學(xué)中具體使用的基因型，往往是指某一性狀的基因型。3.13基因組生物標(biāo)志物是一種可用于指示正常生物學(xué)過程、病理過程和/或?qū)χ委熂捌渌深A(yù)措施反應(yīng)性的可測量的DNA或RNA特性。其中DNA的特性可包括但不僅限于單核苷酸多態(tài)性、短序列重復(fù)次數(shù)多態(tài)性

12、、單倍型、DNA修飾如甲基化、核苷酸的插入/缺失、拷貝數(shù)變異及細(xì)胞遺傳學(xué)重排如轉(zhuǎn)位、重復(fù)、缺失或反轉(zhuǎn)。RNA特性包括但不僅限于RNA序列、RNA表達水平、RNA處理過程（如剪接和編輯）、微小RNA。3.14檢出限（limit of detection，LOD）標(biāo)本中一種分析物可被檢出的最低的含量，這一分析物含量可能不是量化的具體數(shù)值。3.15健康保險隱私及責(zé)任法案（health insurance portability and accountability act，HIPAA）美國政府1996年頒布的、醫(yī)療服務(wù)行業(yè)必須遵守的法案。該法案制定了一系列安全標(biāo)準(zhǔn)，就保健計劃、供應(yīng)商及結(jié)算中心如何以

13、電子文件的形式傳送、訪問和存儲受保護的健康信息做出了詳細(xì)的規(guī)定。3.16聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）簡稱PCR技術(shù)，是一種體外擴增特異DNA片段的技術(shù)，應(yīng)用該技術(shù)可以在短時間內(nèi)將一個或幾個DNA拷貝擴增到百萬數(shù)量級。3.17臨床檢驗實驗室是指對取自人體的各種標(biāo)本進行生物學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、化學(xué)、血液免疫學(xué)、血液學(xué)、生物物理學(xué)、細(xì)胞學(xué)等檢驗，并為臨床提供醫(yī)學(xué)檢驗服務(wù)的實驗室。3.18靈敏度（sensitivity）測量系統(tǒng)的示值變化除以相應(yīng)的被測量值變化所得的商。3.19室內(nèi)質(zhì)量控制實驗室內(nèi)進行的用于滿足質(zhì)量要求的操作技術(shù)和活動。3.20室間質(zhì)量評

14、價室間質(zhì)量評價是多家實驗室分析同一標(biāo)本，并由外部獨立機構(gòu)收集和反饋實驗室上報結(jié)果、評價實驗室操作的過程，也稱能力驗證。3.21脫氧核糖核酸（DNA）核酸的一種，是由特殊序列的脫氧核糖核苷酸單元（dNTP）構(gòu)成的多聚核苷酸，起攜帶遺傳信息的功能。DNA為一種雙鏈分子，通過核苷酸堿基對間的氫鍵維系。DNA包含的4種核苷酸包括：腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（G）。人類存在兩種類型的DNA：來自染色體的基因組DNA（gDNA）和線粒體DNA。3.22能力驗證（proficiency testing，PT）多個標(biāo)本周期性地發(fā)送到實驗室進行分析和（或）鑒定，將每一實驗室的結(jié)果與同組的

15、其他實驗室的結(jié)果或指定值進行比較，并將比較結(jié)果報告給參與的實驗室，同室間質(zhì)量評價。3.23生物標(biāo)記物（biomarker）患者標(biāo)本中所含有的一種特殊的分析物質(zhì)（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)等），可用于疾病診斷、判斷疾病分期或評價新藥或新療法在目標(biāo)人群中的安全性和有效性。3.24微衛(wèi)星指基因上含有重復(fù)的DNA短小序列或單核苷酸的區(qū)域，每個單元長度在1-6 bp之間。根據(jù)重復(fù)單元的構(gòu)成與分布，微衛(wèi)星DNA序列可分為3種類型：單一型、復(fù)合型和間斷型。3.25微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）是指腫瘤基因組特定的微衛(wèi)星位點與其對應(yīng)的非腫瘤基因組相比，因重復(fù)單位的

16、缺失或插入而造成的結(jié)構(gòu)性等位基因的大小發(fā)生改變，出現(xiàn)新的微衛(wèi)星等位基因現(xiàn)象。3.26線性在已知的范圍內(nèi)，某檢測提供的結(jié)果能夠直接與標(biāo)本的濃度（或量值）成比例關(guān)系的能力。3.27相對定量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法和CT值比較法測定目的基因的相對表達量，以比較兩個或多個樣本中目的基因的表達差異。該方法通常用來檢測基因表達量是上調(diào)還是下降。3.28遺傳藥理學(xué)研究機體的基因多態(tài)性對藥物反應(yīng)個體差異的影響，是藥物基因組學(xué)的重要內(nèi)容。3.29藥物不良反應(yīng)（adverse drug reaction, ADR）是指上市的合格藥品在常規(guī)用法、用量情況下出現(xiàn)的，與用藥目的無關(guān)，并給患者帶來痛苦或危害的反應(yīng)。3.30藥物的反

17、應(yīng)性包括藥物吸收和分布（即藥代動力學(xué)）、藥物效應(yīng)（如藥物效應(yīng)動力學(xué)）、藥物的療效及藥物不良反應(yīng)。3.31藥物基因組學(xué)研究人類基因組信息與藥物反應(yīng)之間的關(guān)系，同時也可以發(fā)現(xiàn)藥物新靶點和提高臨床試驗的成功率。3.32熒光定量PCR通過應(yīng)用熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物進行標(biāo)記跟蹤，實時監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對熒光信號進行分析，實現(xiàn)基因檢測的定性和（或）定量分析。3.33熒光原位雜交（FISH）一種細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，可以用來對核酸進行檢測和定位。熒光標(biāo)記的核酸探針只與具有高度相似性的核酸雜交，可用于染色體上基因的定位和定量。3.34雜交兩個以上的分子具有相近的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性

