絞股藍(lán)提取物技術(shù)要求編制說明

1、 絞股藍(lán)提取物技術(shù)要求編制說明一、項(xiàng)目研究背景絞股藍(lán)，別名七葉膽、小母豬藤、遍地生根、南人參、公羅鍋底、五葉參、小苦藥、小葉五爪龍等，為多年生攀援草本植物。多分布于亞熱帶和北亞熱帶地區(qū)，我國主要分布于秦嶺和長江以南地區(qū)，如陜西安康、湖北神農(nóng)架、廣西金秀等，其中陜西安康的平利縣、寧陜縣盛產(chǎn)絞股藍(lán)，平利還被列為中國絞股藍(lán)原產(chǎn)地。全世界已知絞股藍(lán)屬植物有16種2變種，我國有14種2變種，主要生長于海拔3003200米的山谷密林、丘陵、山坡和石山地區(qū)的陰濕地帶。絞股藍(lán)生藥為干燥皺縮的全草。顏色為黃綠色，呈粒狀或段狀，具清香。衛(wèi)生部關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知（衛(wèi)法監(jiān)發(fā)200251號）的附件2將

2、絞股藍(lán)列入可用于保健食品的物品名單。因來源不同，口感有差異，一般可分為苦味型、淡味型和甜味型?？辔缎涂勺鳛獒t(yī)藥或化工原料；淡味型可以作為生產(chǎn)保健飲品和保健食品添加劑的原料；甜味型除上述用途外，還是生產(chǎn)葉型、袋泡型飲品和保健煙、保健酒的最佳原料。絞股藍(lán)提取物（Gynostemma Extract）是以絞股藍(lán)為原料經(jīng)提取分離制成的產(chǎn)品。本品從葫蘆科植物絞股藍(lán)Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino全草中提取得到。目前，由于國內(nèi)從事絞股藍(lán)植物提取的企業(yè)大多規(guī)模小，設(shè)備落后，缺乏市場研發(fā)和技術(shù)研發(fā)力量，造成產(chǎn)品質(zhì)量缺乏競爭力，加之缺乏有效的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，一些劣質(zhì)產(chǎn)品甚至摻

3、偽產(chǎn)品進(jìn)入市場，影響了整個(gè)行業(yè)發(fā)展，并威脅到以此為原料的保健食品質(zhì)量。有關(guān)的中成藥制劑主要有絞股藍(lán)總甙片、絞股藍(lán)總苷顆粒、絞股藍(lán)總苷膠囊、絞股藍(lán)總苷軟膠囊等，在保健食品中主要用于輔助降血脂、降血壓、降血糖等，目前多以茶劑形式存在。絞股藍(lán)及其提取物的檢測標(biāo)準(zhǔn)急需制定更新。中國藥典2005年版、2010年版均未收載絞股藍(lán)藥材標(biāo)準(zhǔn)，最新的地方標(biāo)準(zhǔn)見于湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2009年版）；絞股藍(lán)總甙標(biāo)準(zhǔn)為衛(wèi)生部部標(biāo)準(zhǔn)【W(wǎng)S3-Z-006-93(Z)】，該標(biāo)準(zhǔn)方法陳舊，且絞股藍(lán)皂甙-A對照品常年無供應(yīng)，已嚴(yán)重不適應(yīng)對絞股藍(lán)提取物的質(zhì)量控制，造成市場上絞股藍(lán)提取物總苷含量標(biāo)注虛高，非法摻偽、摻雜現(xiàn)象嚴(yán)重。在此

4、背景下，國家食品藥品監(jiān)督管理局食品司組織陜西省食品藥品監(jiān)督管理局、陜西省食品藥品檢驗(yàn)所對絞股藍(lán)提取物展開研究，制定符合先進(jìn)生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品的絞股藍(lán)提取物技術(shù)要求。二、儀器、試樣、試藥1、主要檢測儀器Waters Alliance HT高效液相色譜儀，Empower工作站；奧泰2000型蒸發(fā)光散射檢測器；QUATTRO MICRO API三重四極質(zhì)譜儀；Angilent 7890氣相色譜儀；島津GCMS-QP2010；Sartorius AGME 235S 型電子分析天平，Sartorius BS224S型電子分析天平；H66025型超聲波清洗儀。 2、試劑與試藥甲醇、乙腈（色譜純，美國TEDIA

5、公司）；水為GB/T 6682規(guī)定的一級水；其它試劑除注明外均為分析純；硅膠G（青島海洋化工廠）。3、對照品該標(biāo)準(zhǔn)中用到的對照品為絞股藍(lán)皂苷XL IX（批號：20100619，ELSD和UV檢測，歸一化法含量均大于99.0%，陜西省食品藥品檢驗(yàn)所提供）。衛(wèi)生部部標(biāo)準(zhǔn)【W(wǎng)S3-Z-006-93(Z)】收錄有絞股藍(lán)皂甙-A的薄層鑒別和以絞股藍(lán)皂甙-A為對照品進(jìn)行測定的總皂苷含量測定。但絞股藍(lán)皂甙-A對照品僅在1994年中檢所發(fā)行過一批，且純度僅為87.55%，研究證實(shí)其有一同分異構(gòu)體難以分離，多年來，再無法定單位提供。我所得到的安康北醫(yī)大和安康正大提供的兩種聲稱為“絞股藍(lán)皂甙-A”的對照品，經(jīng)實(shí)驗(yàn)

