椎間盤突出癥自身免疫學說的研究進展

1、內(nèi) 容 摘 要目的：1.觀察應(yīng)用醫(yī)用臭氧介入治療腰椎間盤突出癥患者血清中 IgG、IgM、TNF-、IL-6、IL-10、IL-12 水平的變化。2.探討腰椎間盤突出癥的自身免疫機制和醫(yī)用臭氧介入治療腰椎間盤突出癥可能的免疫作用機理。方法：以 2006.6-2008.8 葛洲壩行醫(yī)用臭氧介入治療腰椎間盤突出癥 60例患者為研究對象，設(shè)為實驗組。60 例健康成年人設(shè)為對照組。運用免疫透射比濁法測定實驗組術(shù)前、術(shù)后三天、術(shù)后一月和對照組血清 IgG、IgM 的含量。運用酶聯(lián)免疫吸附法測定實驗組術(shù)前、術(shù)后三天、術(shù)后一月和對照組血清 TNF-、IL-6、IL-10、IL-12 的含量。結(jié)果：與對照組比

2、較，實驗組術(shù)前血清 IL-6、IL-10、IL-12、TNF-、IgG、IgM 水平均升高（p<0.01）。與實驗組術(shù)前比較，實驗組術(shù)后 IL-12、TNF-、IgG、IgM 水平均降低（p<0.01）。與實驗組術(shù)前比較，實驗組術(shù)后血清 IL-6、IL-10 水平均升高（p<0.01）。與術(shù)后三天比較，實驗組術(shù)后一月 IL-12、TNF-、IgG、IgM 水平均降低（p<0.05）。與術(shù)后三天比較，實驗組術(shù)后一月 IL-10 水平升高（p<0.05）。與術(shù)后三天比較，實驗組術(shù)后一月 IL-6 水平變化不大（p0.05）。結(jié)論： 1.腰椎間盤突出癥患者機體存在自身免

3、疫狀態(tài)的異常改變，表現(xiàn)在細胞免疫和體液免疫兩個方面。2.醫(yī)用臭氧在腰椎間盤突出癥的介入治療中發(fā)揮了免疫抑制作用。3.抑制自身免疫反應(yīng)是醫(yī)用臭氧介入治療腰椎間盤突出癥重要機制之一。：腰椎間盤突出癥醫(yī)用臭氧自身免疫反應(yīng)IIAbstractObjective: 1. To observed the changes of serum IgG、IgM、TNF-、IL-6、IL-10 and IL-12 levels of patients with Lumbar disc herniation with medical ozone injection2. To evaluate the mechanis

4、m of the autoimmune response of patients with Lumbar disc herniation with medical ozoneTo investigate immune mechanism of patients with Lumbar disc herniation with medical ozoneMethod： Sixty patients with Lumbar disc herniation with medical ozone injectionfrom June 2006 to August 2008 were set as te

5、sting groupSixty Healthy adults were set as control groupAt the pretreatment、three days and one month after treatment，The serum IgG and IgM levels were detectd by immunoturbidimetry methodAt the pretreatment、three days and one month after treatment，The serum TNF-、IL-6、IL-10 and IL-12 levels were det

6、ectd by enzyme linked immunosorbent assayResult: The serum IL-6、IL-10、IL-12、TNF-、IgG、IgM levels in testing group before treatment were increased compared with the control group（p<0.01）；The serum IL-12、 TNF-、IgG、IgM levels in testing group were decreased compared with the testing group before trea

7、tment（p<0.01）；The serum IL-6、IL-10 levels in testing group were increased compared with the testing group before treatment（p<0.05）；The serum IL-12、TNF-、 IgG、IgM levels in testing group after one month were decreased compared with the testing group after three days（p<0.05）；The serum IL-10 le

8、vels in testing group after one monthwere increased compared with the testing group after three days（p<0.05）；The serum IL-6levels in testing group after one month were no significanttesting group after three days（p0.05）difference compared with the: 1.The autoimmune state of Lumbar disc herniation

9、 were abnormal 2.Treatment of Lumbar disc herniation with medical ozone injection can inhibitauto-immune status3. Suppression of the autoimmune response were one of the important mechanism of Lumbar disc herniation with medical ozone injectionKey words: Lumbar disc herniationMedical ozoneAutoimmune

10、responseIII引言腰椎間盤突出癥（Lumbar disc herniation，LDH）是因腰椎間盤退行性變或外傷導(dǎo)致環(huán)破裂，髓核突出刺激和(或)神經(jīng)根所表現(xiàn)的一種綜合癥，是引起腰腿之一1。痛最常見的腰椎間盤突出癥的治療方法多種多樣，20 世紀 90 年代起，國內(nèi)外運用醫(yī)用臭氧介入治療椎間盤突出癥并取得了滿意效果。國內(nèi)外研究2-6結(jié)果表明醫(yī)用臭氧治療腰椎間盤突出癥的機理主要有氧化作用、抗炎作用和鎮(zhèn)痛作用，目前認為其氧化作用是醫(yī)用臭氧介入治療椎間盤突出癥的主要機制。臭氧對椎間盤髓核的氧化作用主要特征是使髓核中蛋白多糖脫水，出現(xiàn)膠原細胞、變形甚至壞死等現(xiàn)象，并有可能使突出的椎間盤組織回縮。