18、質(zhì)而在適宜的條件下形成雜交體，雜交體中的分子不是來自一個二聚體分子。利用兩條不同來源的多核苷酸鏈之間的互補性而使它們形成雜交體雙鏈被稱為核酸雜交。3.35知情同意（informed consent）患者有權(quán)利知曉自己的病情，并可以對醫(yī)務(wù)人員所采取的治療措施和臨床檢測項目有決定取舍的權(quán)利。3.36控制品僅用于質(zhì)量控制目的而不是用于校準(zhǔn)分析的標(biāo)本或溶液。3.37準(zhǔn)確度（accuracy） 是測量結(jié)果中系統(tǒng)誤差與隨機誤差的綜合，表示測量結(jié)果與真值的一致程度。3.38 正確度（trueness）無窮多次重復(fù)測量所得量值的平均值與一個參考量值間的一致程度。3.39 精密度（precision）是指在一定

19、條件下進行多次測定時，所得測定結(jié)果之間的符合程度，表示測量結(jié)果中的隨機誤差大小的程度。3.40 特異性（specificity） 在出現(xiàn)干擾現(xiàn)象（影響量）時，試驗或檢測程序能夠正確地識別或定量確定某一實體物質(zhì)的能力。4. 藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測分析前質(zhì)量保證根據(jù)臨床檢驗實驗室的條件確定合適的分子診斷項目和恰當(dāng)?shù)臉颖咎幚硎谴_保核酸定性定量檢測準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。標(biāo)本在檢測前必須確保標(biāo)本的采集、運輸和儲存符合要求。標(biāo)本處置不當(dāng)可能引起核酸降解，導(dǎo)致定量檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。4.1 采樣前準(zhǔn)備1）分子診斷項目的申請與完善藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測采樣前需填寫規(guī)范的申請單，申請單應(yīng)包含足夠的信息，

20、以識別患者和有資格開具申請單的臨床醫(yī)生。臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)臨床需求合理選擇分子診斷項目。個體化用藥領(lǐng)域發(fā)展迅速，臨檢實驗室應(yīng)加強與臨床醫(yī)師的溝通，及時指導(dǎo)臨床醫(yī)師選擇有價值的診斷項目，幫助醫(yī)師合理解釋檢驗結(jié)果；不斷接受正確合理的臨床醫(yī)師的反饋意見，及時了解臨床對個體化用藥分子檢測的需求，優(yōu)化項目目錄。實驗室應(yīng)根據(jù)其具體的工作流程，確定質(zhì)量監(jiān)測指標(biāo)，如患者診斷信息完整率、適當(dāng)臨床判斷率等，并定期對數(shù)據(jù)進行回顧性分析，定期對檢驗申請進行評審。2）患者的正確識別及知情同意患者的正確識別是確保獲得正確的臨床標(biāo)本的前提。收集標(biāo)本的容器上應(yīng)注明患者的信息，通常應(yīng)包括姓名、送檢醫(yī)院及科室、住院號等。醫(yī)護人員在采

21、樣前需首先核對確定患者的身份，核實能標(biāo)示患者的信息。標(biāo)本收集前應(yīng)向患者介紹個體化用藥基因檢測的意義，以得到患者的認(rèn)同，即知情同意。采樣前需告知患者所檢測項目的目的、意義、基本過程、項目可能存在的不足如檢測結(jié)果可能出現(xiàn)與臨床用藥實際不相符的情況、剩余核酸的去向（包括可能匿名用于科研項目）及保存時間，保護受檢者的個人隱私（包括醫(yī)療記錄和醫(yī)療數(shù)據(jù)）。對實施有創(chuàng)檢查的分子診斷項目如穿刺取活檢組織，應(yīng)清楚地告知患者及家屬檢查可能遇到的風(fēng)險和緊急情況下的緊急預(yù)案。知情同意書是醫(yī)方履行如實告知義務(wù)的證據(jù)，也是患者行使選擇權(quán)的書面依據(jù)。3）送檢單的填寫與項目的復(fù)核標(biāo)本采集前需填寫送檢申請單，提供受檢者必需的信

22、息。申請單需填寫的信息包括：申請的檢測項目、標(biāo)本編號、受檢者姓名、性別、出生日期、民族、采樣日期及時間、標(biāo)本來源（組織類型）、相關(guān)臨床資料（如身高、體重、疾病診斷、疾病分型分期、合并疾病、用藥情況）、采樣單位及科室名稱、送檢醫(yī)師姓名等信息。臨檢實驗室應(yīng)有專業(yè)人員根據(jù)信息采集表對檢測項目的合理性進行審核，必要時可與送檢醫(yī)師討論。4.2 標(biāo)本采集臨床分子診斷實驗室應(yīng)對各種個體化用藥分子診斷臨床標(biāo)本的采集按檢測要求建立SOP。標(biāo)本采集人員應(yīng)經(jīng)過系統(tǒng)的培訓(xùn)。采樣前應(yīng)對標(biāo)本采集容器進行評價，確保容器本身不會干擾測定過程，并保存評估記錄。用于藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測的標(biāo)本在采集時間上無特殊要求。靜

23、脈血液采集之前應(yīng)按要求對預(yù)采血的部位徹底消毒。腫瘤組織中DNA的分析利用常規(guī)診斷所用的標(biāo)本即可，但用于RNA分析的標(biāo)本需專門采集，并準(zhǔn)備好液氮等速凍所需的材料及設(shè)備。標(biāo)本采集需要在密閉、一次性采樣系統(tǒng)中完成，所用的材料如注射器、棉簽、拭子等應(yīng)為一次性使用，以防止污染。無論采集哪種類型的標(biāo)本，采樣時都必須戴手套，以避免標(biāo)本中病原微生物感染和皮膚脫落細(xì)胞對標(biāo)本的污染。用于藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測的標(biāo)本類型有多種，包括全血標(biāo)本、組織標(biāo)本（新鮮組織、冰凍組織、石蠟包埋組織、穿刺標(biāo)本）、口腔拭子、骨髓、胸腹水等。樣本采樣原則見個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南。1）全血和骨髓標(biāo)本全血標(biāo)本采集到含有適當(dāng)抗