6、驗(yàn)證【色譜條件：流動(dòng)相：乙腈-水（35:65）；C18色譜柱；二極管陣列檢測器】，二者在液相色譜上出峰時(shí)間有較大差異，可以肯定不是同一種化合物。查閱各種國內(nèi)外文獻(xiàn)，日本科學(xué)家“絞股藍(lán)之父”竹本常松于1984年在絞股藍(lán)中發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)皂苷XL IX（CAS號：94987-08-3），并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和確證。藥理學(xué)研究表明，絞股藍(lán)皂苷XL IX與絞股藍(lán)總皂苷藥理作用基本一致。多批次試驗(yàn)證明，其含量在絞股藍(lán)提取物中高達(dá)6%20%，且專屬性強(qiáng)，目前未見在其他科屬植物中發(fā)現(xiàn)的報(bào)道。國際上諸多文獻(xiàn)如SPECTROSCOPIC DATA of SAPONINS The Triterpenoid Glycosi

7、des VOLUME I、Gypenoside XL IX，a naturally occurring gynosaponin,PPAR-alpha dependently inhibits LPS-induced tissue factor expression and activity in human THP-1 monocytic cells等報(bào)導(dǎo)的名稱均為絞股藍(lán)皂苷XL IX。鑒于絞股藍(lán)皂苷XL IX國內(nèi)外均無法定單位提供，我所與西安鴻程生物科技有限公司合作，提取精制出絞股藍(lán)總皂苷中的標(biāo)志性成分絞股藍(lán)皂苷XL IX（HPLC-UV與HPLC-ELSD測定純度均大于99%）。該對照品與

8、安康北醫(yī)大提供的聲稱為“絞股藍(lán)皂苷A”的分子式、結(jié)構(gòu)以及CAS號等完全一致，經(jīng)實(shí)驗(yàn)比對驗(yàn)證，二者為同一化合物，僅在純度上有所區(qū)別，我所提取精制的對照品溶解性、純度均高于后者。為了與國際統(tǒng)一，避免混淆，我們采用絞股藍(lán)皂苷XL IX作為其標(biāo)志性成分。經(jīng)鑒定：絞股藍(lán)皂苷XL IX為白色結(jié)晶性粉末。根據(jù)13C-NMR，DEPT，MS 及元素分析確定分子式為C52H86O21，分子量為1047.23，Liebermann反應(yīng)陽性。IR cm-1 ：3418,1044 有強(qiáng)的羥基吸收；在1701處有一羰基吸收峰；1379,1260有四環(huán)三萜的特征吸收峰。其乙?；锏腎R譜無羥基吸收。1H-NMR譜在低場區(qū)

9、 5.02 ppm（1H,d,J = 7.89 Hz）處多一質(zhì)子信號，歸屬于葡萄糖的端基質(zhì)子。13C-NMR 譜中C21 66.87向低場位移至76.36，說明分子中C21羥基與糖結(jié)合成甙。 46.13,76.31及36.70各信號分別歸屬于C17,C20及C22。由于C21羥基甙化的影響，各碳原子分別位移-0.06，-0.20和+0.05 ppm，多出一組葡萄糖信號，分別為 106.25，75.54，78.65，71.82，78.71和62.93 ppm。圖1 絞股藍(lán)皂甙XL IX結(jié)構(gòu)式另外，在部分研究文獻(xiàn)或標(biāo)準(zhǔn)中，有使用人參皂苷Rb1或人參皂苷Re作為絞股藍(lán)產(chǎn)品對照的情況。但是，研究表明，

10、測定絞股藍(lán)及其制劑中總皂苷的含量，不宜用人參皂苷Rb1或人參皂苷Re作對照品進(jìn)行測定。我們在所測定的絞股藍(lán)提取物中均未檢出人參皂苷Rb1或人參皂苷Re，檢出絞股藍(lán)皂苷XL IX以及絞股藍(lán)皂甙-A。4、試樣鑒于我省安康地區(qū)為絞股藍(lán)主產(chǎn)地，我所于2010年4月13日赴安康地區(qū)對絞股藍(lán)品種基源、資源、生產(chǎn)加工狀況進(jìn)行了考察，并收集了安康、四川絞股藍(lán)原料各1批。同時(shí)，委托西安盛興中藥飲片有限公司從湖北、湖南、安徽各購進(jìn)了2批絞股藍(lán)原料（各200 kg）（按照湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2009年版）檢驗(yàn)，安徽產(chǎn)地的2批絞股藍(lán)不符合規(guī)定，作退貨處理，其余6批原料符合規(guī)定），并委托陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司加工。

11、與此同時(shí)，搜集購買絞股藍(lán)提取物樣品20余批。三、工藝制法絞股藍(lán)提取物主要功效成分為絞股藍(lán)皂苷，國內(nèi)多數(shù)生產(chǎn)廠家對企業(yè)工藝嚴(yán)格保密，僅提供粗略工藝，核心技術(shù)不外泄；生產(chǎn)工藝的不同導(dǎo)致不同企業(yè)的絞股藍(lán)總皂苷含量、重金屬、溶劑殘留等差異較大。我們根據(jù)不同廠家提供的生產(chǎn)工藝及文獻(xiàn)資料，研究可行的制法。制法不同于生產(chǎn)工藝，只需規(guī)定工藝中的主要步驟和必要的技術(shù)參數(shù)即可，一般只明確提取溶劑的名稱和提取、分離、濃縮、干燥等步驟及必要的條件制法1：絞股藍(lán)干燥全草，經(jīng)揀選、洗滌、切制后，水煎煮3次，合并提取液過濾后，采用水飽和的正丁醇萃取三次，合并正丁醇液，過濾后用水洗滌，濃縮正丁醇液，干燥、收粉，即得。制法2：