11、突出的椎間盤髓核減小或回縮能減少對神經(jīng)根的，同時也能減少靜脈淤血。治療后最理想的不一7-9。情況是出現(xiàn)突出椎間盤組織縮小乃至回縮。但這種理想情況發(fā)生率各家我們在臨床發(fā)現(xiàn)大部分經(jīng)臭氧治療術(shù)后效果良好的患者，一復(fù)查 CT 卻未發(fā)現(xiàn)明顯突出椎間盤的回縮，一方面證明臭氧氧化髓核組織是一個緩慢的過程，另一方面證明解除神經(jīng)根機械并不是臭氧治療的全部作用機理。迄今，對醫(yī)用臭氧治療腰椎間盤突出癥的機理的氧化作用、抗炎作用和鎮(zhèn)痛作用研究較多，但對醫(yī)用臭氧介入治療腰椎間盤突出癥對其自身免疫作用影響的研究國內(nèi)外尚未見。研究表明10-15腰椎間盤突出癥患者存在自身免疫狀態(tài)的異常，腰椎間盤突出癥患者的血清、腦脊液和突出

12、髓核中，IgG 和 IgM 含量較正常人顯著升高。椎間盤突出髓核中，Th1 細胞因子優(yōu)勢應(yīng)答。椎間盤突清和髓核中 TNF-、IL-6、IL-10、IL-12等細胞因子含量較正常人升高、T 淋巴細胞亞群較正常人顯著降低。本課題通過觀察醫(yī)用臭氧介入治療腰椎間盤突出癥患者術(shù)前、術(shù)后三天、術(shù)后一月血清中 IgG、IgM、TNF-、IL-6、IL-10、IL-12 水平的變化，進一步研究腰椎間盤突出癥的自身免疫機制，探討醫(yī)用臭氧介入治療腰椎間盤突出癥可能的免疫作用機理。11. 材料與方法1.1 一般材料隨機選取自 2006.6-2008.8 符合納入標準 60 例患者，男 38 例，女 22 例27-6

13、8歲，平均42.5 歲，平均病程 2 年。36 例患者臨床表現(xiàn)為腰痛合并一側(cè)或雙側(cè)下肢放射性疼痛、麻木；24 例僅表現(xiàn)為下肢疼痛、麻木；其中單一節(jié)段（L4-L5 或 L5-S1）椎間盤突出癥患者 29 例，1 例患者 L4-5 椎間盤突出合并同平面椎管明顯狹窄；31 例患者 L4-L5 合并 L5-S1 突出；所有患者均經(jīng)過至少 8 周保守治療無效。經(jīng) CT 或 MRI掃描證實 60 例患者均有與臨床體征相符的腰椎間盤突出。對照組隨機選取同期在我院行體檢 60 例健康成年人，男 36 例，女 24 例； 醫(yī)用臭氧治療腰椎間盤突出癥的適應(yīng)癥： 1下腰痛和坐骨神經(jīng)痛，無嚴重神經(jīng)功能喪失。2保守治療

14、至少 8-12 周以上無效者。28-65 歲，平均41 歲。3CT 和 MRI 檢查顯示為椎間盤突出，與臨床性改變關(guān)系不大者。 4外科手術(shù)治療后出現(xiàn)腰椎間盤術(shù)后綜合癥者。醫(yī)用臭氧治療腰椎間盤突出癥的納入標準：癥狀一致，且臨床癥狀與腰椎退1臨床癥狀和體征、腰椎平片、CT 和 MRI 診斷符合臭氧注射治療適應(yīng)癥。2. 近期及手術(shù)前后均未使用過腎上腺皮質(zhì)類激素和免疫抑制劑類3. 患者知情同意參與，且收集了其完備的臨床指標。醫(yī)用臭氧治療腰椎間盤突出癥的排除標準：史。1合并自身免疫性疾病、血液淋巴系統(tǒng)疾病、的患者。、肝腎疾病及急慢性傳染病2. 患者合并甲亢、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥及蠶豆病、3. 妊

15、娠或哺乳期婦女。1.2 主要儀器和設(shè)備1.2.1 臭氧注射治療腰椎間盤突出癥所用儀器和設(shè)備傾向等。臭氧發(fā)生器(德國)；CT 掃描儀(SIMENS 公司)；小型 C 臂21G 針或機(東華電子)；穿刺針；瓶裝醫(yī)用純氧1.2.2 檢驗試劑和設(shè)備DLZ4-0.8 平衡微量離心機(北京醫(yī)療離心機廠)；2Olympus Au560 全自動生化分析儀()；酶聯(lián)免疫檢測儀（E2500 型，美國 Bio-Rad） 免疫球蛋白免疫透射比濁法檢測試劑盒(邁克號：Q/20186004-X EL07-2003。附：試劑盒成份公司提供)。生產(chǎn)標準檢測試劑 IgG、IgM免疫球蛋白校準血清TNF- 試劑盒(羊抗人 IgG

