實驗六氨基酸的紙層析法

1、氨基酸的紙層析法一目的了解并掌握氨基酸紙層析的原理和方法。二、原理以濾紙為支持物的層析法，稱為紙層析法。紙層析所用展層劑大多由水和有機溶劑組成。展層時，水為靜止相，他與濾紙纖維親和力強；有機溶劑為流動相，它與濾紙纖維親和力弱。有機溶劑在濾紙上又下向上移動的，稱為上行法；有上向下移動的，稱為下行法。 將樣品在濾紙上確定的原點處展層，由于樣品中各種氨基酸在兩相中不斷進行分配，且他們的分離系數(shù)各不相同，所以不同的氨基酸隨流動相移動的速率也不相同，于是各種氨基酸在濾紙上就相互分離出來，形成距原點不等的層析點。在一定條件下（室溫、展層劑的組成、濾紙的質(zhì)量、PH值等不變），不同的氨基酸有固定的移動速率（R

2、f值）Rf=原點到層析點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離。用混合氨基酸做樣品時，如果只用一種溶劑展層，由于某些氨基酸的移動速率相同或相近，就不能將它們分開，為此，當用一種溶劑展層后，可將濾紙旋轉(zhuǎn)90度，以第一次所的層析點為原點，在用另一溶劑展層，從而達到分離的目的。這種方法稱為雙向?qū)游龇?。本試驗主要介紹的是單向?qū)游龇?。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸組成。三、實驗儀器 1、新華濾紙 2、層析缸 3、細線 4、點樣管 5、橡皮筋 6、電吹風 7、噴霧器四、實驗試劑1、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸）2、展層劑：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸餾水=13：3：3：1（v:v）3、0

3、.5%茚三酮無水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml無水丙酮，貯于棕色瓶中 五、實驗步驟 1、取濾紙剪成2010厘米的濾紙條一張，在一端打孔，系一根細線，在另一端23cm處用鉛筆畫一橫線，中間畫一圓點（原點）。 2、取毛細管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原點處點樣，樣點直徑不宜超過5mm,每點一次用吹風機吹干，點23次為佳。 3、點樣后將濾紙放入層析缸中展層，注意點樣線要高于層析液面，濾紙不要貼在層析缸璧上，當展層至另一端12cm處時，停止展層（大約23小時）。 4、取出濾紙，用鉛筆記下溶劑前沿，然后用熱風吹干（或烘箱60）烘干。 5、均勻噴上茚三酮無水丙酮液，注意使溶液不倒流，不間斷。

4、 6、用吹風機吹干，觀察層析點，確定其幾何中心。 7、量取數(shù)值，計算各自的Rf值，與表中標準氨基酸Rf值比較，確定樣品氨基酸種類。（書上圖譜橫著看）六實驗結(jié)果從左到右依次為H、H1、H2、H3、H4。H1=1.0cm H2=4.4cm H3=5.0cm H4=0.99cm H=11.7cm由此可得Rf1=0.08547Rf2=0.37607Rf3=0.42735Rf4=0.08461據(jù)此可知，混合氨基酸是由甘氨酸（Gly）和苯丙氨酸（Phy）組成。七實驗分析實驗中出現(xiàn)了拖尾的現(xiàn)象。拖尾現(xiàn)象是指展層，顯色后在層析分配圖上，所看到的某一種氨基酸的分子位移，不是如標準圖譜所示的那樣，完整地顯示在某一

5、位置上，而是形成象笤帚似的那樣，前端粗圓而逐漸細小下來，宛如拖著一個尾巴。其圖所呈顏色也是由濃漸淡。圖象的出現(xiàn)，是在實驗中對影響Rf值的主要因素要求，掌握不夠所致。諸如，物質(zhì)結(jié)構(gòu)與極性對Rf值的影響，層析溶劑對Rf值的影響，PH對Rf值的影響(溶劑、濾紙和樣品的PH值)，溫度對Rf值的影響，濾紙的質(zhì)地是否均勻，薄厚是否適當，纖維的松緊度是否適中等對Rf值的影響，展層的方式(上行、下行)對Rf值的影響。然而在多次實驗過程中無論怎佯嚴格遵循其影響Rf值的主要因素的要求，都仍不可避免地要出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。此時，這就需要從具體操作規(guī)范方面，諸如樣品的處理，點樣、展層、顯色等幾個操作程序去考慮思索，經(jīng)仔細分

6、析，樣品的處理是為除去雜質(zhì)純化樣品，達到層析分配某氨基酸的情晰顯色圖像；展層過程是在上述影響Rf值的主要因素要求下進行，使樣品達到一個適當?shù)奈灰?，便于在顯色后從圖象上，區(qū)分不同樣品的氨基酸；顯色是在用配制好的，與水不相混合，并揮發(fā)性較快噴霧后迅速吹干的。更何況顯色劑又是含水量極低，不會影響洋品的斑點擴散，那么問題就集中在點樣這個操作程序上了。點樣是將被層析分配的幾種氨基酸混合液，和為了對照實驗結(jié)果，而分別配制的幾種氨基酸的溶液，用微量點樣管或毛細管，或血球計數(shù)器將5一j5微升的樣品，點在以濾紙為惰性支持物的層析紙上設計好的多點位置中去。點樣后要自然風干，或冷風吹干。最好不要用加熱裝置，如吹風機