12、絞股藍(lán)干燥全草，經(jīng)揀選、洗滌、切制后，水煎煮3次，合并提取液過濾后，通過大孔吸附樹脂，水洗后用甲醇（或乙醇）洗脫，洗脫液經(jīng)濃縮、干燥、收粉，即得。制法3：絞股藍(lán)干燥全草，經(jīng)揀選、洗滌、切制后，10倍量75%乙醇浸泡12 h，超聲提取3次，每次80分鐘，合并提取液，過濾，回收乙醇，加水稀釋至含醇量在5%以下，過濾，通過D101大孔吸附樹脂，水洗后用甲醇（或乙醇）洗脫，洗脫液經(jīng)濃縮、干燥、收粉，即得。制法4：取絞股藍(lán)全草，經(jīng)揀選、洗滌后，切成24cm段，加乙醇加熱回流提取兩次，提取液濾過，合并濾液，采用D101大孔吸附樹脂和LSI-010脫鹽樹脂吸附凈化，回收乙醇，濃縮成浸膏，70減壓干燥，粉碎，

13、過篩，裝袋，封口，即得。結(jié)果顯示，制法1生產(chǎn)出的樣品顏色為棕褐色，溶解性差，皂苷含量低，溶劑殘留量大，但得率高；制法2生產(chǎn)出的樣品顏色為棕褐色，溶解性差，得率較低；制法3較制法2略好，得率有所提高；制法4生產(chǎn)出的絞股藍(lán)提取物感官指標(biāo)及溶解性、重金屬、溶劑殘留以及總皂苷含量等各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于前三種制法，故技術(shù)要求中以此為準(zhǔn)。另外，由于各個(gè)廠家所用凈化樹脂以及生產(chǎn)設(shè)備不同，所以技術(shù)要求中沒有規(guī)定具體的樹脂種類以及浸膏的相對密度。表1 不同制法試制樣品的主要差別制法 特征顏色溶解性（乙醇）總皂苷含量（%）得率（%）制法1棕褐色微溶605.8制法2黃褐色溶解702.1制法3棕黃色溶解852.8制法4黃白

14、色易溶952.7制法確立后，我所委托陜西昂勝生物醫(yī)藥科技有限公司按照制法4生產(chǎn)絞股藍(lán)提取物，我所技術(shù)人員全程參與生產(chǎn)過程，最終制備出4批合格的產(chǎn)品（批號分別為20100930、20101001、20101002、20101003），以供技術(shù)要求研究用。四、感官要求32批樣品感官特征相同點(diǎn)是滋味、氣味、性狀和雜質(zhì)特征類似；不同點(diǎn)是顏色差異較大，從棕褐色黃褐色淡黃色黃白色類白色；分析認(rèn)為主要是因?yàn)楣に嚥顒e較大，有醇提和水提、脫色和未脫色、正丁醇萃取或大孔樹脂凈化之分，并且所用樹脂類型差異較大。根據(jù)樣品實(shí)際情況、絞股藍(lán)皂苷的特點(diǎn)以及我所委托加工的樣品的特征暫定如下，見表2。表2項(xiàng)目要求色澤為黃白色至

15、淡黃色的粉末滋味、氣味氣微，味苦，無異味性狀干燥均勻的粉末雜質(zhì)無肉眼可見的外來雜質(zhì)五、理化指標(biāo)1、溶解性皂苷類成分大多為白色或乳白色的無定形粉末，味苦而辛辣，具吸濕性，能刺激粘膜而引起噴嚏，無明顯的熔點(diǎn)?？扇苡谒?，易溶于熱水、熱甲醇、熱乙醇，不溶于乙醚、苯等極性小的有機(jī)溶劑。皂苷易溶于水飽和的丁醇或戊醇，因此常從水溶液中用丁醇或戊醇提取，借以與糖、蛋白質(zhì)等親水性成分分開。絞股藍(lán)提取物中主要成分為絞股藍(lán)皂苷，同樣具備皂苷的溶解特性。我們參照衛(wèi)生部部標(biāo)準(zhǔn)【W(wǎng)S3-Z-006-93(Z)】項(xiàng)下規(guī)定，依照中華人民共和國藥典2010年版一部中凡例第二十一條測定，結(jié)果大部分樣品由于工藝落后或摻偽等原因在甲

16、醇及乙醇中溶解性略差，僅有部分樣品易溶于甲醇及乙醇?？紤]到已有標(biāo)準(zhǔn)以及大多數(shù)廠家絞股藍(lán)提取物標(biāo)稱總皂苷含量在90%以上，本著促進(jìn)企業(yè)改進(jìn)生產(chǎn)工藝、提高產(chǎn)品競爭力的原則，我們將溶解性規(guī)定為：在甲醇及乙醇中易溶，在乙醚或氯仿中幾乎不溶，在石油醚（3060）中不溶。2、粒度參照中國藥典2010年版一部凡例“計(jì)量”項(xiàng)下有關(guān)粉末的定義、提取物標(biāo)準(zhǔn)，樣品制法以及樣品實(shí)際粒度大小，特制訂如下操作方法和限度，以期達(dá)到中細(xì)粉的要求。根據(jù)測試結(jié)果規(guī)定，本品在100目篩的通過率應(yīng)大于90%。3、泡沫試驗(yàn)此為皂苷泡沫試驗(yàn)，泡沫試驗(yàn)是檢查皂苷的經(jīng)典方法，可迅速初步判斷樣品中是否含有皂苷類成分。操作方法：取粉末0.1 g

17、，置試管中，加水2 mL，用力振搖，如產(chǎn)生持久性泡沫 （15min以上） 即為陽性反應(yīng)。結(jié)果32批樣品均呈陽性反應(yīng)，均符合規(guī)定。4、化學(xué)反應(yīng)當(dāng)前，植物提取物行業(yè)由于缺乏檢測標(biāo)準(zhǔn)以及有效管理，在生產(chǎn)后期以及銷售領(lǐng)域，為增加產(chǎn)量或制備比例提取物，存在摻入淀粉或糊精的行為，為遏制此類行為，制定本檢測方法。該方法為淀粉或糊精的特征化學(xué)反應(yīng)，可有效判斷樣品中是否摻雜有糊精或淀粉，該反應(yīng)與泡沫試驗(yàn)可用于現(xiàn)場打假。操作方法：取本品0.1 g，置試管中，加水5 mL，用力振搖，加碘試液12滴，不得顯藍(lán)紫色或紫紅色。結(jié)果：檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3批樣品呈陽性反應(yīng)，不符合規(guī)定；其余29批樣品均呈陰性反應(yīng)，符合規(guī)定。該法檢