16、、IgM 血清消脂劑定值見晶美公司) :批號:FRK0013IL-12 試劑盒(Bender Medsystems 公司) : IL-6 試劑盒(Bender Medsystems 公司) : IL-10 試劑盒(Bender Medsystems 公司) :1.3 治療方法1.3.1 手術(shù)方法批號:BMS640批號:BNS740批號:BGM540患者取俯臥位，下腹墊軟枕。通常取脊柱中線旁開 8-10cm 處為穿刺點,常規(guī)鋪單，鋪洞巾。2%利多卡因局麻。用 21G 多側(cè)孔注射針行側(cè)后方入路穿刺。術(shù)中 32 例用 C 型臂明確進針點，按針尖與皮膚呈 45°進針，三角區(qū)順利進到 L4/5

17、，L5/S1 椎間隙。圖 1 . 1安全三角區(qū)3圖 1 . 2穿刺前C 型 X 光機圖 1 . 3術(shù)中穿刺圖 1 . 4 C 型臂下穿刺，穿刺針位于中后 1 / 3 間隙14 例用 CT 定點定向，在 CT 引導(dǎo)下穿刺進針，針尖位于椎間隙中后 1/3 區(qū)域。圖 1 . 5 術(shù)前在CT 上定點圖 1 . 6CT掃描位于椎體中后 1 / 34圖 1 . 7 注入臭氧圖 1 . 8 拔針,CT 顯示氣體分布將臭氧發(fā)生器與醫(yī)用純氧氧氣瓶連接，設(shè)定輸出混合氣體臭氧濃度為 60ug/ml， 向病變椎間盤注射濃度為 60ug/ml 的臭氧氣體 20ml，退針至椎間孔附近時，再向椎旁組織注射濃度為 40ug/

18、ml 的臭氧 10-15ml。拔針，術(shù)畢。1.3.2 血漿球蛋白IgG、IgM 的收集和測定于術(shù)前、術(shù)后三天空腹靜脈采血樣 3ml 置于 EDTA1000prm，收集上清液封閉于 Ep 管內(nèi)-80冰箱保存待檢。，在 15 分鐘內(nèi)離心，IgG、IgM 的測定用免疫透射比濁法：運用免疫透射比濁法檢測人血清中免疫球蛋白 IgG、IgM 的含量，人血清中免疫球蛋白 IgG、IgM 與其相應(yīng)抗體在溶液中相遇， 形成抗原-抗體復(fù)合物，形成一定濁度，該濁度高低在一定量抗體存在時與抗原的含量成正比，在一定波長下，通過與同樣處理的校準液對照，定量檢測出樣品中免疫球蛋白 IgG、IgM 的含量。測定步驟（1）操作

19、：將校準血清用生理鹽水作 2.5 倍、5 倍、10 倍稀釋成三個不同濃度， 按下表操作：注：Ci ： i校準管從 1 到 3，表示稀釋成 2 . 5 倍、5 倍、10 倍三個不同濃度，U：樣品管 B：空白管C：混勻，37孵育 10 分鐘，340nm 波長，以空白管調(diào)零，測定各管吸光度。5（ul）IgGIgMUCiBUCiB10 倍預(yù)稀釋樣品3-10-校準血清-3-10-生理鹽水-3-10試劑 R300300300300300300（2）計算：使用多點半對數(shù)校準模式，由儀器自動生成校準曲線后根據(jù)吸光度樣品中免疫球蛋白含量。1.3.3 TNF-、IL-6、IL-10、IL-12 收集和測定于術(shù)前、

20、術(shù)后三天、術(shù)后一月空腹靜脈采血樣 3ml 置于 EDTA，在 15分鐘內(nèi)離心，1000prm，收集上清液封閉于 Ep 管內(nèi)-80冰箱保存待檢。按酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)操作方法檢測血清中 TNF-、I L-6、IL-10、IL-12 的含量。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) IL-6 操作步驟： 檢測前準備：1提前 20 分鐘從 4冰箱中取出試劑盒。2濃縮洗滌液蒸水稀釋（1：20）3標準品分別稀釋為以下濃度：4000、2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0pg/ml。4生物抗體工作液：以生物抗體稀釋液稀釋濃縮生物抗體（1：100）,臨用前 15 分鐘配好。5酶結(jié)合

21、工作液：以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮酶結(jié)合物（1：100）,臨用前 15 分鐘配好。操作步驟：1從平衡至室溫的密封袋中取出所需板條。2除空白，分別將標本或不同濃度標準品（100ul/入相應(yīng)；用封板紙封住反應(yīng)孔，37孵育 90 分鐘。 3洗板 4 次,手工洗板,甩盡孔內(nèi)液體。每吸水紙上拍干，洗 5 次。洗滌液 300ul，靜置 30s 后甩盡液體。4除空白,加入 IL-6 生物60 分鐘。5洗板 4 次?？贵w工作液（一抗）（100ul/孔）封板，37孵育6除空白,加入酶結(jié)合物工作液（100ul/孔），封板，37孵育 30 分鐘。7. 洗板 4 次。8. 加顯色劑（100ul/孔）,避光 37孵育 4