24、凝劑或添加物的采樣管中，添加物根據(jù)被測量（DNA、細(xì)胞內(nèi)RNA）、檢測項目和采樣體積而定。因肝素可抑制PCR，全血或骨髓標(biāo)本一般用EDTA或枸櫞酸鹽抗凝。采樣前需在采樣管或注射器上標(biāo)注標(biāo)本信息。全血標(biāo)本采集外周靜脈血23 mL并置于采血管中，將采血管輕輕顛倒混勻數(shù)次以確保充分抗凝，避免溶血。如檢測目的是細(xì)胞內(nèi)RNA，建議用含RNA穩(wěn)定劑的采樣管，或采樣后盡快將全血或骨髓加入到RNA穩(wěn)定溶液中。采集干血斑標(biāo)本時，可向無菌濾紙上滴加約50 mL全血，根據(jù)需要可連續(xù)在數(shù)個印圈上滴加標(biāo)本，于室溫自然干燥至少4小時。干血斑標(biāo)本采集時不要堆疊血斑，不與其他界面接觸，待血斑充分干燥后應(yīng)放入無菌袋中，避免血斑

25、之間的相互污染，同時加入干燥劑和濕度指示卡，密封包裝后運送。2）組織標(biāo)本當(dāng)待檢測的組織與血液或口腔脫落細(xì)胞基因型不一致時，或當(dāng)組織是待測核酸必須的來源時（如檢測腫瘤組織中mRNA表達、融合基因、基因擴增或缺失、甲基化水平、微衛(wèi)星不穩(wěn)定等），需采集組織標(biāo)本進行檢測?？捎玫慕M織標(biāo)本包括新鮮組織、活檢組織、石蠟包埋組織和石蠟切片。a) 新鮮組織和活檢組織：采樣大小取決于組織類型。一般而言，無論是哪種組織類型，在沒有大量脂肪細(xì)胞侵潤的情況下，10 mg組織標(biāo)本可提取DNA或RNA 10 mg。無菌條件下取米粒大小手術(shù)或活檢組織（約25 mg）；腫瘤組織要求未壞死腫瘤組織比例>70。穿刺取實體腫瘤

26、組織時，取得的細(xì)胞數(shù)與穿刺針的粗細(xì)有關(guān)，21G細(xì)針每次獲得³100個細(xì)胞，19G細(xì)針每次獲得³150個細(xì)胞，支氣管活檢每次獲得³300個細(xì)胞，CT介導(dǎo)的細(xì)針穿刺每次可獲得³500個細(xì)胞。通常檢測時標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量需達到200400個。在某些情況下，要求同時采集無病變的組織或外周血作為對照（如微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測）。組織塊取樣后的處理與保存見個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南。b) 石蠟包埋組織：推薦用10中性緩沖甲醛溶液固定組織標(biāo)本，避免使用含重金屬離子的固定液如Bouin液等。甲醛介導(dǎo)的DNA損傷在固定3小時后明顯發(fā)生，且時間越長，DNA損傷越嚴(yán)重。因此推薦

27、較小的組織（如活檢組織標(biāo)本）固定612小時，較大的組織（如手術(shù)切除標(biāo)本）固定648小時。甲醛固定的石蠟包埋組織不適于用作RNA檢測，但在沒有其他標(biāo)本可供選擇時，可考慮選擇沒有污染部分提取的RNA用于檢測，待測RNA序列的長度最好<130 bp。組織標(biāo)本切片時應(yīng)特別注意避免標(biāo)本間的交叉污染。c) 組織切片：用于DNA檢測時，手術(shù)標(biāo)本需提供10 m厚的石蠟切片48張，面積為成人拇指蓋大小；活檢穿刺標(biāo)本提供10 m厚切片810張。所有切片均為白片。腫瘤組織切片應(yīng)在HE染色后，經(jīng)病理醫(yī)師顯微鏡下觀察，以判斷是否含有腫瘤細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的數(shù)量是否足夠（一般要求>50）、壞死組織比例<10

28、，并在對應(yīng)的白片上畫出癌巢，對腫瘤細(xì)胞密集區(qū)域進行標(biāo)注。DNA測序法要求腫瘤細(xì)胞至少占組織細(xì)胞的50。應(yīng)采取措施避免核酸交叉污染，制備不同患者病理切片標(biāo)本時，需更換新刀片。3）口腔脫落細(xì)胞口腔脫落細(xì)胞可同時用于DNA和RNA分析。常用的是口腔拭子，患者清水漱口后，將消毒醫(yī)用棉簽伸進口腔，在口腔內(nèi)側(cè)臉頰粘膜處左右反復(fù)擦拭20次左右，取出棉簽，將棉簽置于干凈濾紙上陰干，每位受檢者至少采集棉簽3根。棉簽立即放入干凈封口塑料袋內(nèi)封閉并放入紙質(zhì)信封，信封上應(yīng)做好詳細(xì)標(biāo)記。濾紙應(yīng)經(jīng)過滅菌處理，以防細(xì)菌生長抑制核酸酶的活性。漱口標(biāo)本也可作為口腔脫落細(xì)胞的來源。用于RNA分析的口腔脫落細(xì)胞必須保存在RNA穩(wěn)定

