Flt3基因突變與急性髓系白血病發(fā)生和預(yù)后的關(guān)系

1、Flt3基因突變與急性髓系白血病發(fā)生和預(yù)后的關(guān)系【關(guān)鍵詞】Flt3基因；基因突變；急性髓系白血病Fms樣酪氨酸激酶3(Fms-liketyrosinekinase3,Flt3)是m型受體型酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase,RTK遂族成員之一，在正常造血及免疫系統(tǒng)發(fā)育中起著重要作用。Flt3基因突變與急性髓系白血病(acutemyelogenousleukemia,AML羽發(fā)生、預(yù)后密切相關(guān)。以Flt3作為靶分子已成為AML治療的一種新策略。1 Flt3基因結(jié)構(gòu)與功能1.1 結(jié)構(gòu)人類Flt3基因又稱作胎兒肝臟激酶-2(Fetalliverkinase-2,FLK-2)1和

2、人類干細(xì)胞激酶-1(humanstemcellkinase-1,STK1)2,位于染色體13q12,全長約100kb,含有24個(gè)外顯子，編碼993個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。Flt3蛋白有分子量為143KD的糖基化高甘露醇形和分子量為158KD的復(fù)合糖形兩種形式，前者存在于胞內(nèi)，經(jīng)過糖基化過程后形成后者，并定位于膜上。后者是Flt3在細(xì)胞表面的主要存在形式。Flt3與其它m型RTK如kit、fms、PDGF受體有相似的結(jié)構(gòu)，包含由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3部分組成。胞外區(qū)是胞外配體結(jié)合區(qū)，由5個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域組成；跨膜區(qū)有不連續(xù)的激酶作用的位點(diǎn)；胞內(nèi)區(qū)為酪氨酸激酶催化區(qū)，由1個(gè)胞內(nèi)近膜結(jié)構(gòu)域(juxt

3、amembranedomain,JM)、2個(gè)被插入結(jié)構(gòu)域分開的激酶結(jié)構(gòu)域(tyrosinekinasedomain,TKD那1個(gè)C末端結(jié)構(gòu)域構(gòu)成3。近年來的研究表明JM結(jié)構(gòu)域?qū)S持激酶催化中心空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起主要作用，對(duì)激酶活性有負(fù)調(diào)控作用4。圖1Flt3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑1.2 功能Flt3在胸腺、肝、脾、淋巴結(jié)、胎盤、大、小腦、生殖腺等多種組織中表達(dá)。在正常人骨髓中Flt3的表達(dá)僅限于CD34+干/祖細(xì)胞，在紅細(xì)胞系及成熟T、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞中無表達(dá)5。Flt3配體為FL(Flt3ligand)。無FL存在時(shí)，近膜結(jié)構(gòu)域?qū)lt3二聚體形成和活化起著抑制作用。當(dāng)FL與Flt3受體結(jié)合，后者發(fā)

4、生二聚體化，激酶結(jié)構(gòu)域的活化環(huán)(activationloop,A-loop)構(gòu)象發(fā)生改變，酪氨酸殘基自身磷酸化。激活的Flt3通過SHCWGRB2吉合而激活RAS從而進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)因子如RAFMAPK/ERK(酶。這些下游效應(yīng)因子激活核因子CREBELKSTATs使造血干細(xì)胞發(fā)生增殖和活化。止匕外，激活的Flt3也可以激活PI3K(phosphatidylinositol3-kinase)和RAS途徑，導(dǎo)致增殖加快，細(xì)胞凋亡抑制6,見圖1。這兩種信號(hào)途徑通過RAS的聯(lián)系提示了Flt3與白血病發(fā)生有關(guān)。2 Flt3基因突變Flt3基因突變是造成Flt3基因異?；罨闹饕?。其突變形式主要

5、表現(xiàn)為兩種：近膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(internaltandemduplications,ITDs)突變和TKD/和JM的點(diǎn)突變(pointmutation,PMs)。兩種突變均可造成Flt3酪氨酸激酶的結(jié)構(gòu)性活化，見圖2。圖2Flt3基因突變常見類型Flt3/ITDs是Flt3基因AML中最常見的突變類型，常出現(xiàn)在外顯子11,也可累及內(nèi)含子11和外顯子127。也有報(bào)道Flt3/ITD位于外顯子14和15,而非外顯子11和12810。Flt3/ITDs的插入長度具有多態(tài)性，其長度在3400bp之間不等，但串聯(lián)復(fù)制的堿基數(shù)多是3的倍數(shù)，極少產(chǎn)生框移突變，因而不影響開放閱讀框架（openreadi