22、5 分鐘。9發(fā)現(xiàn)部分變藍后,加入終止液（100ul/孔），溶液顏色變黃。10. 立即混勻后在酶標儀上測 OD 值（5 分鐘內(nèi)），酶標儀主波長 450nm，輔助波長 630nm。11. 手工繪制標準曲線，標準品濃度為橫坐標，OD 值作為縱坐標，以平滑線連接各標準品坐標點、依此曲線查出樣本 OD 值所對應(yīng)的 IL-6 的濃度。612IL-10、IL-12、TNF- 的檢測除步驟 4 所加入的一抗為 IL-10、IL-12、TNF- 生物抗體工作液，余步驟與 IL-6 的檢測步驟相同。1.4 統(tǒng)計學方法用 SPSS10.0 統(tǒng)計軟件進行分析處理。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)加減標準差(x±s)表示，治療

23、前后比較采用 t 檢驗；p<0.05 統(tǒng)計有顯著性差異。2.結(jié)果2. 1 兩組治療前后血清Th2 型細胞因子 IL-10、IL-6 比較與對照組比較，實驗組治療前血清 IL-10、IL-6 水平均升高（p<0.01）；與實驗組治療前比較，實驗組治療后血清 IL-10、 IL-6 水平升高（p<0.01）；與實驗組治療后三天比較，實驗組治療后一月血清 IL-10 水平升高（p<0.05）；血清 IL-6 水平無顯著性差異（p0.05）。圖 2.1 兩組治療前后血清 IL-10 比較（x±s）IL-10：B1 與 A 比較，t=6.032，p<0.01；B2

24、 與 B1 組間比較，t=3.765，p<0.05； B3 與 B1 組間比較，t=4.983，p<0.01；B3 與 B2 組間比較，t=2.983，p<0.05IL-6：B1 與 A 比較，t=4.586，p<0.01；B2 與 B1 組間比較，t=3.198，p<0.01；B3 與 B1 組間比較，t=3.265，p<0.01；B3 與 B2 組間比較，t=0. 863，p0.05；7白細胞介素含量( pg /mL )20151050AIL-10圖 2.1 兩組治療前后血清 IL-10 比較（x±s）A B1 B2 B3組別IL-10(pg/

25、ml)IL-6 (ng/ml)對照組（A）10.26±1.52106.34±26.28實驗組治療前(B1)11.83±1.36128.76±22.06實驗組治療后三天(B2)14.66±1.27130.65±23.37實驗組治療后一月(B3)17.28±1.38131.36±21.1312IL-10、IL-12、TNF- 的檢測除步驟 4 所加入的一抗為 IL-10、IL-12、TNF- 生物抗體工作液，余步驟與 IL-6 的檢測步驟相同。1.4 統(tǒng)計學方法用 SPSS10.0 統(tǒng)計軟件進行分析處理。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)

26、加減標準差(x±s)表示，治療前后比較采用 t 檢驗；p<0.05 統(tǒng)計有顯著性差異。2.結(jié)果2. 1 兩組治療前后血清Th2 型細胞因子 IL-10、IL-6 比較與對照組比較，實驗組治療前血清 IL-10、IL-6 水平均升高（p<0.01）；與實驗組治療前比較，實驗組治療后血清 IL-10、 IL-6 水平升高（p<0.01）；與實驗組治療后三天比較，實驗組治療后一月血清 IL-10 水平升高（p<0.05）；血清 IL-6 水平無顯著性差異（p0.05）。圖 2.1 兩組治療前后血清 IL-10 比較（x±s）IL-10：B1 與 A 比較，

27、t=6.032，p<0.01；B2 與 B1 組間比較，t=3.765，p<0.05； B3 與 B1 組間比較，t=4.983，p<0.01；B3 與 B2 組間比較，t=2.983，p<0.05IL-6：B1 與 A 比較，t=4.586，p<0.01；B2 與 B1 組間比較，t=3.198，p<0.01；B3 與 B1 組間比較，t=3.265，p<0.01；B3 與 B2 組間比較，t=0. 863，p0.05；7白細胞介素含量( pg /mL )20151050AIL-10圖 2.1 兩組治療前后血清 IL-10 比較（x±s）A

28、 B1 B2 B3組別IL-10(pg/ml)IL-6 (ng/ml)對照組（A）10.26±1.52106.34±26.28實驗組治療前(B1)11.83±1.36128.76±22.06實驗組治療后三天(B2)14.66±1.27130.65±23.37實驗組治療后一月(B3)17.28±1.38131.36±21.132. 2 兩組治療前后血清Th1 型細胞因子 TNF-、IL-12 比較與對照組比較，實驗組治療前血清 TNF-、IL-12 水平均升高（p<0.01）；與實驗組治療前比較，實驗組治療后血