18、測靈敏度較高，可滿足摻偽5%以上淀粉或2%以上糊精的絞股藍(lán)提取物的檢測。5、干燥失重：按中華人民共和國藥典2010年版一部附錄IX G測定。根據(jù)表6測試結(jié)果規(guī)定，規(guī)定本品干燥失重不得過5.0%。6、熾灼殘?jiān)喊粗腥A人民共和國藥典2010年版一部附錄IX J測定。根據(jù)表6測試結(jié)果規(guī)定，規(guī)定本品熾灼殘?jiān)坏眠^1.0%。7、薄層色譜在原衛(wèi)生部絞股藍(lán)皂甙標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上建立此薄層鑒別方法，并采用絞股藍(lán)皂苷XL IX代替絞股藍(lán)皂甙-A。絞股藍(lán)皂苷XL IX是絞股藍(lán)提取物中的主要和特征成分之一，采用此薄層方法可有效鑒別絞股藍(lán)提取物的真?zhèn)?。方法：取本?.2 g，加甲醇10 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液

19、濃縮至約1 mL，作為供試品溶液。另取絞股藍(lán)皂苷XL IX對照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄 B）試驗(yàn)，吸取上述二種溶液各5 L，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15:40:22:10）10 以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同顏色的斑點(diǎn)，紫外光燈下顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。 樣品示88888888888888結(jié)果：32批樣品中，在與對照品色

20、譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同顏色的斑點(diǎn)，紫外光燈下顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。該方法專屬性強(qiáng)，Rf值適中，列入技術(shù)要求正文。8、溶劑殘留絞股藍(lán)提取物因主要成分為絞股藍(lán)皂苷，各生產(chǎn)廠方工藝不同，有的采用大孔樹脂凈化、有的用正丁醇萃取，有的企業(yè)為了降低成本使用二類溶劑甲醇提取，甚至還有一些未知的特殊提取方法。各種提取方法都可能帶來一些有害的溶劑殘留，所以必須對其殘留量加以控制。本文基于上述工藝以及國家食品藥品監(jiān)督管理局2005年發(fā)布的“應(yīng)用大孔吸附樹脂分離純化工藝生產(chǎn)的保健食品申報(bào)與審評規(guī)定（試行）”（國食藥監(jiān)注2005202號）的規(guī)定，并采用毛細(xì)管氣相色譜法、毛細(xì)管氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，配以頂空進(jìn)樣，

21、研究可能存在的幾種殘留物即甲醇、正丁醇、正己烷、苯、甲苯、鄰二甲苯、對二甲苯、1,2-二乙基苯、苯乙烯、二乙烯苯進(jìn)行研究，通過GC-MS實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)有異丁醇、三氯甲烷等溶劑殘留，并經(jīng)GC-MS確證。該法操作簡便，重現(xiàn)性好，可滿足本品的質(zhì)量控制。（1）儀器與試劑Agilent 7890氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測器（FID），G1888頂空進(jìn)樣器；北京中惠普分析技術(shù)研究所GCK 3308全自動(dòng)空氣源；GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；甲醇、正丁醇、異丁醇、正己烷、苯、甲苯、鄰二甲苯、對二甲苯、1,2-二乙基苯、苯乙烯、二乙烯苯、三氯甲烷以及N,N-二甲基甲酰胺均為色譜純。（2）色譜和頂空

22、條件試驗(yàn)中考察了DB-624、DB-5、DB-WAX三款毛細(xì)管色譜柱，并對程序升溫條件進(jìn)行優(yōu)化；考慮到以上溶劑的沸點(diǎn)不一，如甲苯、正丁醇、異丁醇沸點(diǎn)均超過100，故對頂空瓶平衡溫度進(jìn)行優(yōu)化，為使殘留組分在樣品基質(zhì)中達(dá)到與系列標(biāo)準(zhǔn)溶液一致的蒸氣壓，并兼顧高溫加熱條件下樣品熱降解的可能性，最終確定如下色譜和頂空條件。色譜柱：以鍵合/交聯(lián)聚乙二醇為固定相的毛細(xì)管柱（柱長為30 m，內(nèi)徑為0.32 mm，膜厚度為0.50 m）；柱溫為程序升溫，起始溫度為40 ，保持5 min，以每分鐘10 升溫至150 ，保持1 min，再以每分鐘20 升溫至200 ，保持2 min；用氫火焰離子化檢測器檢測，檢測器

23、溫度250 ；進(jìn)樣口溫度200 ；載氣為氮?dú)猓魉贋?.5 mL/min；頂空進(jìn)樣，頂空瓶平衡溫度為90 ，平衡時(shí)間為30 min。理論板數(shù)以鄰二甲苯峰計(jì)算應(yīng)不低于50000。圖2 對照品分離示意圖圖3 絞股藍(lán)提取物分離示意圖（正丁醇萃取法）圖4 絞股藍(lán)提取物分離示意圖（大孔樹脂法）（3）對照品溶液的制備精密稱取甲醇、正丁醇、異丁醇、氯仿、正己烷、苯、甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、1,2-二乙基苯和二乙烯苯對照品適量，加50% N,N-二甲基甲酰胺溶液制成每1 mL中分別含甲醇、正丁醇、異丁醇、氯仿、正己烷、苯、甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、1,2-二乙基苯和二乙烯苯500 g、500