6、ngframe,ORF»勺正常翻譯過程11,12。Flt3/ITDs使得Flt3基因持續(xù)活化的原因可能的是：（1）Flt3/ITDs造成了近膜結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)改變，從而破壞了近膜結(jié)構(gòu)域的自我抑制功能13。Flt3/ITD突變可以使細(xì)胞外的C末端的構(gòu)象發(fā)生變化，有利于Flt3二聚體的形成，導(dǎo)致配體非依賴性磷酸化。Flt3因磷酸化而酪氨酶激酶活性增強(qiáng)，導(dǎo)致酪氨酸殘基自發(fā)激活發(fā)生磷酸化作用，激活下游信號(hào)通路，如RAS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和轉(zhuǎn)錄激活因子5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)細(xì)胞增殖并與AMU勺進(jìn)展存在密切相關(guān)14,見圖3。第3期王杰.Flt3基因突變與急性髓系白血病發(fā)生和預(yù)后的關(guān)系一圖3Flt3基因突變信

7、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)示意圖在一些無Flt3/ITDs的AML患者中也存在配體非依賴性的Flt3基因組成性激活，說明除Flt3/ITDs之外，可能還存在有其他類型突變導(dǎo)致Flt3基因激活。近年來國內(nèi)外的研究表明約6.4%7.7%的患者出現(xiàn)TKD或/和JM結(jié)構(gòu)域的點(diǎn)突變，同樣可以導(dǎo)致Flt3基因配體非依賴性激活15,16。TKD點(diǎn)突變，常發(fā)生于激酶結(jié)構(gòu)域H活化環(huán)內(nèi)，通常為氨基酸殘基的突變，插入和缺失，最常見的是D835是第一個(gè)核甘酸G被T替代，即D835Y17。此外還有D835V18、D835H19、D835E20、D835N21等。最近，在AML中又發(fā)現(xiàn)了兩種新的活化環(huán)點(diǎn)突變，一種是第836位I的缺失，另一種

8、是第836位I被M替換同時(shí)被R插入22。這兩種新的點(diǎn)突變與D835一樣，突變也位于第2個(gè)酪氨酸激酶的活化環(huán)內(nèi)，都能導(dǎo)致無配體情況下受體自身磷酸化，通過激活STAT5言號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而抑制白血病細(xì)胞的凋亡23。JM點(diǎn)突變發(fā)生頻率不高，目前尚無大量的臨床研究統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)。已見報(bào)道的突變類型有V579AV592AF594L和F590GY591D等24,25。研究表明JM點(diǎn)突變可以降低JM區(qū)對(duì)激酶活性負(fù)調(diào)節(jié)作用，從而使Flt3持續(xù)活化并激活下游信號(hào)途徑，如STAT526。研究也發(fā)現(xiàn)JM點(diǎn)突變與Flt3/ITDs相比，對(duì)細(xì)胞的增殖作用較小，且受體自身的活化程度也較弱，推測(cè)可能是JM點(diǎn)突變對(duì)近膜結(jié)構(gòu)域的破壞較小

9、，未造成自我抑制功能的完全喪失27,28。3 Flt3基因突變與AML急性白血病是兒童最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率為3/10萬，其中AM占20%-30%近幾年來，隨著環(huán)境致癌因素的增加，AML的發(fā)病率及死亡率均呈上升趨勢(shì)。目前AML勺發(fā)生機(jī)制仍未完全闡明，但隨著研究的不斷深入，F(xiàn)lt3基因突變?cè)贏M諼生、預(yù)后中的作用日益受到重視。3.1 Flt3基因突變與AM3：生Flt3與其配體FL結(jié)合后能通過信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)造血發(fā)育起重要的調(diào)控作用，能調(diào)節(jié)多能造血干細(xì)胞、早期前體細(xì)胞及不成熟淋巴細(xì)胞的生長。1996年，Nakao等首先報(bào)道AML患者Flt3基因編碼的近膜區(qū)(JM)存在Flt3/ITDs29。此后

10、的國內(nèi)外報(bào)道顯示Flt3基因在70%-90%勺AML患者細(xì)胞中出現(xiàn)異常表達(dá)，其中20%-25%勺AML患者Flt3基因發(fā)生了Flt3/ITDs,并見于AML各亞型，其中以M3和M5多見，且突變率各異30。我們的研究發(fā)現(xiàn)在兒童白血病患者中Flt3陽性率80.33%,其中Flt3/ITDs突變率為17.21%;各亞型突變率分別為M042.86%、M122.22%、M212.90%M444.44咐口M515.38%。說明兒童AML外顯子11處發(fā)生Flt3/ITDs的頻率極高，是兒童AMUe生的主要原因31。目前，F(xiàn)lt3異常表達(dá)和基因突變導(dǎo)致AML發(fā)生的分子機(jī)制尚不完全清楚。目前大量的臨床研究證實(shí)F

11、lt3/ITDs常集于JM區(qū)中從密碼子589599富含酪氨酸殘基的一段區(qū)域，從首尾相按順序插入若干個(gè)復(fù)制的核甘酸。研究顯示在AMLI田胞株研究中，F(xiàn)lt3/ITDs可抑制c/EBPa(repressionofCCAAT/estradiol-bindingprotein%)和Pu.1的表達(dá)，阻滯髓源細(xì)胞分化；應(yīng)用Flt3/ITDs抑制劑處理AML細(xì)胞株后c/EBP%Pu.1表達(dá)增強(qiáng)32。進(jìn)一步的研究證實(shí)Flt3/ITDs可干擾激酶磷酸化信號(hào)通路，使STAT5(singaltransducerandactivatoroftranscription5)活化增強(qiáng)以及c/EBP%和Pu11表達(dá)抑制33。