29、清 TNF-、IL-12 水平降低（p<0.01）；與實驗組治療后三天比較，實驗組治療后一月血清 TNF-、IL-12 水平降低（p<0.05）。表 2.3 對照組、實驗組治療前后血清 TNF-、IL-12 比較（x±s）TNF-：B1 與 A 比較，t=9.565，p<0.01；B2 與 B1 組間比較，t=3.854，p<0.01；B3 與 B1 組間比較，t=4.942，p<0.01；B3 與 B2 組間比較，t=3.635，p<0.05IL-12：B1 與 A 比較，t=7.365，p<0.01；B2 與 B1 組間比較，t=6.84

30、6，p<0.01；B3 與 B1 組間比較，t=7.895，p<0.01；B3 與 B2 組間比較，t=3.630，p<0.058腫瘤壞死因子含量(ng /mL )白細胞介素含量( ng / mL )2 . 521 . 510 . 50ATNF- 圖 2.3 對照組、實驗組治療前后血清 TNF-（x±s）A B1 B2B3組別TNF-(ng/ml)IL-12(pg/ml)對照組（A）1.12±0.3810.54±0. 82實驗組治療前(B1)1.86±0.5014.76±0. 63實驗組治療后三天(B2)1.20±0

31、.4212.24±0. 73實驗組治療后一月(B3)1.08±0.3610.38±0.76200150100500AIL-6圖 2.2 兩組治療前后血清 IL-6 比較（x±s）A B1 B2B32.3 兩組治療前后血清 IgG、IgM 比較與對照組比較，實驗組治療前血清 IgG、IgM 水平升高（p<0.01）；與實驗組治療前比較，實驗組治療后血清 IgG、IgM 水平均降低（p<0.01）；與實驗組治療后三天比較，實驗組治療后一月血清 IgG、IgM 水平降低（p<0.05）。表 2.5 對照組、實驗組治療前后血清 IgG、IgM

32、比較（x±s）IgG：B1 與A 比較，t=2.463，p<0.01；B2 與 B1 組間比較，t=6.357，p<0.01；B3 與 B2 組間比較，t=2.386，p<0.05IgM：B1 與 A 比較，t=3.480，p<0.01；B2 與 B1 組間比較，t=11.478，p<0.01；B3 與 B2 組間比較，t=2.587，p<0.059免疫球蛋白含量( ng / mL )白細胞介素含量( pg /mL )20151050AIgGIgM表 2.5 對照組、實驗組治療前后血清 IgG、IgM 比較（x±s）A B1 B2 B3組

33、別IgG (g/L)IgM(g/L)對照組（A）13.50±2.800.95±0.33實驗組治療前(B1)15.92±2.361.68±0.50實驗組治療后三天(B2)11.29±2.471.56±0.36實驗組治療后一月(B3)10.06±2.381.34±0.3020151050AIL-12表 2.4 對照組、實驗組治療前后血清 IL-12 比較（x±s）A B1 B2 B33. 討論3.1 腰椎間盤突出癥患者機體自身免疫反應(yīng)正常椎間盤位于由上下軟骨終板和環(huán)包圍而成的一個相對密閉系統(tǒng)內(nèi)，三者共同椎間盤

34、彈性緩。椎間盤髓核是體內(nèi)最大的、無的封閉結(jié)構(gòu)組織，其營養(yǎng)主要來自軟骨終板的彌散作用，被排除在機體免疫機制之外。當椎間盤受到損傷后，髓核即環(huán)或后縱韌帶的包圍，在修復(fù)過程中新生長入髓核組織，髓核與機體免疫機制發(fā)生密切接觸，髓核基質(zhì)里的糖蛋白和蛋白便成為抗原，持續(xù)的刺激機體的免疫系統(tǒng)，誘發(fā)自身免疫反應(yīng)16。自身免疫的病程損傷包括自身抗體和(或)自身致敏淋巴細胞所引起的病理過程，不僅有抗體（IgG 和/或 IgM）介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)參與，也有 T 細胞介導(dǎo)的細胞免疫反應(yīng)參與?？乖贵w形成免疫復(fù)合物可以吸引中性粒細胞等細胞并產(chǎn)生炎性介質(zhì)，造成自身免疫反應(yīng)性炎癥。介質(zhì)可增加通透性，促進巨噬細胞吞噬抗原抗體

35、復(fù)合物，在吞噬過程中溶酶體性蛋白酶，其分解蛋白聚糖，降解膠原分子，造成組織損傷，從而引起腰腿痛17。Geha 等18研究認為當退變或外傷導(dǎo)致椎間盤抗原成分進入血循環(huán)后，即可通過抗原、T 淋巴細胞、B 淋巴細胞間相互作用，產(chǎn)生自身免疫應(yīng)答反應(yīng)，表現(xiàn)在細胞免疫和體液免疫反應(yīng)的異常。3.1.1 腰椎間盤突出癥患者機體細胞免疫反應(yīng)Th1 和 Th2 細胞是 Th 細胞(CD4+細胞)中兩個主要的效應(yīng)細胞亞群，分別介導(dǎo)機體的細胞免疫和體液免疫應(yīng)答。根據(jù)細胞因子 模式，CD4+細胞可分為 Th1 和 Th2亞群，Th1 主要IL-2、IL-12、IFN-、TNF- 和 TNF- 稱為 Th1 型細胞因子，