24、 g、500 g、5 g、5 g、1 g、5 g、5 g、5 g、5 g、5 g和1 g的溶液，作為對照品貯備液。（4）線性關(guān)系考察精密吸取上述對照品貯備液適量，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成系列濃度對照品溶液。精密量取5 mL，置20 mL頂空瓶中，密封，即得。以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。二乙烯苯以其同分異構(gòu)體的峰面積之和計(jì)。結(jié)果見表3。（5）檢測限試驗(yàn)精密吸取上述對照品貯備液適量，加水稀釋逐級稀釋，當(dāng)信噪比（S/N=3）時(shí)得到12種溶劑的最低檢測限，見表3。（6）重復(fù)性試驗(yàn)精密吸取上述貯備液1 mL，置50 mL量瓶中，加5% N,N-二甲

25、基甲酰胺溶液稀釋至刻度，搖勻（甲醇、正丁醇、異丁醇、氯仿、正己烷、苯、甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、1,2-二乙基苯和二乙烯苯），精密量取5 mL，置20 mL頂空瓶中（共6份），密封，測定，計(jì)算各對照品峰面積積分值的RSD%，見表3。（7）樣品處理方法的選擇確認(rèn)及方法檢測限本品主要為皂苷類成分，在水中溶解性較好，故選擇以水作溶劑，但由于本品主含皂苷類成分，皂苷類成分在振搖中會產(chǎn)生大量持久性泡沫，故取樣量不宜過大，且不宜振搖，測試中選擇了取樣0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g、1.0 g，加水密封后，采用超聲處理以利于充分溶解?？紤]到該產(chǎn)品特性，最終確立方法如下：取

26、本品約0.1 g，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，精密加入純化水5 mL，密封，超聲處理10 min，置入頂空進(jìn)樣器中，測定，即得。方法檢測限見表3。【特別說明：國家食品藥品監(jiān)督管理局2005年發(fā)布的“應(yīng)用大孔吸附樹脂分離純化工藝生產(chǎn)的保健食品申報(bào)與審評規(guī)定（試行）”（國食藥監(jiān)注2005202號）第四條規(guī)定“對用苯乙烯骨架型樹脂制備的原料中二乙烯苯含量要求為小于50 g/kg。但是由于該品種的特殊性，在本品種中二乙烯苯殘留的方法檢測限只能達(dá)到0.4 mg/kg，雖然不能確認(rèn)生產(chǎn)中是否使用了苯乙烯骨架型樹脂?！勘? 線性關(guān)系和檢測限結(jié)果表組分線性范圍（g.mL-1）回歸方程r檢測限（ng.mL-

27、1）方法檢測限（mg/kg）重復(fù)性（RSD）/%甲醇5001Y=0.1025X-0.07560.9999400201.3正丁醇1000.2Y=0.5022X-0.16500.9999200102.5異丁醇1000.2Y=0.6967X-0.23990.9999200101.2氯仿1000.2Y=0.7257X-0.91830.9996200104.1正己烷100.04Y=3.7932X-0.70990.9995201.04.9苯100.02Y=9.3018X-1.12430.999780.41.6甲苯100.02Y=9.8338X-0.90470.999780.43.2對二甲苯100.02Y=

28、10.2470X-0.87850.999780.42.9鄰二甲苯100.02Y=10.2370X-0.82470.999780.42.1苯乙烯100.02Y=9.5698X-0.61320.999880.43.61,2-二乙基苯100.02Y=11.0530X-0.72220.999880.42.8二乙烯苯100.02Y=9.4015X-0.36440.999980.44.3（7）回收率試驗(yàn)精密稱取已知溶劑殘留量的絞股藍(lán)提取物（批號：20101001）0.1 g（共6份），精密加入“重復(fù)性試驗(yàn)”項(xiàng)下配制的對照品溶液5 mL，密封，測定，計(jì)算回收率，見表4。表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果組分平均回收率（%

29、）RSD（%）甲醇90.21.6正丁醇93.13.5異丁醇94.22.2氯仿91.83.8正己烷88.53.6苯95.32.7甲苯99.52.5對二甲苯95.41.2鄰二甲苯94.61.1苯乙烯92.73.91,2-二乙基苯94.61.6二乙烯苯85.64.6（8）限度制定及樣品測定參照中國藥典2010年版附錄“殘留溶劑測定法”、人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會( ICH )以及國家食品藥品監(jiān)督管理局2005年發(fā)布的“應(yīng)用大孔吸附樹脂分離純化工藝生產(chǎn)的保健食品申報(bào)與審評規(guī)定（試行）”（國食藥監(jiān)注2005202號）的有關(guān)規(guī)定及要求，并結(jié)合保健食品的長期食用特點(diǎn)，暫定限度如下：表5 絞股藍(lán)提取物中溶

30、劑殘留限度表溶劑名稱溶劑類別本技術(shù)要求限度（mg/kg）ICH規(guī)定（mg/kg）中國藥典2010年版一部有關(guān)提取物大孔樹脂殘留的限度（mg/kg）甲醇/(mg/kg)二類5003000/正丁醇/(mg/kg)三類5005000/異丁醇/(mg/kg)三類5005000/氯仿/(mg/kg)二類560/正己烷/( mg/kg)二類529020甲苯/( mg/kg)二類589020對二甲苯/( mg/kg)/5未單獨(dú)規(guī)定20鄰二甲苯/( mg/kg)/520苯乙烯/( mg/kg)/5/201,2-二乙基苯/( mg/kg)/5/20二乙烯苯/( mg/kg)/1/20苯/( mg/kg)一類12