29、劑中。4.3標(biāo)本的運輸與保存分子檢測人員應(yīng)熟知標(biāo)本運送與保存的條件要求。標(biāo)本一經(jīng)采集，應(yīng)盡快送到臨檢實驗室。臨檢實驗室應(yīng)制定樣本運輸與保存的SOP。在運送工具的選擇、標(biāo)本的運送和保存環(huán)境等方面應(yīng)嚴(yán)格按規(guī)定執(zhí)行。運送過程中應(yīng)防止盛放標(biāo)本的容器破碎和標(biāo)本丟失，注意標(biāo)本的隔離、封裝、容器的密閉。標(biāo)本應(yīng)標(biāo)明采集的日期和時間、運送時間、實驗室接收時間、實驗室接收時標(biāo)本的溫度。運送條件根據(jù)標(biāo)本類型和待測靶核酸的性質(zhì)而定。DNA分析應(yīng)在采集后8小時內(nèi)送達實驗室，否則需低溫運送。當(dāng)待測核酸為RNA時，能在10分鐘內(nèi)送達實驗室的標(biāo)本可室溫運送；如果運送時間較長，則應(yīng)將標(biāo)本置于干冰中，4小時內(nèi)送達實驗室；如果標(biāo)本

30、中添加了RNA穩(wěn)定劑，則可室溫運送或郵寄。標(biāo)本的長距離運送應(yīng)符合生物安全要求。標(biāo)本運輸人員應(yīng)接受適用于標(biāo)本類型和遠程運輸?shù)陌踩桶b程序的培訓(xùn)。1）樣本運輸中需注意的常規(guī)事項a) 放置血液標(biāo)本的采血管應(yīng)用石蠟?zāi)せ蛲该髂z帶封住管蓋，以防標(biāo)本運送過程中采血管管蓋脫離；標(biāo)本運輸過程中選用輕質(zhì)且不易破碎的包裝物，并在包裝間隙用細(xì)碎輕質(zhì)材料填充。b) 標(biāo)本運輸和儲存過程中要避免將標(biāo)本暴露于可能導(dǎo)致核酸降解的環(huán)境中。c) 選擇可靠的快遞公司，樣本寄出后應(yīng)盡快告知檢測實驗室快遞單號及相關(guān)信息，以便對樣本運輸情況進行查詢和跟蹤。樣本要求在盡量短的時間內(nèi)送達臨檢實驗室。d) 組織或血液標(biāo)本的采集過程中可能引起部

31、分基因的表達上調(diào)，定量分析基因表達時需考慮到。2）常見標(biāo)本運輸和保存注意事項見個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南。4.4 標(biāo)本的接收與保存1）標(biāo)本的驗收、接受與拒收：臨床分子診斷實驗室應(yīng)建立嚴(yán)格的標(biāo)本驗收制度和不合格標(biāo)本拒收制度，并安排專人接收標(biāo)本。標(biāo)本驗收的內(nèi)容包括：檢查申請單的項目填寫是否符合要求、標(biāo)識是否清楚；申請單有無醫(yī)師簽字；申請單所填項目是否與標(biāo)本所示一致；申請單姓名、科別、門診或住院號與標(biāo)本的標(biāo)簽是否一致；是否簽署了知情同意書；核實標(biāo)本采集及送檢之間的時間間隔（要求采樣1周以內(nèi)）；檢查標(biāo)本的量和外觀質(zhì)量，血液標(biāo)本的外觀質(zhì)量包括采血管是否密閉、有無溶血、管壁有無破損、標(biāo)本是否有明顯的污染跡

32、象（如開蓋），樣本接收時的大致溫度，樣本量是否符合要求。手術(shù)切除組織標(biāo)本需做切片和HE染色，由有經(jīng)驗的病理醫(yī)師評價腫瘤細(xì)胞的數(shù)量是否滿足檢測需要。若送檢的為DNA樣本時，要求體積大于20 L，OD 260/280為1.61.8之間，濃度大于50 ng/L，瓊脂糖電泳后電泳條帶大于50 kb。拒收無標(biāo)簽、標(biāo)簽不清晰、采血管破裂、已開蓋、運送時間超過1周的樣本。拒收標(biāo)本時應(yīng)及時與送檢單位聯(lián)系，要求重新采樣或重新送樣。每個接受的合格標(biāo)本均應(yīng)分配一個唯一的標(biāo)識碼。樣本簽收時實行送樣人和收樣人雙簽名制度。標(biāo)本接收后，如不能立即檢測，必須按要求進行適當(dāng)?shù)谋４妗?）樣本的登記與錄入：樣本簽收后立即登記樣本基

33、本信息，收樣日期和時間，并盡快將標(biāo)本信息錄入實驗室（或醫(yī)院）信息系統(tǒng)，后續(xù)的操作過程及樣本保存均用唯一編號。3）標(biāo)本預(yù)處理：部分送檢標(biāo)本到達實驗室后需進行預(yù)處理，如保存于濾紙上的血液標(biāo)本需采用穿孔機將濾紙上的血斑取下裝入離心管中，用溶解液沖洗浸泡濾紙，搖床上室溫孵育以除去濾紙上的血紅蛋白。為避免交叉污染，一個干血斑取材完畢后，穿孔機需用70的乙醇徹底清洗，PBS沖洗后，方可用于下一個干血斑的采集。甲醛固定石蠟包埋組織在進行核酸檢測前需進行徹底的脫蠟，二甲苯是常用的高效脫蠟有機溶劑。4）接收后標(biāo)本的保存見個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南。5. 藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測分析中質(zhì)量保證藥物代謝酶和

34、藥物作用靶點基因檢測必須有嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施，涉及基因擴增的檢測項目必須在通過技術(shù)審核的臨床基因擴增檢驗實驗室完成。分析中質(zhì)量控制的內(nèi)容包括：實驗室設(shè)計的要求；檢測程序的選擇、驗證及確認(rèn)；儀器設(shè)備的使用、維護與校準(zhǔn)；人員培訓(xùn)；樣本的準(zhǔn)備（如核酸純化等）；執(zhí)行檢測；確認(rèn)檢測結(jié)果的可靠性。實驗室應(yīng)制定室內(nèi)質(zhì)量控制操作程序（SOP）和參加室間質(zhì)評或?qū)嶒炇议g比對。5.1 實驗室設(shè)計要求原則上按照個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南的要求進行。作為藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測核心技術(shù)之一的PCR，要保證結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，首要措施就是防“污染”。檢測實驗室應(yīng)按醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增實驗室管理辦法要求進行設(shè)置，