36、介導(dǎo)細胞免疫、細胞毒性 T 細胞(CTL)和巨噬細胞活化以及誘導(dǎo)過度自身免疫反應(yīng)，促進自身免疫病的發(fā)生。Th2 主要超敏反應(yīng)；其作用是IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 和 IL-13，稱為 Th2 型細胞因子，介導(dǎo)體液免疫、B 細胞和嗜酸性粒細胞活化以及 IgE 的生成；其作用是誘導(dǎo)免疫耐受，自身免疫疾病的發(fā)生。由 Th1/Th2 亞群及其相互之間的平衡在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用19。在疾病的狀態(tài)下，Th 細胞受特異性抗原的刺激時，在不同因素的作用下，Th 選擇性向 Thl 或 Th2 細胞分化，這些因素包括在抗原呈遞水平的細胞因子微環(huán)境、細胞膜表面、抗原的種類和劑量、抗原呈遞細

37、胞及其它一些水平的調(diào)控。其中IL-12、IL-4 對 Th1/Th2 細胞分化起關(guān)鍵性作用20。IL-12 是 Thl 分化的必需因子；IL-4 是 Th2 分化的必需因子。IL-12 主要由活化的單核吞噬細胞受抗原刺激時產(chǎn)生有很強的促進 Thl 細胞分化作用，并抑制 IL-4 表達。細胞因子參與自身免疫過程的機制，尤其是在 T 細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病中起10重要的作用。研究表明21-24IL-12 是一種誘導(dǎo) Th1 型免疫反應(yīng)的細胞因子，在 T 細胞介導(dǎo)的自身免疫病中起重要作用。IL-12 與自身免疫病的遺傳易感性有關(guān)。一是因為自身反應(yīng)性 T 細胞本身可誘導(dǎo)抗原遞呈細胞產(chǎn)生 IL-12；

38、二是在有發(fā)生自身免疫病傾向的小鼠中，IL-12 受體的亞在自身抗原誘導(dǎo)表達到一定水，可促使自身反應(yīng)性 T 細胞向 Th1 分化，從而產(chǎn)生破壞性的炎癥反應(yīng)。在自身免疫性中，如發(fā)生時，抗原遞呈細胞迅速產(chǎn)生 IL-12，傳遞產(chǎn)生炎癥免疫反應(yīng)的信號，從而進一步誘發(fā)自身反應(yīng)性 T 細胞的激活和 Th1 型分化，加重自身免疫性的病情。研究表明 IL-6 能促進 B 細胞、細胞毒性 T 淋巴細胞的分化和免疫球蛋白的。研究表明 IL-10 一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，有強大的抑制巨噬細胞活性的作用，對 IL-6、TNF- 等促炎因子有抑制作用；TNF- 主要由活化的單核/巨噬細胞和體液免疫反應(yīng)。，促進細胞多項研究

39、21-24證實正常椎間盤中不含或有含量很低的細胞因子，而在椎間盤退變，尤其髓核脫出時，椎間盤內(nèi) IL-12、IL-6、TNF- 等細胞因子含量明顯增高，并引起腦脊液、外周血內(nèi) IL-l2、IL-6、TNF- 等細胞因子含量增高，刺激神經(jīng)根和脊神經(jīng)，導(dǎo)致下腰痛和神經(jīng)根性放射痛。本實驗研究結(jié)果顯示腰椎間盤突出癥患者術(shù)前血清 IL-6、IL-10、IL-12、TNF- 平較正常人均升高，與上述研究結(jié)果相一致。Gertzbein 等25-27通過大量動物實驗和臨床研究，提出椎間盤是一種自身免疫病。近年研究發(fā)現(xiàn)輔助性T(Th)細胞及其細胞因子在自身免疫性疾病的發(fā)病及治療過程中有非常重要的作用28，尤其是

40、在一些自身抗原尚不清楚的自身免疫疾病采用繞過抗原監(jiān)測調(diào)節(jié)細胞因子的平衡是觀察疾病發(fā)展和自免疾病的有效。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在很多自身免疫疾病中存在 Th1/Th2 型細胞因子表達不平衡的情況，如類風濕性關(guān)節(jié)炎、萊姆病、多發(fā)性硬化癥、胰島素依賴型、和慢性甲狀腺炎中 Thl 及其細胞因子占優(yōu)勢這些疾病可歸為 Thl 狀態(tài)；而在過敏性疾病、哮喘、硬皮病、系統(tǒng)性紅斑中 Th2 及其細胞因子占優(yōu)勢，處于 Th2 狀態(tài)29。狼瘡以及 HIV根據(jù) Naylor 提出的自身免疫說學理論，在突出的椎間盤組織中以 Th1 優(yōu)勢狀態(tài)為主。Park 等30人對 40 例腰突癥患者進行研究，采用 ELISA 法檢測突出椎間盤組

