槲皮素對(duì)非酒精性脂肪肝細(xì)胞ATP結(jié)合框轉(zhuǎn)運(yùn)子A1mRNA表達(dá)的影響

1、槲皮素對(duì)非酒精性脂肪肝細(xì)胞ATP結(jié)合框轉(zhuǎn)運(yùn)子A1 mRNA表達(dá)的影響【摘要】 目的： 探討植物化學(xué)物質(zhì)槲皮素(quercetin)對(duì)非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver，NAFL)細(xì)胞三磷腺苷結(jié)合框轉(zhuǎn)運(yùn)子A1(ABCA1)表達(dá)的影響。方法： 建立人肝L02細(xì)胞脂肪變性模型，以不同濃度的槲皮素處理細(xì)胞后，用RTPCR檢測(cè)ABCA1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果： 槲皮素可以增加NAFL細(xì)胞ABCA1 mRNA的表達(dá)，且呈劑量依賴性。結(jié)論： 槲皮素能上調(diào)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)中的重要蛋白ABCA1的表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】 槲皮素; 非酒精性脂肪肝; 人肝L02細(xì)胞; 三磷腺苷結(jié)合框轉(zhuǎn)運(yùn)子A1A

2、bstract Objective: To study the effects of quercetin on the expression of ATPbindingcassette transporter A1(ABCA1) mRNA in nonalcoholic fatty liver(NAFL) cells. Methods： HL02 cells were cultured in 50% fetal cattle blood serum for 24 h to induce NAFL model, adding quercetin in different doses to the

3、 culture medium.The level of ABCA1 mRNA was tested by semiquantitative RTPCR. Results： After treatment with quercetin，the expression of ABCA1 was increased at the same time. Conclusion： Quercetin had some inhibitory effects on NAFL cells and the effect on these cells was mainly related to the upregu

4、lation of ABCA1.Key words quercetin; nonalcoholic fatty liver; HL02 cells; ATPbindingcassette transporter A1非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver，NAFL)病理學(xué)改變除三酰甘油(TG) 大量?jī)?chǔ)積外,尚有膽固醇(TC)在肝細(xì)胞內(nèi)的異常沉積。ABCA1 是ATP 結(jié)合框轉(zhuǎn)運(yùn)子(ATPbindingcassette transporter,ABC) 超家族的成員。研究表明,ABCA1 在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)、固醇代謝中起著極其重要的調(diào)節(jié)作用。近來從中草藥和天然植物

5、中提取的一些有效成分，已成為治療該類疾病的熱點(diǎn)和新途徑。除公認(rèn)的抗氧化劑普羅布考等西藥外，植物提取成分槲皮素(quercetin)也正獲得越來越多的關(guān)注。我們前期的試驗(yàn)證明，槲皮素能降低脂肪變?nèi)烁蜭02細(xì)胞總膽固醇及膽固醇酯含量，增加游離膽固醇的外流，下調(diào)膽固醇合成的限速酶HMGCoA還原酶的表達(dá)1。本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步研究槲皮素對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞膽固醇外流的作用及其相關(guān)機(jī)制，為治療膽固醇代謝性疾病開辟新途徑。1 材料和方法1 主要材料人肝L02細(xì)胞株購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。槲皮素、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，RTPCR試劑盒為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品?？?/p>

6、RNA提取試劑盒(Trizol)為上海生物工程公司產(chǎn)品。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。ABCA1和GAPDH引物均由上海生物工程公司合成。1.2 方 法1.2.1 人肝L02細(xì)胞培養(yǎng)及NAFL模型的建立 人肝L02細(xì)胞培養(yǎng)接種于50 ml培養(yǎng)瓶中，將含體積分?jǐn)?shù)10%的滅活胎牛血清、100 U/ml氨芐西林和100 g/ml鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基，置37、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每48 h換液1次，在細(xì)胞達(dá)1109時(shí)用完全培養(yǎng)基重新懸浮，并以13的比例傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前用無血清的 RPMI1640培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞周期同步化。參照范建高等2方法，在

7、更換新鮮培養(yǎng)液后加入50%的胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，即形成非酒精性肝脂肪變性模型(鏡像比較造模前后細(xì)胞內(nèi)的脂滴變化，組織學(xué)上低倍鏡下每單位面積見1/3以上的肝細(xì)胞脂肪變性和脂肪儲(chǔ)積，無其他明顯組織學(xué)改變)。加入槲皮素共同孵育24 h。1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為正常肝細(xì)胞組(培養(yǎng)24 h+24 h)，NAFL模型組(造模24 h+24 h)、小劑量組(造模24 h后，加槲皮素使其終濃度為10 mol/L，共同孵育24 h)、中劑量組(造模24 h后，加槲皮素使其終濃度為20 mol/L，共同孵育24 h)、大劑量組(造模24 h后，加槲皮素使其終濃度分別為40，80 mol/L，共同孵育

8、24 h)、普羅布考對(duì)照組(造模24 h后，加普羅布考使其終濃度為10 mol/L，共同孵育24 h)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，結(jié)果取平均值。1.2.3 ABCA1 mRNA的RTPCR檢測(cè) 收集培養(yǎng)的細(xì)胞，按Trizol試劑的說明書，分別提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)定量后，調(diào)整RNA的濃度為0.2 g/L。RTPCR的反應(yīng)體系為：兩對(duì)引物各1.0 l，10緩沖液 5 l，25 mmol/L MgSO4 1 l，10 mmol/L dNTP 混合物 0.5 l，DNA聚合酶0.5 ml及逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 l，用去離子水補(bǔ)至25 l。反應(yīng)條件為：48 45 min, 94 3 min;94 90 s,58

