westernblot總結(jié)前人的經(jīng)驗(yàn)

1、Western blot1.實(shí)驗(yàn)的原理2.試劑的配制3.實(shí)驗(yàn)的步驟4.凝膠圖象分析 實(shí)驗(yàn)的原理實(shí)驗(yàn)室所用的試劑的配方參考TAKARA分子實(shí)驗(yàn)常用配方手冊(cè)l蛋白樣品的制備 SDS-PAGE 轉(zhuǎn)膜 封閉 一抗雜交 二抗雜交 底物顯色蛋白樣品的制備參考RIPA 裂解液的說(shuō)明書： 對(duì)于對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞樣品培養(yǎng)細(xì)胞樣品： 1.取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入 PMSF，PMSF 的工作濃度為 1X2.對(duì)于貼壁細(xì)胞，去除培養(yǎng)液，用 PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗兩遍。加入適量的裂解 液（約為細(xì)胞體積的 5-7 倍），用移液器吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。冰上放置20min，14000g 離心 10

2、 分鐘，取上清，即為 蛋白提取物。3 .對(duì)于懸浮細(xì)胞，2500g離心5min收集細(xì)胞，用 PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液漂洗細(xì)胞，2500g離心5min收集細(xì)胞,加入適量裂解液. （約為細(xì)胞體積的 5-7 倍）。用移液器吹打數(shù)下，把細(xì)胞吹散，冰上孵育20min，14000g 離心 10 分鐘，取上清，即為 蛋白提取物。對(duì)于組織樣品：對(duì)于組織樣品： 1.手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的生理鹽水中，漂洗數(shù)次，洗凈組織血跡，用濾紙吸干組 織表面液體，將組織稱量后切成幾個(gè)較小的組織塊放入勻漿器中。 2.取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入 PMSF,使 PMSF 的最終濃度為 1x。 3.按組織凈重（

3、g）：裂解液(ml)=1：10 的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿(如果裂解 不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液, 如果需要高濃度的蛋白樣品, 可以適當(dāng)減少裂解液的 用量) 。 4.勻漿器勻漿,冰上孵育 20min，直至充分裂解。 5.充分裂解后, 14000g 離心 10 分鐘,取上清,即為蛋白提蛋白濃度的測(cè)定使用BCA法測(cè)，詳細(xì)步驟參考說(shuō)明書:(1) 取 1.2ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到一管蛋白標(biāo)準(zhǔn)（30mg BSA）中，充分溶解后配制成 25mg/ml 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制后可立即使用，也可-20長(zhǎng)期保存； (2) 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：取適量 25mg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)，稀釋至 0.5mg/ml(蛋

4、白樣品在什么溶液中，標(biāo) 準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但為了簡(jiǎn)便起見，也可以用 0.9%NaCl 或 PBS 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品)。 稀釋后的 0.5mg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)也可-20長(zhǎng)期保存； (3) 配制 BCA 工作液：按 50 體積試劑 A 加 1 體積試劑 B 配制適量工作液，充分混勻（配 制的量視樣本量而定，200l/孔）。工作液室溫 24 小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。 (4) 加標(biāo)準(zhǔn)品：將標(biāo)準(zhǔn)品按 0、1、2、4、8、12、16、20l 加入 96 孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中（做 副孔），加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到 20l。 (5) 加樣品：加 2l 樣品到 96 孔板的樣品孔中，加 18l PBS(好用 1%SDS 或裂解液，

5、保 持與原樣本中的一致)，使總體積達(dá)到 20l。 (6) 加工作液：每孔加入 200l 步驟 2 所配制工作液。 (7) 37靜置 20-30 分鐘?？墒覝胤胖?2 小時(shí)。 (8) 酶標(biāo)儀測(cè)定 A562，540-595nm 之間的波長(zhǎng)也可接受。 (9) EXCEL 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的蛋白濃度。 附 SDSPAGE 電泳 q不連續(xù)的電泳緩沖體系。qSDS蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳時(shí)，不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀的影響，而只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。SDS-PAGESDS-PAGE 是在蛋白質(zhì)樣品中加入是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDSSDS和含有巰基乙醇的樣和含有巰基乙醇的樣品處理液，品處理液，