41、織中 Th1 型細胞因子 INF-、IL-12 和 Th2 型細胞因子 IL-4 的表達，發(fā)現(xiàn)在破裂組中INF-、IL-12 的表達明顯高于未破裂組；而后者突出椎間盤組織中 IL-4 的含量高于破裂組患者。作者認為正是由于 Th2 型細胞因子 IL-4 的表達使得未破裂組椎間盤組織處于免疫豁免狀態(tài)，而環(huán)破裂后，髓核給硬膜外腔的免疫系統(tǒng)，INF-、IL-12 高度表達，Th1/Th2 產(chǎn)生漂移，處于 Th1 優(yōu)勢應(yīng)答狀態(tài)，引起過度自身免疫性炎癥的發(fā)生，對神經(jīng)根造成病理損害。等 11對腰突癥患者自身免疫狀態(tài)進行了系統(tǒng)研究認為髓核國內(nèi)、11突出后可導(dǎo)致 T 淋巴細胞亞群的變化，主要表現(xiàn)為細胞毒作用和

42、明腰突癥患者處于 Th1 細胞因子優(yōu)勢應(yīng)答。超敏反應(yīng)，表15在 IL-12、Th1 和 Th2 型細胞因子在椎間盤突出組織中的表達、及意義中指出破裂型腰椎間盤突出是在退變的基礎(chǔ)上伴有損傷，機體修復(fù)反應(yīng)使得隱蔽抗原于循環(huán)系統(tǒng)，巨噬細胞浸潤促進了 IL-12，改變了 Th1/Th2 型細胞因子表達方式，為 Th1 細胞因子優(yōu)勢應(yīng)答，產(chǎn)生大量促炎因子，引起神經(jīng)根炎癥和水腫， 導(dǎo)致腰腿痛和坐骨神經(jīng)痛。本實驗研究結(jié)果顯示腰椎間盤突出癥患者術(shù)前 Th1 型細胞因子 TNF- 較對照組明顯升高，腰椎間盤突出癥患者術(shù)前 IL-12 較對照組明顯升高，促進 Thl 細胞分化， 驗證了腰突癥患者處于 Th1 細胞

43、因子優(yōu)勢應(yīng)答。3.1.2 腰椎間盤突出癥患者機體體液免疫反應(yīng)目前，研究多證實 LDH 患者或動物模型的髓核/血清中有 IgG、IgM 存在。pennington 等31首次發(fā)現(xiàn)狗正常髓核組織中存在完整的免疫球蛋白 IgG，一旦髓核突出或漏逸出環(huán)可能激活補體級聯(lián)反應(yīng)引起炎癥反應(yīng)。spliopoulou 等12研究發(fā)現(xiàn) LDH 患者血清和腦脊液 IgG 和 IgM 均較正常人增高。國內(nèi)13用比濁法對腰椎間盤突出患者的血清和腦脊液進行了免疫球蛋白定量分析，發(fā)現(xiàn)患者的血清和腦脊液11發(fā)現(xiàn) LDH 患者血清中免疫球蛋白的升高，中 IgG 和 IgM 明顯升高椎間盤組織的自身抗體主要是 IgG 和 IgM

44、。本研究結(jié)果顯示腰椎間盤突出癥患者血漿球蛋白 IgG、IgM 較正常人明顯升高，與上述文獻一致，印證腰椎間盤患者存在自身體液免疫狀態(tài)的異常。血清中免疫球蛋白的升高可能機理國內(nèi)學者32認為，椎間盤組織中的、型膠原，糖蛋白和軟骨終板基質(zhì)是潛在的自身抗原，它可激發(fā)機體由超敏反應(yīng)性 T 淋巴細胞和細胞毒性 T 淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫反應(yīng)，導(dǎo)致椎間盤的早期退變，在 T、B 淋巴細胞和椎間盤抗原的不斷作用下，進而產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，表現(xiàn)為血清中免疫球蛋白的升高。3.2 醫(yī)用臭氧介入治療對腰椎間盤患者機體自身免疫反應(yīng)影響3.2.1 臭氧對機體免疫系統(tǒng)的影響實驗表明臭氧對機體免疫系統(tǒng)中 T 淋巴細胞和 B 淋巴

45、細胞及抗體均有不同程度的影響。(1)臭氧對 T 淋巴細胞的影響： Peterson 等33研究表明，于 0.4ppm臭氧 4 個小時，外周血 T 淋巴細胞對植物血凝素（PHA）的反應(yīng)即受到抑制。Mirdza的實驗也報告了同樣的研究結(jié)果。他們認為臭氧及其中間產(chǎn)物很可能是通過氧化淋巴細胞表面的影響淋巴細胞的代謝過程。推測于臭氧下可以引起機體 T 淋巴細胞免疫功能受損，由此可能造成機體處于免疫抑制狀態(tài)，從而一些和機會染的發(fā)生。(2)臭氧對 B 淋巴細胞的影響：小鼠于 0.8ppm 臭氧兩周，即12可抑制其對綿羊紅細胞的性抗體反應(yīng)，若連續(xù)于 0.59ppm 臭氧，發(fā)現(xiàn)小鼠有較高的破傷風與率，說明臭氧降