35、并按要求嚴(yán)格控制空氣流向，避免PCR產(chǎn)物污染。5.2 檢測方法藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測過程一般包括核酸提取和靶標(biāo)檢測兩階段。5.2.1 核酸提取方法DNA提取用酚-氯仿提取法和鹽析法等均可。酚-氯仿法提取可能導(dǎo)致DNA樣品中酚或氯仿殘留，從而抑制后續(xù)的PCR反應(yīng)。鹽析法提取可能存在蛋白質(zhì)及其他物質(zhì)的殘余，DNA的純度和得率不高。DNA提取操作要求在生物安全柜內(nèi)進行。DNA一般溶解在pH為7.2的TE（Tris-EDTA）溶液中，可減少其降解。但如果DNA在提取后幾天內(nèi)用于PCR，也可用雙蒸水進行溶解。提取出的DNA要求OD 260/280介于1.61.8之間，濃度大于50 ng/L。D

36、NA相對穩(wěn)定，在無DNA酶的情況下，常溫下純化的DNA在TE緩沖液中可放置26周，28°C冰箱中可放置至少1年。為降低DNA酶的活性和確保DNA的完整性，純化的DNA標(biāo)本的長期保存應(yīng)在0 oC以下的環(huán)境中。建議將DNA原液保存于-70oC或以下的環(huán)境中。DNA應(yīng)放置在帶蓋密封、疏水的塑料管中（帶橡膠墊片的塑料管更好，可防蒸發(fā)）。聚丙烯容易吸附DNA，尤其是在高離子強度的時候，聚乙烯結(jié)合DNA的能力更強。DNA最適于保存在異質(zhì)同晶聚合物材料的塑料管或經(jīng)特殊處理的聚丙烯塑料管中。RNA的提取用異硫氰酸胍結(jié)合酚-氯仿提取法，要求提取后的RNA OD 260/280介于1.82.1之間，瓊脂

37、糖電泳28S:18S2。因RNA很容易被降解，純化好的RNA最好沉淀在無水乙醇中-70 °C或更低溫度下保存。RNA需儲存在滅菌、疏水、并用焦碳酸二乙酯（DEPC）滅活了RNA酶的塑料管中，操作過程需帶手套。盡量將RNA溶解于偏堿性（pH 7.17.5）溶液中。純化的RNA在首次凍融后3小時內(nèi)保持穩(wěn)定，但反復(fù)凍融可導(dǎo)致降解。5.2.2 藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測的檢測方法用于靶標(biāo)檢測的方法包括PCR-直接測序法、PCR-焦磷酸測序法、熒光定量PCR法、PCR-基因芯片法、PCR-電泳分析、PCR-高分辨率熔解曲線法、等位基因特異性PCR法、PCR-限制性片段長度多態(tài)性方法、原位

38、雜交（ISH）等多種方法，每種方法的原理和優(yōu)缺點如下：1）PCR-直接測序法也稱PCR-Sanger測序，該方法基于雙脫氧核糖核酸（ddNTP）末端終止法，根據(jù)核苷酸在某一固定點開始延伸，隨機在某一特定堿基處終止，由于摻入的每個堿基都進行了熒光標(biāo)記，因此產(chǎn)生了以A、T、C、G結(jié)束的四組相差一個堿基的不同長度的系列核酸片段；通過毛細(xì)管電泳分離這些片段后讀取待測核酸的堿基序列。Sanger法測序是DNA序列分析的經(jīng)典方法。由于該方法可直接讀取DNA的序列，因此被認(rèn)為是基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)。PCR-Sanger測序法的操作過程主要包括PCR擴增和PCR產(chǎn)物純化、測序反應(yīng)、測序和結(jié)果分析四個主要步驟。分析

39、時需要設(shè)置陰性對照和陽性質(zhì)控品。該方法屬于定性檢測，優(yōu)點是測序長度較長，可發(fā)現(xiàn)新的變異位點。主要不足：靈敏度不高，尤其是在進行腫瘤組織體細(xì)胞突變檢測時，當(dāng)組織中靶標(biāo)基因突變比例低于20時，可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果；對試劑和儀器有特殊要求，不易普及；操作復(fù)雜，成本相對較高，速度慢、通量低。2）PCR-焦磷酸測序法本方法是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。實驗需設(shè)計一條生物素標(biāo)記的測序引物，當(dāng)引物與單鏈模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實

40、時測定DNA序列的目的。所需試劑包括樣本處理試劑、核酸擴增試劑、單鏈模板制備試劑、焦磷酸測序試劑和陽性質(zhì)控品五大類。所需儀器為PCR儀和焦磷酸測序儀。為避免假陽性和假陰性結(jié)果，應(yīng)嚴(yán)格區(qū)分陽性質(zhì)控品和反應(yīng)試劑的使用，防止因試劑污染致假陽性發(fā)生。該方法的主要優(yōu)點：檢測靈敏度較高，對體細(xì)胞突變和甲基化等可實現(xiàn)定量檢測；分型準(zhǔn)確可靠，通量較高，實驗設(shè)計靈活，可發(fā)現(xiàn)新的突變或遺傳變異。主要缺點：對試劑和儀器有特殊要求，不易普及；檢測靈敏度有限，對腫瘤組織中的低豐度體細(xì)胞突變（<3）容易出現(xiàn)假陰性；測序長度僅10多個堿基，不能對長片段進行分析。3）實時熒光PCR法根據(jù)檢測原理的不同，實時熒光PCR法