31、2表6 樣品溶劑殘留測定結(jié)果表編號檢出主要溶劑種類超標(biāo)溶劑可能的工藝1正丁醇、異丁醇/制法12甲醇、乙醇/制法23甲醇、乙醇/制法34甲醇、乙醇/制法45甲醇、乙醇/制法46甲醇、乙醇/制法47甲醇、乙醇/制法48甲醇、乙醇/制法49甲醇、乙醇/制法410正己烷、乙醇、氯仿、正丁醇氯仿制法1+其他11正己烷、乙醇、氯仿、正丁醇氯仿制法1+其他12正己烷、乙醇、氯仿、正丁醇氯仿制法1+其他13正己烷、乙醇、氯仿、正丁醇氯仿制法1+其他14正己烷、乙醇、氯仿、異丁醇、正丁醇、1,2-二乙基苯、二乙烯苯氯仿制法1+其他15正己烷、乙醇、氯仿、異丁醇、正丁醇、對二甲苯正丁醇制法1+其他16正己烷、乙醇

32、、氯仿、異丁醇、正丁醇、對二甲苯氯仿制法1+其他17正己烷、乙醇、氯仿、異丁醇、正丁醇、苯乙烯異丁醇、正丁醇制法1+其他18甲醇、乙醇/制法419乙醇、氯仿、正丁醇氯仿、正丁醇制法1+其他20乙醇、氯仿、正丁醇氯仿、正丁醇制法1+其他21乙醇、氯仿、正丁醇氯仿、正丁醇制法1+其他22正己烷、乙醇、氯仿、異丁醇、正丁醇、鄰二甲苯氯仿、正丁醇制法1+其他23正己烷、乙醇、氯仿、異丁醇、正丁醇、鄰二甲苯氯仿、正丁醇制法1+其他24正己烷、乙醇、氯仿、異丁醇、正丁醇、鄰二甲苯氯仿、正丁醇制法1+其他25乙醇、正丁醇正丁醇制法126乙醇、正丁醇正丁醇制法127乙醇、正丁醇正丁醇制法128乙醇、正丁醇正丁

33、醇制法129正己烷、乙醇、氯仿、異丁醇、正丁醇氯仿、正丁醇制法1+其他30乙醇、氯仿、異丁醇、正丁醇氯仿、正丁醇制法1+其他31乙醇、氯仿、異丁醇、正丁醇氯仿、正丁醇制法1+其他32乙醇、氯仿、異丁醇、正丁醇氯仿、正丁醇制法1+其他結(jié)果顯示：32批樣品中溶劑檢出種類差別較大，主要原因是采用工藝制法不一致。采用正丁醇萃取工藝的樣品均檢出正丁醇，且大部分超標(biāo)，這是由于正丁醇沸點(diǎn)高（達(dá)117 ）以及干燥工藝不完善所致，該工藝制法成本較低，但由于正丁醇對人體具有刺激和麻醉作用，加之高沸點(diǎn)難揮發(fā)對環(huán)境會造成一定積蓄污染，因此建議該工藝限制使用。部分樣品中檢出甲醇，甲醇為二類溶劑，主要為乙醇中的甲醇?xì)埩艋?/p>

34、為降低成本直接使用含大量甲醇的工業(yè)酒精提取甚至直接使用甲醇提取。乙醇由于是工藝中正常引入，為三類溶劑，毒性較小，環(huán)境污染小，并且在32批樣品中未見較高殘留，故未將其納入技術(shù)要求。檢出二類溶劑氯仿，原因暫時(shí)不明，有待研究。9、重金屬（鉛、鎘、砷、汞）分別按GB 5009.12食品中鉛的測定、GB/T 5009.15食品中鎘的測定、GB/T 5009.11食品中總砷及無機(jī)砷的測定、GB/T 5009.17食品中總汞及有機(jī)汞的測定規(guī)定的方法進(jìn)行測定。根據(jù)樣品測定結(jié)果，參照WM/T 2-2004藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、GB 2762-2005食品中污染物限量標(biāo)準(zhǔn)、GB 16740-1997

35、保健(功能)食品通用標(biāo)準(zhǔn)，制定如下限度。見表7。 表7 鉛、鎘、砷、汞測定結(jié)果及限度指標(biāo)重金屬限度（mg/kg）鉛/（以Pb計(jì)，mg/kg） 0.5鎘/（以Cd計(jì)，mg/kg） 0.3砷/（以As計(jì)，mg/kg） 0.3汞/（以Hg計(jì)，mg/kg） 0.210、農(nóng)藥殘留測定按GB/T 5009.19食品中有機(jī)氯農(nóng)藥多組分殘留量的測定規(guī)定的方法進(jìn)行測定。32批樣品測定后均未檢出六六六、滴滴涕和五氯硝基苯。根據(jù)WM/T 2-2004藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、GB 2763-2005食品中農(nóng)藥最大殘留限量，確定限度如下，見表8。表8 絞股藍(lán)提取物有機(jī)氯農(nóng)藥殘留限度表六六六/（mg/kg） 0

36、.1滴滴涕/（mg/kg） 0.1五氯硝基苯/（mg/kg） 0.111、特征圖譜目前研究證實(shí)，絞股藍(lán)中含有80多種皂苷類成分，絞股藍(lán)提取物中成分復(fù)雜，為了有效鑒別提取物的真?zhèn)?，我們對其開展特征圖譜研究，以尋找不同產(chǎn)區(qū)、采收時(shí)間、提取部位的絞股藍(lán)采用不同工藝制法生產(chǎn)的絞股藍(lán)提取物之間的共同特征。（1）儀器與試劑Waters Alliance HT高效液相色譜儀，Empower工作站；奧泰2000型蒸發(fā)光散射檢測器，紫外2487檢測器；甲醇，分析純；乙腈，色譜純；水，高純水；絞股藍(lán)皂苷XL IX對照品由陜西省食品藥品檢驗(yàn)所與西安鴻程生物科技有限公司合作提取精制（UV和ELSD檢測器測定歸一化法含