46、低了機體對破傷風毒素的體液免疫功能34-35。研究結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，臭氧對機體的影響主要表現(xiàn)在對免疫系統(tǒng)功能的抑制作用上，這種作用主要是通過對細胞免疫(T 淋巴細胞)和體液免疫(B 淋巴細胞)的抑制效應(yīng)而體現(xiàn)的。3.2.2 臭氧對淋巴細胞的影響B(tài)occi 等36研究認為，臭氧在一定濃度下具有免疫激活和調(diào)節(jié)的作用。臭氧作用全血，可誘導(dǎo)產(chǎn)生眾多細胞因子，包括干擾素（IFN-、）、白細胞介素（IL-l、2、 4、6、8、10）、腫瘤壞死因子（TNF-）、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）和生長因子（TGF-l）?，F(xiàn)已知 IL-2 和 TNF- 具有調(diào)節(jié)免疫作用，激活細胞毒性 T細胞（CTL）、N

47、K 細胞及抗體依賴性細胞毒作用（ADCC）；IL-10 和 TGF-1 具有超強免疫抑制作用，能抑制巨噬細胞的活化，抗原提呈細胞功能。臭氧對免疫細胞作用機理還未明確。可能是作用細胞膜上不飽和脂肪酸反應(yīng)生成脂質(zhì)過氧化氫鏈，脂質(zhì)過氧化氫鏈進人細胞漿，可激活核因子 NFkB，激活細胞轉(zhuǎn)錄和翻譯，促進蛋白質(zhì)，細胞因子。3.2.3 醫(yī)用臭氧治療對腰椎間盤突出癥患者機體自身免疫反應(yīng)的影響3.2.3.1 醫(yī)用臭氧介入治療對腰椎間盤突出癥患者體液免疫的影響本研究結(jié)果顯示腰椎間盤突出癥患者術(shù)后三天、一月血清免疫球蛋白 IgG、IgM 水平較術(shù)前明顯降低（p<0.01），提示醫(yī)用臭氧可能對腰椎間盤突出所引起

48、的自身免疫反應(yīng)有一定的抑制作用。本研究結(jié)果顯示實驗組術(shù)后三天、一月血清 Th2 型細胞因子 IL-10 水平較術(shù)前升高。早期推測可能是與臭氧對淋巴細胞作用有關(guān)，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫抑制性細胞因子 IL-10 和 TGF-，自身免疫疾病的發(fā)展和誘導(dǎo)免疫耐受，間接抑制自身免疫反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展，達到抑制機體的自身免疫反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示腰椎間盤突出癥患者術(shù)后一月血清免疫球蛋白 IgG、IgM 水平較術(shù)后三低（p<0.05）。晚期推測可能與醫(yī)用臭氧強的氧化作用有關(guān)，能氧化髓核組織中的蛋白多糖，并能破環(huán)髓核細胞，從定程度上抑制了自身免疫的發(fā)生。上切斷了自身抗原的表達，從而在一3.2.3.2 醫(yī)用臭氧介

49、入治療對腰椎間盤突出癥患者細胞免疫的影響本研究結(jié)果顯示實驗組術(shù)后三天、一月血清 Th2 型細胞因子 IL-6、IL-10 水平較術(shù)前均升高（p<0.05）。促 Th1 分化因子 IL-12 術(shù)后三天、一月血清水平較術(shù)前降低（p<0.05）。說明醫(yī)用臭氧能增加 Th2 型細胞因子的，糾正 Th1/Th2 失衡，提示醫(yī)用臭氧可能對腰椎間盤突出所引起的細胞免疫反應(yīng)有一定的抑制作用，推測可能與臭氧對淋巴細胞作用有關(guān)，刺激機體產(chǎn)生 IL-4，減少 IL-12 的表達，增加 Th2 型細胞13因子的，表現(xiàn)為 IL-6、IL-10 含量的升高。但醫(yī)用臭氧引起細胞因子 IL-6、IL-10、IL-

50、12 變化的具體機制以及醫(yī)用臭氧引起 IL-4 等其它細胞因子的變化有待進一步研究。144. 結(jié)論1. 腰椎間盤突出癥患者存在自身免疫狀態(tài)的異常改變，表現(xiàn)在細胞免疫和體液免疫兩個方面。2.醫(yī)用臭氧在腰椎間盤突出癥的介入治療中發(fā)揮了免疫抑制作用。3.抑制自身免疫反應(yīng)是醫(yī)用臭氧介入治療腰椎間盤突出癥重要機制之一。4.免疫療法有望成為今后腰椎間盤突出癥治療方法之一。15參 考 文 獻1譚冠先疼痛診療學M第 1 版北京：衛(wèi)生，2000，1082. Bocci VBiological and clinical effects of ozoneHas ozone therapy afuture in me

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