41、可分為探針法和非探針法兩種，前者利用與靶序列特異雜交的探針（Taqman和分子信標(biāo)）來指示擴增產(chǎn)物的增加，后者利用熒光染料或特殊設(shè)計的引物來指示擴增產(chǎn)物的增加。Taqman探針法同時綜合了5端核酸酶活性和熒光等技術(shù)，其在反應(yīng)過程使用4條寡核苷酸鏈，其中兩條為等位基因特異性探針，兩條為PCR引物。兩條探針可分別與突變型和野生型模板互補，其兩端分別應(yīng)用含報告基團和淬滅基團的染料進行標(biāo)記，兩條探針的報告基團熒光染料不一樣。在進行SNP檢測時，PCR擴增的退火過程導(dǎo)致探針與模板雜交結(jié)合，當(dāng)引物延伸至探針處時，DNA聚合酶的5端外切酶活性將探針的5端報告基團從探針上切除，使之與淬滅基團分離，從而釋放出相

42、對應(yīng)的熒光，而沒有配對的探針仍然保持完整而不會發(fā)熒光。不同的等位基因探針由于標(biāo)記的熒光染料不同，因此所發(fā)熒光信號不同，可通過對熒光信號的檢測判斷樣本的基因型。實時熒光PCR法靈敏度高，分型準(zhǔn)確，操作簡便快捷，所用儀器容易普及，易于推廣使用。但該方法通量不高，探針成本較高，單個位點的檢測成本與樣本量有關(guān)，樣本量越小，成本越高。本方法主要適于對少量位點、大樣本進行分型。目前CFDA已批準(zhǔn)CYP2C9、VKORC1等多種基因多態(tài)性檢測的PCR-熒光檢測試劑盒。4）PCR-基因芯片法該方法以特定的寡核苷酸片段作為探針，將其有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后將樣品DNA通過PCR擴增、熒光標(biāo)記等程序，按堿

43、基配對原理與芯片雜交，再通過熒光檢測系統(tǒng)對芯片上的熒光信號進行檢測和分析，從而迅速獲得個體的基因型信息?；蛐酒中头ǖ牟僮鬟^程包括PCR核酸擴增、雜交、芯片掃描和結(jié)果分析。該方法用于DNA基因分型時屬于定性檢測，靈敏度為50 ng/L?；蛐酒ǚ治鰰r需設(shè)置陰性對照和陽性質(zhì)控品。應(yīng)用基因芯片檢測試劑盒時應(yīng)確保試劑在開封前按要求保存、各組分液體使用前振蕩混勻，雜交和洗片操作務(wù)必在避光條件下進行，PCR反應(yīng)液和定位參照需避光保存，芯片加樣時注意使液體鋪滿整個反應(yīng)區(qū)，但不能溢出、不能出現(xiàn)氣泡，以防交叉污染。其主要優(yōu)點是可同時對多個待測SNP位點進行檢測。我國CFDA已批準(zhǔn)多種用于藥物代謝酶和藥物作

44、用靶點基因如ALDH2、CYP2C9、CY2C19、CYP2D6、ADR1、ACE、VKORC1多態(tài)性檢測的基因芯片試劑盒。5）PCR-電泳分析該方法是指對待分析的目的基因片段進行PCR擴增，并通過瓊脂糖凝膠電泳或毛細(xì)管電泳分析，根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小對基因多態(tài)性位點進行基因分型。該方法屬于定性檢測，且只能用于對已知的多態(tài)性位點進行檢測，不能識別未知多態(tài)性。瓊脂糖電泳法適用于對片段較長的插入缺失多態(tài)性進行檢測，如ACE插入缺失多態(tài)性；毛細(xì)管電泳法適于對較短的插入缺失多態(tài)性如UGT1A1*28多態(tài)性和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）進行檢測。PCR過程中需建立陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，電泳分析時需同時用分子

45、量標(biāo)記物進行片段大小的判斷。當(dāng)分子量標(biāo)記物反應(yīng)管無條帶或出現(xiàn)較弱的條帶時，可能的原因包括點樣孔漏、熒光染料不夠或失效、電泳時間過長或電壓過大。該方法的優(yōu)點是成本低，在普通實驗室即可開展；缺點是只適合對DNA插入/缺失多態(tài)性或融合基因進行定性測定，不能用于SNP的檢測。6）PCR-高分辨率熔解曲線（HRM）法該方法通過對PCR反應(yīng)的熔解曲線分析進行基因分型。PCR擴增的熔解曲線取決于其擴增序列，序列中一個堿基的差異都可導(dǎo)致雙鏈DNA的解鏈溫度發(fā)生變化。HRM法應(yīng)用實時熒光定量PCR儀監(jiān)測這種細(xì)微的溫度變化，確定所擴增的目的片段中是否存在突變，從而用于基因分型。HRM分析使用LC Green等飽和

46、熒光染料，該類染料在飽和濃度時對PCR反應(yīng)無抑制作用，因此可以高濃度使用，從而全部結(jié)合DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝。在雙鏈DNA的變性過程不存在熒光分子的重排，其特異度得到大幅提升，因此，熔解曲線細(xì)微的變化可以反映擴增片段中堿基的差異。應(yīng)用本方法進行基因分型屬于定性分析。該方法操作簡便、快速、通量大、使用成本低、結(jié)果準(zhǔn)確，有利于實現(xiàn)閉管操作，在進行甲基化檢測時可根據(jù)熔解曲線確定甲基化程度的高低。該方法的缺點是：不能排除待測核酸中新出現(xiàn)的遺傳變異；由于單個堿基突變導(dǎo)致DNA解鏈溫度的變化非常小，該方法對儀器的靈敏度和分辨率有較高要求。7）等位基因特異性PCR（Allele-specific PCR，