12、說明Flt3/ITDs有利于Flt3二聚體的形成，引起配體非依賴性磷酸化，在AML勺發(fā)病機(jī)制中起重要作用。沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)第12卷3.2 Flt3基因突變與AML預(yù)后近年來大量臨床研究表明，F(xiàn)lt3/ITDs與AML預(yù)后密切相關(guān)。Gale等30的結(jié)果顯示Flt3/ITDs突變陽性AML患者與陰性組比較外周血WB時(shí)數(shù)顯著增高，CR率顯著降低，化療相關(guān)死亡率高，復(fù)發(fā)危險(xiǎn)增高，無病生存率、無事件生存率及總生存率均顯著降低。我們采用PC昉法聯(lián)合序列檢測(cè)伴有或不伴有染色體易位的AML患者Flt3基因突變情況，結(jié)果顯示：46例伴有染色體易位患者Flt3基因表達(dá)陽性率67.39%,其中Flt3/ITDs陽性率

13、分別為26.09%;伴有染色體易位Flt3/ITDs陽性患者外周血白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板、骨髓粒細(xì)胞比例雖與不伴有染色體易位Flt3/ITDs突變陽性患者基本相似，但平均生存時(shí)間明顯降低，僅為(8.9士1.5)個(gè)月34。如Flt3/ITDs陽性行自異體基因造血干細(xì)胞移植的AML患者無病生存率明顯提高35。提示Flt3/ITDs既可作為預(yù)測(cè)AML1后的一個(gè)重要指標(biāo)，也可以指導(dǎo)臨床治療。3.3 Flt3基因突變與AML微小殘留病灶檢測(cè)隨著急性白血病化療方案的改善和造血干細(xì)胞移植的進(jìn)展，急性白血病的完全緩解(CR)率明顯提高。然而仍有許多CR患者在數(shù)年內(nèi)復(fù)發(fā)，其主要原因是血液學(xué)CR后體內(nèi)仍殘留10

14、6109白血病細(xì)胞，稱為微小殘留病(minimalresidualdisease,MRD)現(xiàn)在普遍認(rèn)為MRDIb血?夜學(xué)CR乃至持續(xù)完全緩解(CCR期間白血病復(fù)發(fā)的根源。近年來分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為常規(guī)骨髓形態(tài)學(xué)檢查難以檢測(cè)的MRD§供了新方法，然而目前尚缺乏合適的MRD勺檢測(cè)指標(biāo)。Flt3/ITDs是與AML發(fā)生及預(yù)后相關(guān)的一種重要因子，可望成為MRD檢測(cè)的重要標(biāo)志物。Schnittger等36分析1003例AML患者，對(duì)34例Flt3/ITDs陽性患者進(jìn)行多次檢測(cè)Flt3/ITDs后認(rèn)為大部分患者Flt3/ITDs為唯一可檢測(cè)的標(biāo)志，且與臨床階段、FISH、PCR吉果有較好白相

15、關(guān)性，4例復(fù)發(fā)患者檢測(cè)Flt3/ITDs比其他方法提前23個(gè)月檢測(cè)到復(fù)發(fā)，認(rèn)為Flt3可作為MRD僉測(cè)標(biāo)志。我們用Flt3基因作為AMU勺分子標(biāo)志，通過PC世術(shù)跟蹤了AML完全緩解后的MRD結(jié)果表明：PCR術(shù)檢測(cè)Flt3基因的最低檢出值為100pg;Flt3基因陽性AML患者，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)治療后，半數(shù)左右的患者達(dá)到CR其中絕大部分患者Flt3基因表達(dá)減弱或轉(zhuǎn)為陰性；AML患者達(dá)CR后Flt3基因表達(dá)持續(xù)陽性或轉(zhuǎn)陰后再次出現(xiàn)陽性，提示將發(fā)生復(fù)發(fā)37。說明在完全緩解期追蹤檢測(cè)Flt3并分析其變化極為重要，F(xiàn)lt3轉(zhuǎn)為陰性或長期持續(xù)陰性者預(yù)示能獲得長期無病生存。4結(jié)語Flt3基因突變是AML中最常見的基因

16、異常，與AM3生有著密切關(guān)系。Flt3/ITDs有望成為一種新的生物標(biāo)志物，用于AML®后不良和MRDJ定，并可能成為AML臺(tái)療的新靶點(diǎn)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1RosnetO,MarchettoS,deLapeyriereO,etal.MurineFlt3,ageneencodinganoveltyrosinekinasereceptorofthePDGFR/CSF1RfamilyJ.Oncogene,1991,6:16411650.2MatthewsVyJordanCT,WiegandGWetal.Areceptortyrosinekinasespecifictohematopoietic

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