9、 1 min，72 1 min，共28個(gè)循環(huán)后，再于72延伸7 min。取RTPCR產(chǎn)物5 l，在10 g/L含溴乙啶的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析，在紫外燈下觀察結(jié)果。RTPCR引物序列參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)如下：ABCA1 上游引物5GGGAGGCTCCCGGAGTT3，下游引物5GTATAAAAGAAGCCTCCGAGCATC3，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1352 bp;GAPDH引物序列設(shè)計(jì)如下:上游引物5TCACCATCTTCCAGGAGCGAG3，下游引物5TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG3, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為697 bp。1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，多組數(shù)據(jù)的

10、比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。全部資料均用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。2 結(jié) 果瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在697 bp處均可見到均勻一致的GAPDH基因的條帶;各組在1 352 bp處均可見到ABCA1表達(dá)，正常組肝細(xì)胞弱表達(dá)，模型組細(xì)胞表達(dá)明顯更弱(圖1)。不同濃度槲皮素處理后，其表達(dá)呈濃度依賴性增強(qiáng)，其中槲皮素20，40，80 mol/L組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。3 討 論某些蛋白質(zhì)可以參與肝細(xì)胞中的游離膽固醇胞內(nèi)移動(dòng)及出胞，理論上亦可影響膽道膽固醇分泌。長(zhǎng)期以來人們都認(rèn)為膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于磷

11、酸脂的轉(zhuǎn)運(yùn)而非蛋白質(zhì)介導(dǎo)，但實(shí)際上對(duì)磷酸脂和膽固醇的協(xié)同尚不十分肯定。盡管到目前為止沒有一個(gè)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被確定下來，但是很可能存在一種蛋白質(zhì)介導(dǎo)的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)。ABCA1 是ATP 結(jié)合框轉(zhuǎn)運(yùn)子超家族的成員，存在于不同的組織,尤其在肝臟表達(dá)較多，通過水解ATP 轉(zhuǎn)運(yùn)許多底物到不同的部位。由于發(fā)現(xiàn)ABCA1 基因變異與丹吉爾病(TD)、家族性HDL 缺乏(family HDL deficiency，F(xiàn)HD) 的發(fā)生密切相關(guān)3，所以ABCA1 的結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)調(diào)控目前受到極大的關(guān)注。研究表明4,ABCA1 在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)、固醇代謝中起著極其重要的調(diào)節(jié)作用。ABCA1的主要功能是參與膽固

12、醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)，即將外周組織過多的膽固醇轉(zhuǎn)移至肝臟代謝的過程。ABCA1可將外周組織細(xì)胞內(nèi)的膽固醇和磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)至HDL前體apoA1,而這是膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的第一個(gè)限速環(huán)節(jié), 因此ABCA1對(duì)脂質(zhì)代謝具有重要影響。臨床研究證實(shí)5ABCA1基因突變可導(dǎo)致TD和家族性低脂蛋白血癥(FFA), 均表現(xiàn)為低高密度脂蛋白膽固醇血癥和早發(fā)冠心病。ABCA1基因的外周組織細(xì)胞過度表達(dá)可促進(jìn)膽固醇和磷脂的外流，增加血漿膽固醇、膽固醇脂等的濃度。膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)可阻止膽固醇積聚，是防止高膽固醇血癥的機(jī)制之一。Repa 等于2000年報(bào)道6：增加ABCA1的功能不僅可使巨噬細(xì)胞中膽固醇外流增加，提高膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)，而且可使腸黏膜細(xì)

13、胞中的膽固醇分泌增加，膽固醇吸收減少，認(rèn)為這也許是一條新的降低血漿膽固醇的途徑。槲皮素3,34,5,7-五羥基黃酮是天然黃酮類化合物，廣泛存在于多種植物中。許多研究已證實(shí)槲皮素有抗增殖、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗病毒等藥理作用，亦能抗肝纖維化，抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且毒副作用小，具有重要的臨床價(jià)值7。其藥理活性廣泛、安全、而且藥源充足，極具開發(fā)前景。我們的研究認(rèn)為，槲皮素降低肝細(xì)胞中的膽固醇，促進(jìn)膽固醇和磷脂的外流作用可能通過多靶點(diǎn)、多途徑，增強(qiáng)脂肪代謝相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)或活性，促進(jìn)膽固醇和磷脂的外流、阻止膽固醇積聚1。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)不同濃度的槲皮素處理脂肪變性肝細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示：槲皮素呈濃度依

14、賴性地增加ABCA1 mRNA的表達(dá)。由此可以推測(cè)：槲皮素降低膽固醇作用機(jī)制之一可能是上調(diào)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的重要蛋白ABCA1等的表達(dá)，且其作用效果呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。這為今后進(jìn)一步的研究提供了理論依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 張 潔,陽(yáng)學(xué)風(fēng),廖端芳,等.槲皮素對(duì)脂肪變性L02細(xì)胞膽固醇合成及羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶表達(dá)的影響J.中華肝臟病雜志,2007,15(2):143-145.2 范建高,曾民德.脂肪性肝病M.上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社, 2000:153.3 郭志剛,查 政,劉亞洋,等.HDL合成的關(guān)鍵基因ABCA1基因的變異及其臨床意義J.解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2006，31(4)：363-365

15、.4 Favari E, Zanotti I, Zimetti F,et al. Probucol inhibits ABCA1mediated cellular lipid effluxJ. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004，24(12):2345-2350.5 Vaisman BL,Lambert G,Amar M,et al. ABCA1 over expression leads to hyperalphalipoproteinemia and increased biliary cholesterd excretion in transgenimic miceJ.J Clin Invest,2001,1