6、是一種很強(qiáng)的是一種很強(qiáng)的，它可以，它可以，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。級(jí)結(jié)構(gòu)。強(qiáng)還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，強(qiáng)還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，DTTDTT）可以可以斷開二硫斷開二硫鍵破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)鍵破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與SDSSDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)-SDS-SDS復(fù)合物。復(fù)合物。蛋白質(zhì)分子結(jié)合蛋白質(zhì)分子結(jié)合SDSSDS陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超 過(guò)了它原有的凈電荷，從而消除了不同種

7、蛋白質(zhì)之間所過(guò)了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所 帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于亞基亞基 的的相對(duì)分子質(zhì)量，而與其所帶電荷的性質(zhì)無(wú)關(guān)相對(duì)分子質(zhì)量，而與其所帶電荷的性質(zhì)無(wú)關(guān)SDS：陰離子去污劑陰離子去污劑 變性劑變性劑氨基酸側(cè)鏈與氨基酸側(cè)鏈與SDSSDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-SDS-SDS膠束。膠束。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-SDS-SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了膠束所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不 同分同分子之間原有的電荷差異。子之間原有的電荷差

8、異。與強(qiáng)還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵與強(qiáng)還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開，使蛋白質(zhì)分子線性化。打開，使蛋白質(zhì)分子線性化。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-SDS-SDS膠束的特點(diǎn)：膠束的特點(diǎn)：（1）具有相同的形狀，形狀像一個(gè)長(zhǎng)橢圓棒（2）平均1g 蛋白質(zhì)結(jié)合1.4g SDS（3）短軸對(duì)不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的（4）長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度則與亞基分子量的大小成正比SDS-PAGESDS-PAGE凝膠的有效分離范圍 SDSPAGE 電泳詳細(xì)過(guò)程（1） 清洗玻璃板： 一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過(guò)后用自來(lái)水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干（2） 灌膠與上樣 1、 玻璃板對(duì)齊

9、后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（操作時(shí)要 使兩玻璃對(duì)齊，以免漏膠。） 2、 根據(jù)蛋白大小配制一定濃度的分離膠，加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)， 可用 1ml 槍吸取 5ml 膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。 然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時(shí)開始可快一些，膠面 快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才 不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。） 3、 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說(shuō)明膠已凝了。再等 3min 使膠充分凝固 就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。 Western Blot灌制分離膠灌制分離膠 隔絕

10、空氣隔絕空氣ddH2O0.1%SDS:8%4、 按前面方法配 5的濃縮膠,加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。將剩余空 間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以 免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收 縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過(guò)程中要經(jīng) 常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕 輕將其拔出。5、 用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板 面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向 外。） 6、 測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含 50g 蛋白的溶液體積即為上

11、樣量。取出上樣樣 品至 PCR管中，加入 5SDS 上樣緩沖液至終濃度為 1。（5SDS 上樣緩沖液事先跟巰基巰基乙醇按乙醇按1ml1ml加加50ul50ul配好配好。）上樣前要將樣 品于沸水中煮 5min 使蛋白變性 Western Blot灌制積層膠灌制積層膠 插入梳子插入梳子 7、 加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過(guò)內(nèi)測(cè)的小玻璃板。） 用微量移液槍貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將移液槍的槍頭插 至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也 可能使樣品溢出），沒加一個(gè)樣品要換一次槍頭（3） 電泳 電泳時(shí)間一般 1.5h，電壓為 濃縮膠80V 較好，

12、分離膠120V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止 電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。 Western BlotStaking gelSeparating gel 轉(zhuǎn)膜 （1） 轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備 6 張 5x9cm的濾紙和 1 張 4x8cm的PVDF膜。切 濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。將切好的膜 置于甲醇中浸 15秒才可使用。（2） 在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和 浸過(guò)的膜。 （3） 將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來(lái)回?fù){幾遍以 搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)。）在墊子上墊 三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子

13、上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去 其中的氣泡。 （4） 要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。 撬一會(huì)兒玻璃板便開始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板很易裂。） 除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。 小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。 將膜蓋于膠上，要蓋滿整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并除氣泡。在膜上蓋 3 張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作 在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。（5） 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對(duì)槽的黑面，夾的白面對(duì)槽的紅面。電