47、AS-PCR）又稱為擴增阻滯突變系統(tǒng)PCR（Amplification Refractory Mutation System PCR，ARMS-PCR）。該技術(shù)的基本原理：由于Taq DNA聚合酶缺乏3到5端的外切酶活性，3端錯配的堿基會導(dǎo)致引物延伸速度變慢，當(dāng)錯配達到一定程度時，引物延伸將終止，得不到特異長度的PCR擴增產(chǎn)物，從而提示模板DNA沒有與引物3端配對的堿基，反之則有。因此，AS-PCR反應(yīng)需要兩條等位基因特異的引物和一條共用的反向引物，兩條非特異性引物在3端與模板錯配，但其他部分堿基序列完全一樣。只有引物的3端與模板完全配對時，PCR擴增才可以進行。PCR產(chǎn)物可通過凝膠電泳進行分

48、析和基因型的判斷。該方法也可與實時熒光定量PCR結(jié)合起來進行基因分型。該方法可以用于檢測各種類型的SNP，其優(yōu)勢是靈敏度高，特別適合于對腫瘤組織中的體細(xì)胞突變進行檢測；缺點是假陽性率較高。8）PCR-限制性片段長度多態(tài)性方法限制性片段長度多態(tài)性方法（RFLP）是一種基于酶切原理的方法，是最早用于基因分型的經(jīng)典方法之一，現(xiàn)在仍被廣泛采用。該方法主要基于某些限制性內(nèi)切酶可以特異性識別某一特定序列和結(jié)構(gòu)DNA，并對其進行剪切的原理。限制性內(nèi)切酶通常識別雙鏈DNA的某一特定序列，并在特定位置或者附近將雙鏈DNA切斷，從而產(chǎn)生較短的DNA片段。由于限制性內(nèi)切酶識別序列的嚴(yán)格性，一個堿基的變化都可以導(dǎo)致酶

49、切活性的消失。利用這一特性，若待分型的SNP位點在某一限制性內(nèi)切酶的識別位點上，將會導(dǎo)致該酶只對其中的一種等位基因具有酶切活性。因此，對位于限制性酶切識別位點的SNP進行分型時，可以使用包含該位點的PCR產(chǎn)物與相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進行溫育。酶切以后的產(chǎn)物進行電泳，并根據(jù)酶切產(chǎn)物片段的大小來進行基因分型。該方法不需要任何探針，也不需要特別的儀器設(shè)備，成本較低，實驗過程簡單，可操作性強。但缺點也很明顯，主要是通量太低，大量分型時工作量大，并且只適用于部分SNP分型。9）原位雜交（ISH）法ISH法以各種人體標(biāo)本，包括相應(yīng)實驗方法制備的細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)標(biāo)本（福爾馬林固定石蠟包埋）作為靶標(biāo)，采用目的DNA

50、探針與該靶標(biāo)進行分子雜交，從而檢測相關(guān)的靶基因異常。ISH技術(shù)按照探針標(biāo)記物的類型，可分為亮視野原位雜交和熒光原位雜交（FISH）。ISH法檢測的靶標(biāo)具有完整的細(xì)胞核，無需進行核酸的提取。其具體的方法學(xué)原理見原位雜交（ISH）指南。在藥物代謝酶和靶點基因檢測中，ISH法主要用于測定基因擴增和基因缺失異常。表1. 各種藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術(shù)優(yōu)缺點及適用性比較方 法優(yōu) 點缺 點適用性AS-PCR靈敏度高，適于對腫瘤組織中突變比例較低的體細(xì)胞突變進行檢測。通量低對小樣本、低突變比例的體細(xì)胞突變進行檢測。實時熒光PCR通量較高，操作簡單，儀器設(shè)備易普及。探針較昂貴對相同位點、大樣本標(biāo)本進

51、行檢測，可用于mRNA表達檢測。焦磷酸測序高通量，高靈敏度，可以檢測插入/缺失突變和未知突變。等位基因含量的比例可用于室內(nèi)質(zhì)控。需要特殊儀器設(shè)備。適合于較大樣本、突變比例高于5的各種類型SNP檢測、甲基化位點的確定。HRM成本低，靈敏度高，閉管操作，降低污染風(fēng)險。需要特殊儀器設(shè)備，條件摸索過程較為困難適合有該類機器的實驗室開展各種類型SNP分型研究；可用于已知甲基化位點的檢測。Sanger法測序直接獲取序列，分型的金標(biāo)準(zhǔn)，可發(fā)現(xiàn)未知突變。通量低，不能檢測突變比例小于20的SNP。各種SNP的檢測，未知突變的篩查以及驗證其他分型的結(jié)果。PCR-RFLP無需特殊的儀器設(shè)備，成本較低，實驗過程簡單，

52、可操作性強。通量低，只適用于部分SNP分型適用于無條件夠買貴重儀器設(shè)備的實驗室開展小樣本的分型檢測?；蛐酒ㄍ扛哽`活度低，成本高，需要特殊的儀器設(shè)備。適用于具備芯片檢測能力的實驗室對已知固定位點、大樣本標(biāo)本進行檢測。原位雜交（ISH）在細(xì)胞核原位對基因的異常進行檢測成本高，通量低，時間較長。適于對基因擴增和缺失異常進行檢測。5.2.3 藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測項目及類型遺傳藥理學(xué)知識庫（PharmGKB）根據(jù)項目成熟程度將個體化用藥基因檢測項目分為4級，并認(rèn)為其中1級項目（包括1A級和1B級）滿足臨床應(yīng)用的最高標(biāo)準(zhǔn)，而4級項目適于臨床應(yīng)用的證據(jù)最少1。1A級項目為同時獲臨床遺傳藥理

53、學(xué)實施聯(lián)盟（Clinical Pharmacogenetics Implementation consortium，CPIC）、認(rèn)可CPIC藥物基因組學(xué)指南的醫(yī)學(xué)會、以及美國國家衛(wèi)生研究院藥物基因組學(xué)研究網(wǎng)絡(luò)（Pharmagenomics Research Network，PGRN）認(rèn)同的項目，這類項目通常經(jīng)大規(guī)模隨機對照臨床試驗（RCT）對項目的意義進行了論證；1B級項目有確切的臨床證據(jù)提示相關(guān)性，且這種相關(guān)性被具有一定樣本規(guī)模的研究所證實，但還需進一步的臨床證據(jù)。根據(jù)檢測項目所涉及的基因在影響藥物反應(yīng)中的作用機制和被測靶分子（DNA或RNA）的不同，個體化用藥分子檢測項目包括藥物代謝酶與轉(zhuǎn)