37、量均大于99.0%）。（2）色譜條件的選擇與優(yōu)化 由于絞股藍(lán)提取物中以皂苷成分為主，且組分較多，試驗(yàn)中我們選擇了Krromasil C18，迪馬C18，艾杰爾C18，安捷倫C18等多款色譜柱，均不能達(dá)到有效分離，而資生堂CAPCELL PAK C18 MG 可滿足檢測需求，故作為試驗(yàn)用色譜柱。由于特征圖譜不同于一般含量測定，相對保留時(shí)間會因固定相規(guī)格、品牌等的不同產(chǎn)生變化，故在本項(xiàng)試驗(yàn)中我們確定資生堂CAPCELL PAK C18 MG 作為試驗(yàn)用色譜柱，不代表我們認(rèn)可或推薦該品牌，檢測時(shí)也可使用其他類型相當(dāng)?shù)纳V柱進(jìn)行。A.色譜柱耐用性試驗(yàn)圖5 同一類型色譜柱，不同批次，資生堂色譜柱比對B.

38、檢測器選擇試驗(yàn)圖6 檢測器選擇試驗(yàn)（上為UV，下為ELSD）C.色譜條件的確定圖7 同一根資生堂色譜柱，不同流動(dòng)相洗脫體系比對（上為最終確定體系）由A、B實(shí)驗(yàn)可以看出，CAPCELL PAK C18 MG （3.0×100mm，3um）可以滿足檢測要求，并且檢測時(shí)間短，分離效能高，耐用性良好。蒸發(fā)光散射檢測器基線較紫外檢測器略為平穩(wěn)，但考慮到方法的普遍適用性，最終選擇紫外檢測器。色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱CAPCELL PAK C18 MG 3.0×100mm，3um；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按表16中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為203nm；理論塔板

39、數(shù)按絞股藍(lán)皂苷XL IX峰計(jì)算應(yīng)不低于10000。表9 流動(dòng)相梯度表時(shí)間（min）流速（mL/min）流動(dòng)相A（%）流動(dòng)相B（%）00.52575150.53565350.54555400.54555410.52575（3）參照物溶液的制備取絞股藍(lán)皂苷XL IX對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含0.5 mg的溶液，即得。（4）供試品溶液的制備取本品50 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理5min，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 m）濾過，取續(xù)濾液，即得。（5）測定方法分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液5 L，注入高效液相色譜儀，測定，即得

40、。見圖8、9圖8 部分樣品特征圖譜圖9 部分樣品特征圖譜（6）結(jié)果判斷綜合比較分析，各地絞股藍(lán)提取物雖然原料產(chǎn)地、產(chǎn)期，提取物生產(chǎn)工藝等有所不同，但其皂苷類成分特征仍十分明顯，多批樣品特征峰吻合。該方法可作為絞股藍(lán)提取物真?zhèn)舞b別方法。最終確定特征峰及要求如下：供試品特征圖譜中應(yīng)呈現(xiàn)6個(gè)特征峰，與參照物峰相應(yīng)的為S峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對保留時(shí)間，應(yīng)在規(guī)定值的±5%范圍之內(nèi)。相對保留時(shí)間規(guī)定值為：0.59（峰1）、1.00（峰S）、1.27（峰2）、1.42（峰3）、2.08（峰4）、2.60（峰5）。54321S圖10 對照特征圖譜（7）參照峰的選擇及樣品溶液穩(wěn)定性我們對同一份絞

41、股藍(lán)提取物樣品溶液（批號：20101001）進(jìn)行穩(wěn)定性研究，結(jié)果表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。24 h后絞股藍(lán)皂苷XLIX峰依舊無明顯變化，但絞股藍(lán)皂苷-A開始明顯出現(xiàn)遞減趨勢，直至峰消失，同時(shí)有峰呈增長趨勢，見圖11。該試驗(yàn)說明，絞股藍(lán)皂苷XLIX作為參照物具有純度高、穩(wěn)定性良好等明顯優(yōu)勢，而絞股藍(lán)皂苷-A在樣品中穩(wěn)定性較差，不宜作為參照物。圖11 峰轉(zhuǎn)化示意圖（自上向下檢測時(shí)間依次為30 h、35 h、40 h、45 h、50 h、60 h）12、微生物指標(biāo)菌落總數(shù)按GB 4789.2規(guī)定的方法檢驗(yàn)；大腸菌群按GB 4789.3規(guī)定的方法檢驗(yàn)；霉菌和酵母菌按GB 4789.15規(guī)定的

42、方法檢驗(yàn)。32批樣品均符合規(guī)定。六、功效成分/標(biāo)志性成分1、絞股藍(lán)皂苷XLIX該項(xiàng)目色譜條件、對照品溶液配制（即參照物溶液配制）、樣品處理方法等均同【特征圖譜】項(xiàng)下，不再贅述。（1）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)采用【特征圖譜】項(xiàng)下色譜條件，絞股藍(lán)皂苷XL IX與其他色譜峰完全達(dá)到基線分離。見圖12、13。圖12 絞股藍(lán)皂苷XL IX對照品示意圖圖13 絞股藍(lán)皂苷XL IX對照品示意圖（2）線性考察精密稱取絞股藍(lán)皂苷XL IX對照品，加甲醇配制成每1 mL分別含絞股藍(lán)皂苷XL IX 0.050mg、0.10mg、0.20 mg、0.50 mg、1.00 mg、2.00 mg的溶液，進(jìn)樣5 L，測定。以峰面積積