14、 轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來(lái)降溫。一般用 恒流300mA,轉(zhuǎn)2h（6） 轉(zhuǎn)完后將膜用 1麗春紅染液染 5min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染 上的染液就可看到膜上的蛋白。 將膜晾干備用。(此步可以省略) 免疫反應(yīng) （1） 將膜用 TBST從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖 動(dòng)封閉 1h。 （2） 將一抗用 TBST 稀釋至適當(dāng)濃度（在 1.5ml 離心管中）。剪一大小合適的雜交袋，取出膜，在濾紙上沾幾下（PVDF 膜需保持濕的狀態(tài)）， 放入雜交袋中，加入一抗后，用封口機(jī)封閉在袋內(nèi)，趕盡氣泡，4 過(guò)夜（指 12 小時(shí)）。 或者室溫?fù)u床1.5h. 取出濾膜用

15、 TBST 漂洗 3 次，每次 10min（室溫，平緩搖動(dòng)）。 （3） 同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育 1.5h 后，用 TBST 在室溫 下脫色搖床上洗三次，每次 10min；（1） 將 A 和 B 兩種試劑在保鮮膜上等體積混合；1min 后，將膜蛋白面朝下與此混 合液充分接觸；1min 后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入 X光片夾中 （2） 在暗室中，將 1顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出 X光片， 用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L(zhǎng)和寬均需大 1cm）；打開 X-光片夾，把 X 光片放在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上 X-光片夾，開始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號(hào) 的

16、強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為 1min 或 5min，也可選擇不同時(shí)間多次壓片， 以達(dá)最佳效果；曝光完成后，打開 X-光片夾，取出 X-光片，迅速浸入顯影液中 顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時(shí)間一般為 12min（2025 ），溫度過(guò)低時(shí)（低于 16）需適當(dāng)延長(zhǎng)顯影時(shí)間；顯影結(jié)束后，馬上把 X光片浸入定影液中，定影時(shí)間一般為 510min，以膠片透明為止；用自來(lái)水沖 去殘留的定影液后，室溫下晾干。 應(yīng)注意的是：顯影和定影需移動(dòng)膠片時(shí)，盡量拿膠片一角，手指甲不要?jiǎng)潅z片，否則會(huì)對(duì) 結(jié)果產(chǎn)生影響。全程不要用鑷子去夾。凝膠圖象分析 將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)對(duì)目的條帶進(jìn)行光

17、密度定量。計(jì)算出相對(duì)表達(dá)量，然后作條形圖。常見的一些問(wèn)題與分析1.暗處觀察膜，明明發(fā)現(xiàn)只有一條熒光帶，為何我顯影出來(lái)的條帶卻很多，形成了拖尾現(xiàn)象？答：主要是將膠片放到膜上后，還在拖動(dòng)它，取出膠片的時(shí)候，要小心，盡量不要拖動(dòng)膠片，可以將整個(gè)壓片盒倒轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)打開。2.為何每次洗出來(lái)的條帶都是很粗，每個(gè)樣品之間的間隔很小呢？答：這是一個(gè)常見的問(wèn)題，有些人的做法是減少上樣量，但最后還是出現(xiàn)了同樣的問(wèn)題。其實(shí)關(guān)鍵在于顯影的技巧，當(dāng)膠片在顯影液中，剛出現(xiàn)條帶時(shí)，叫要立刻拿上來(lái)了，然后條帶會(huì)慢慢變粗，當(dāng)達(dá)到想要的效果時(shí)，立刻放到定影液中定影。3.膠帶顯影出來(lái)后，出現(xiàn)了幾條條帶，我怎么知道哪個(gè)是我們的目的條帶，還有哪個(gè)樣品是多少號(hào)怎么看？答：顯影完后，晾干，拿去跟膜進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)mark的大小標(biāo)出相應(yīng)條帶的大小，這里關(guān)鍵在于，壓片的時(shí)候，放膠片一定要按正確的方式放，一般膠片半圓角的兩邊要跟壓片盒的左上角的兩邊緊挨著對(duì)齊。用梳子去跟膜和膠片匹對(duì)就可以找出每個(gè)加樣孔的位置了。4.為什么我轉(zhuǎn)膜后，沒有看到膜上有marker?答：很有可能是你轉(zhuǎn)膜的時(shí)，方向搞錯(cuò)了