54、運體基因遺傳多態(tài)性檢測、藥物作用靶點基因遺傳變異檢測、其他基因變異檢測和藥物作用靶點基因mRNA表達檢測四種類型（附錄C）。5.3儀器設(shè)備的使用、維護與保養(yǎng)原則上按照個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南的要求進行。藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測涉及的儀器設(shè)備眾多，實驗室可參考生產(chǎn)商提供的操作說明書編寫書面的、有案可查的預(yù)防性維護及校準(zhǔn)計劃，確定儀器設(shè)備的維護周期，建立儀器設(shè)備日常維護的SOP。對于某些計量分析儀器，應(yīng)依照我國計量法規(guī)定，由計量檢定機構(gòu)定期進行校驗，并保存好校驗證書。加熱系統(tǒng)及冰箱等設(shè)備的維護包括對溫度進行監(jiān)測。儀器維護過程中要注意清潔劑的使用，尤其是儀器的光路系統(tǒng)。每臺儀器應(yīng)該配備專用

55、的清潔工具。在例行儀器的維護和保養(yǎng)后，應(yīng)填寫儀器維護保養(yǎng)記錄表。如維護中發(fā)現(xiàn)問題，應(yīng)及時匯報并將出現(xiàn)的問題詳細(xì)記錄，最后由維護操作人員簽名。5.4人員培訓(xùn)原則上按照個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南的要求進行。藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測通常要涉及試劑配制、核酸提取、儀器編程、結(jié)果分析和報告等步驟。操作人員需要有一定的專業(yè)技術(shù)知識和經(jīng)驗才能獲得穩(wěn)定可靠的檢測結(jié)果。加強人員培訓(xùn)是確保檢測質(zhì)量的關(guān)鍵。人員培訓(xùn)分為入職培訓(xùn)、內(nèi)部培訓(xùn)和外部培訓(xùn)。通過培訓(xùn)，讓操作人員掌握和建立安全操作的概念、“防污染”的概念、具備獨立進行質(zhì)控活動和儀器維護的能力，可對試劑和質(zhì)控品的出入庫及使用情況、設(shè)備保養(yǎng)等情況進行準(zhǔn)確記

56、錄，進行數(shù)據(jù)分析。實驗室工作人員在培訓(xùn)后書面確認(rèn)其已接受適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)，閱讀并理解了相關(guān)SOP。實驗室應(yīng)對實驗室工作人員進行處事能力考核和周期性能力再考核，定期開展內(nèi)部培訓(xùn)。外部培訓(xùn)包括國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心和國家衛(wèi)生計生委個體化醫(yī)學(xué)檢測培訓(xùn)基地等機構(gòu)組織開展的各種技術(shù)培訓(xùn)。5.5檢測體系的性能驗證原則上按照個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南的要求進行。臨床檢驗實驗室應(yīng)用的體外診斷試劑包括國家藥品食品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)的試劑盒和國家衛(wèi)生計生委個體化醫(yī)學(xué)檢測試點單位通過性能評定、具有嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）的自配試劑（LDT）。所有試劑都需進行性能評價。實驗室所購買的商業(yè)化的儀器應(yīng)根據(jù)說明書

57、進行驗證。在報告結(jié)果之前實驗室應(yīng)該證明其性能能夠滿足廠家規(guī)定的準(zhǔn)確度、精密度、線性與可報告范圍和參考區(qū)間。實驗室還應(yīng)該為每個檢測系統(tǒng)建立性能規(guī)范，包括適用性、準(zhǔn)確度、精密度和分析特異性（包括干擾物質(zhì)）、可報告范圍和其他重要特性，并根據(jù)性能規(guī)范確定系統(tǒng)的校準(zhǔn)和質(zhì)控程序，保持性能特征建立、校準(zhǔn)和質(zhì)控程序相關(guān)活動的記錄。同時也需對檢驗中的耗材進行質(zhì)檢。個體化醫(yī)學(xué)分子檢測包括定性檢測和定量檢測。定性檢測的性能驗證指標(biāo)主要包括重復(fù)性/精密度、準(zhǔn)確度（突變型的檢測能力）、分析特異性、檢出限等，可參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）的EPl2一A2文件進行。定量檢測監(jiān)測體系性能驗證的指標(biāo)主要包括準(zhǔn)確度、

58、精密度、線性、可報告范圍、檢出限、參考區(qū)間、靈敏度、特異性等。準(zhǔn)確度的評價有兩種方法，一種方法是與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行比較，使用待評估的項目對已知標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（如定性檢測中用到的陽性參照品）進行分析，將檢測結(jié)果與已知標(biāo)準(zhǔn)值進行比較；第二種方法是同時用待評估項目與標(biāo)準(zhǔn)方法（或參考方法）對同一批次樣品進行分析，然后將不同方法得到的結(jié)果進行對比分析。精密度是指重復(fù)檢測條件下，獲得的獨立測量結(jié)果間的一致程度，是對檢測體系隨機誤差的一種度量，常用標(biāo)準(zhǔn)差表示，標(biāo)準(zhǔn)差越小精密度越好。定性檢測的精密度還包括一份陽性或陰性樣本在多次檢測中，是否能得到可重復(fù)的陽性或陰性結(jié)果。藥物代謝酶和藥物作用靶點基因變異檢測體系進行準(zhǔn)確度、精密度等性能驗證時所使用的參考物質(zhì)為各種突變型和野生型質(zhì)?；蛲蛔兗?xì)胞株。線性分析可直