43、分值為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量（g）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明絞股藍(lán)皂苷XL IX在進(jìn)樣量為0.02510.0 g范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為：Y=7.070×105X+4004.3，=0.9999。（3）精密度考察精密吸取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積積分值，RSD為0.55%。表明本方法精密度良好。（4）穩(wěn)定性考察精密吸取供試品溶液，每隔一定時(shí)間進(jìn)樣一次，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積積分值，結(jié)果RSD為0.94%，表明供試液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。（5）重復(fù)性試驗(yàn)取樣品（批號為20101001）6份，進(jìn)行測定，結(jié)果RSD為1.7%，表明本方法重復(fù)性良好。（6）回收率取已知

44、含量的樣品（批號：20101001），進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)，取樣品約50 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，精密加入濃度為6.02 mg/mL的絞股藍(lán)皂苷XL IX對照品溶液1 mL，再加甲醇適量，超聲處理5min，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 m）濾過，取續(xù)濾液，即得，進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為98.69%，RSD為0.62%。（7）樣品測定取32批絞股藍(lán)提取物樣品，按供試品溶液的制備方法制備供試液，進(jìn)行測定。結(jié)果顯示樣品中絞股藍(lán)皂苷XL IX含量測定結(jié)果相差較大，考慮到不同工藝的差別以及原料產(chǎn)地差異，暫將含量測定限度定為每100 g絞股藍(lán)提取物中含絞股

45、藍(lán)皂苷XL IX不得少于7.0 g。2、絞股藍(lán)總皂苷絞股藍(lán)提取物主要成分為絞股藍(lán)皂苷，市場上銷售的一般分有80%、90%、98%等規(guī)格，衛(wèi)生部部標(biāo)準(zhǔn)【W(wǎng)S3-Z-006-93(Z)】上測定絞股藍(lán)總甙的方法為香草醛-冰乙酸顯色法。（1）儀器與試劑試藥島津UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。（2）方法選擇采用三種方法即衛(wèi)生部部標(biāo)準(zhǔn)【W(wǎng)S3-Z-006-93(Z)】中總皂苷處理方法、文獻(xiàn)方法和我所起草的方法進(jìn)行比對。取4批絞股藍(lán)提取物，進(jìn)行測定，結(jié)果見表23。A. 部標(biāo)方法：精密稱取本品100 mg，加甲醇溶解，制成每1 mL含2 mg的溶液，作為供試品溶液。B.

46、文獻(xiàn)方法：稱取供試品100 mg，用濾紙包好,放于索氏提取器中，乙醚回流提取1 h，揮干濾紙包，加1 mL水，潤濕樣品后，加20 mL水飽和正丁醇，超聲30 min，共4次，合并正丁醇提取液，加2倍量水萃取，棄去水層，正丁醇層水浴揮干，甲醇定容至10 mL。C. 起草方法：精密稱取本品100 mg，置離心管中，加石油醚（3060 ）10 mL，超聲處理10 min，離心（5000 r以上）5 min，棄去上清液，殘?jiān)鼡]干，加甲醇分次溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 m）濾過，取續(xù)濾液，即得。絞股藍(lán)皂苷XL IX對照品溶液：取60 減壓干燥3 h的絞股藍(lán)

47、皂苷XL IX對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液。測定方法：精密吸取對照品溶液及供試品溶液各100 L，分別置15 mL具塞試管中，揮干，精密加入新配制的含5%香草醛冰乙酸溶液與高氯酸（2：8）的混合液2 mL，搖勻，密塞，置60 水浴中加熱15 min，取出，立即放入冷水中冷卻2 min，精密加入冰乙酸10 mL，搖勻，以試劑作空白，照紫外-可見分光光度法（中國藥典2010年版一部附錄V A）試驗(yàn)，在555±5 nm波長處測定吸收度，計(jì)算，即得。表10 處理方法比較批號A方法（g/100 g）B方法（g/100 g）C方法（g/100 g）201010019

48、4.4991.7992.702010100295.1093.1093.202007060187.9866.2467.982010031266.6454.1853.01對于批號為20100312的樣品，我們采用B法進(jìn)一步做了萃取后水的檢查試驗(yàn)，即將水揮干，甲醇定容，取適量按人參皂苷測試法操作，發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入顯色劑后，試管中的液體即變成翠綠色，加熱后則變?yōu)樯罴t色，其吸收值很高，這種敏物質(zhì)可能是影響測試的主要因素。檢測結(jié)果可以看出，A方法測定結(jié)果虛高，可將一些摻雜樣品總皂苷含量測定值人為增大；B法與C法結(jié)果接近，故采用更為簡單、回收率更高的C法作為本技術(shù)要求方法。由于絞股藍(lán)提取物成分復(fù)雜，許多雜質(zhì)對顯

49、色反應(yīng)影響較大，采用直接稱量-定容-比色法（A法），測得值較高，加標(biāo)回收率為121.2%，因此在顯色處理前增加石油醚處理精制，精制后定容-比色，測得值較為合理，此步處理后的樣品干擾小，加標(biāo)回收率95.1%，測定值更接近真值。本方法中采用絞股藍(lán)皂苷XL IX為對照，代替絞股藍(lán)皂苷-A。（3）線性關(guān)系考察取60 減壓干燥3 h的絞股藍(lán)皂苷XL IX對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液。精密吸取上述絞股藍(lán)皂苷XL IX對照品溶液50 L、100 L、200 L、400 L、600 L分別置10 mL具塞試管中，揮干，精密加入新配制的含5%香草醛冰乙酸溶液與高氯酸（2:8）的混合液2 mL，搖勻，密塞，置60 水浴中加熱15 min，取出，立即放入冷水中冷卻2 min，冰乙酸定容至10 mL，搖勻，以試劑作空白，照紫外-可見分光光度法（中國藥典2010年版一部附錄V A）試驗(yàn)，在555±5 nm波長處測定吸收度，以絞股藍(lán)皂苷XL IX質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果線性范圍為50600g/mL，回歸方程為Y=1.0415X+0.0113（r=0.