7、，燈泡之類的熱源將其樣品點加速干燥。因為加熱裝置在學生操作時，一但注意不夠，掌握不好，則溫度升高勢必要使樣品破壞，更會使佯品點干的太燥。正是由于這樣，樣品點太干燥，使其樣品物的分子，牢固地吸牢在層析紙的纖維上。所以在展層過程中，樣品點的每個物質(zhì)分子，不能在層析紙上同時起步，而是形成了有先有后，魚貫而上行或下行的狀況，最終使洋品物質(zhì)的分子，不能同時都集中到達一個位置。致使在顯色后，實驗結(jié)果的圖象上，觀察到的不是一個完整的斑點，而是一個拖著尾巴的斑點。這就是上述所說的拖尾現(xiàn)象。 紙上分配層析所出現(xiàn)的拖尾現(xiàn)象，究其原因很簡單，就是在點樣品后，樣品點吹的太干燥所致。樣品點不要吹的太干燥，否則，樣品物質(zhì)

8、的分子，會牢吸在層析紙的纖維上，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象”。 影響 Rf值的主要因素 1.物質(zhì)結(jié)構(gòu)對于Rf值的影響：“物以類聚”，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑(水)中，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑(有機溶劑)中。所以物質(zhì)的極性大小決定了物質(zhì)在水和有機溶劑之間的分配情況。例如酸性和堿性氨基酸極性大于中性氨基酸。所以前者在水(固定相)中分配較多，因此Rf值低于后者。 2.溶質(zhì)與溶劑間的相互作用對Rf值的影響：這種影響是由溶質(zhì)與溶劑間的相互作用與分配系數(shù)的關系所決定的。溶質(zhì)與溶劑之間若能形成氫鍵，對分配系數(shù)的影響就很大。例如酚、三甲基吡啶、氨等和水混合后都能很好地與溶質(zhì)形成氫鍵。某些溶劑(例如酚，正丁醇等)是質(zhì)子的供給

9、體，而水既是質(zhì)子的供給體又是質(zhì)子的接受體。當溶質(zhì)結(jié)構(gòu)中增加能接受質(zhì)子的基團(例如NH )時，因酚與水都能給 NH 基提供質(zhì)子，所以酚和水兩相對接受質(zhì)子的基團的引力，基本上是一致的，因此當溶質(zhì)結(jié)構(gòu)中增加氨基時，該物質(zhì)與酚和水的作用對其在酚和水兩相間的分配影響不大，對Rf值影響較小。又例如當有機溶劑是質(zhì)子的接受體(如三甲基吡啶，NH 3 等)，而溶質(zhì)也是質(zhì)子的接受體(如-NH 基)，這時有機溶劑對-NH 沒有引力，而水卻有引力，于是水的引力就大于有機溶劑，因此溶質(zhì)就被水拉向水相，對Rf值的影響就大。 3.pH對Rf值的影響：這種影響主要是由pH與分配系數(shù)的關系所決定的。弱酸與弱堿的解離度受pH影響

10、很大，解離度越大，極性越強，極性強的物質(zhì)在兩相溶劑中分配時，偏向于極性強的一相，這樣，改變pH就會同時改變分配系數(shù)，從而使Rf也會相應變化。在氨基酸的層析法中，改變?nèi)軇┑膒H，使酸性和堿性氨基酸的Rf值變動較大，而中性氨基酸的Rf值變動較小。在正丁醇中加甲酸，可使酸性氨基酸的極性降低，從而使Rf值變大，而使堿性氨基酸的Rf變小。反之，如在正丁醇中加氨，可使天冬氨酸和谷氨酸的Rf值變小，而使賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸的Rf值變大。 4. 濾紙對Rf值的影響：濾紙本身的pH及含水量對Rf值的影響很大，所以不同的濾紙得到不同的Rf值及不同的斑點形狀。紙上含水量的多少隨溶劑與紙對水的親和力的大小而異，

11、質(zhì)地不均一的濾紙常使溶劑擴展不一致，隨著纖維的紋理流動紊亂，另一方面紙的含水量不均一，也不能得到理想的分離效果。 5.溫度對 Rf值的影響： Rf值的重現(xiàn)性與恒溫情況的好壞有密切關系。溫度對Rf 值的影響主要是因為溶質(zhì)在固體相與流動相之間的分配隨溫度的變化而不同。隨各溶劑組分的粘度和表面張力的不同其蒸發(fā)能力也不同，因此有些溶劑系統(tǒng)對溫度的敏感程度強些，有些則差些。敏感程度強的對溫度的要求就嚴格，敏感程度差的對溫度的要求就不太嚴格。溫度改變使溶劑系統(tǒng)中的溶解度改變，所以 Rf值也改變。一般層析展層是在恒溫室中進行的，室溫可在20至40，溫度改變不超過0.5。 無色物質(zhì)的層析圖譜可用光譜法 (如核苷酸類物質(zhì)用紫外光照射)或顯色法鑒定。氨基酸紙上層析圖譜常用的顯色劑有茚三酮、吲哚醌。本實驗采用茚三酮為顯色劑。茚三酮顯色反應受溫度、pH，時間影響較大。如果要使結(jié)果重復，必須嚴格控制上述條件。樣品中如含有大量鹽酸會使氨基酸不顯出顏色。樣品中含大量鹽時顯色點上會出現(xiàn)白