人呼吸道合胞病毒Long株的免疫原性初探.docx

1、人呼吸道合胞病毒Long株的免疫原性初探李華楊婷岳盤劉正玲姜廣菊龍洞鄉(xiāng)楊蓉羅芳宇謝忠平摘要目的評(píng)價(jià)人呼吸道合胞病毒(HRSV)Long株的免疫原性，為進(jìn)一步的研究疫苗提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法將HRSV制備成純化抗原，取40只ICR鼠.隨機(jī)分為4組，分別用純化HRSV、純化HRSV+Al(OH),、并設(shè)0.01mol/LPBS、A1(OH),對(duì)照組,0天、28天免疫小鼠，采用中和試驗(yàn)檢測(cè)血清中和抗體，流式檢測(cè)7種細(xì)胞因子。結(jié)果初免后28天，加AKOH),組與無AKOH),組抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率分別為60%和50%,抗體幾何平均效價(jià)(GMT)分別為1：4.49和1：5.27；加強(qiáng)免疫后，A1(OH),組與無A1(

2、OH)3組小血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率均達(dá)100%，抗體幾何平均效價(jià)(GMT)分別為I：17.15和1：10.56,平均增長(zhǎng)3.8倍和2.0倍；中和抗體在組間無差異，而組內(nèi)初免與再免的中和抗體有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)6加A1(OHL樣品組與無Al(OH),樣品組，所檢測(cè)7種細(xì)胞因子均誘導(dǎo)IL-6及TNF,與兩個(gè)對(duì)照組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),而另外5種細(xì)胞因子則無明顯升高。結(jié)論人呼吸道合胞病毒Long株可產(chǎn)生良好的免疫效應(yīng)。關(guān)鎧詞人呼吸道合胞病毒Long株細(xì)胞因了免疫原性中圖分類號(hào)R373.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)褐AEvaluationoftheImmunogenicityofHumanResp

3、iratorySyncytialVirusLongStraininMice.LiHua,YangTing,YueLei,etal.InstituteofMedicalBiology,PekingUnionMedicalCollege,ChineseAcademyofMedicalScience,YunnanProvincialEngineeringandTechnologicalResearchCenltrJorDevelopmentofVaccinesagainstMajorInfectiousDiseases,YunnanProvincialKeylaboratoryforDevelopm

4、entofVaccinesagainstMajorInfectionsDisease,Yunnan650118ChinaAbstractObjectiveToevaluateimmunogenicityofhumanrespiratorysyncytialvirus(HRSV)Longstrainandprovideexperimentaldataforfurtherresearch.MethodsHKSVwaspreparedaspurifiedantigenbycellculture,columnchromatography.Then,forty4-weekoldICRmiceweredi

5、videdintofourgroupsandinoculatedtwicewithHRSV,HRSV+Al(OH),PBS,andAl(OH),respectivelyat0and28days.Theserumneutralizingantibodyliterwasanalyzedbymicro-neutralizationtestinvitroandvariouscytokinesweredeterminedbyflowcytometry.ResultsSeroconversionratesofHRSV+Al(OH),groupandHRSVgroupwere60%and50%at28day

6、safterthefirstinoculation,andantibodygeometricmeantiters(GMT)were1：4.49and1：5.27.SeroconversionratesofHRSV+Al(OH),groupandHRSVgroupwere100%at7daysafterthesecondinoculation,andantibodygeometricmeantiters(GMT)were1：17.15(3.8-fold)and1：)0.56(2-fold).NeutralizingantibodiesbetweenHRSV+Al(OH),groupandHRSV

7、grouphadnodifferences,whileneutralizingantibodiesbetweentheinoculationshadsignificantlydifferences(P<0.01).IL-6andTNFofHRSV+A)(OH)jgroupandHRSVgroupbothincreasedsignificantlycomparedwithcontrolgroup(P<0.05).ConclusionHumanrespiratorysyncytialvirus(HRSV)Longstraincaninduceimmuneresponseeffectiv

8、ely.KeywordsHumanrespiratorysyncytialvirus(HRSV)；Longstrain；Cytokine；Immunogenicity人類呼吸道合胞病毒(humanrespiratoryvirus,HRSV)是世界范圍內(nèi)嬰幼兒病毒性下呼吸道感染最重要的病原體，尤見于嬰幼兒、老年人及免疫缺陷病人等急性呼吸道感染住院者m。據(jù)估計(jì)，每年在世界范圍內(nèi)有3400萬(wàn)6500萬(wàn)的呼吸道合胞病毒感基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)基金資助項(xiàng)目(2012AA02A404)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目(2011FZ2I0)作者單位：650118昆明，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和

9、醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省敢大傳染病疫苗工程技術(shù)研究中心，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)放點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室通訊作者：謝忠平，電子信箱：xzp218染病例和16.0萬(wàn)19.9萬(wàn)死亡病例，僅在美國(guó)，呼吸道合胞病毒導(dǎo)致每年住院大約12.5萬(wàn)例。在發(fā)展中國(guó)家，RSV在嬰幼兒引起急性下呼吸道感染的病死率比較高。由于該病毒的高感染率，在1歲前近70%的兒童就被首次感染，更重要的是，2歲以下嬰兒大約36%至少感染兩次0引。從1956年Mor-ris等首次發(fā)現(xiàn)該病毒至今，RSV感染引起的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)實(shí)際上比季節(jié)性流感更加嚴(yán)重，給國(guó)家和個(gè)人帶來極大的損失。雖然HRSV疫苗的研究已有50多年的歷史，但至今尚無被批準(zhǔn)使用的產(chǎn)品

10、。因此，WHO已將呼吸道合胞病毒疫苗列為21世紀(jì)需要優(yōu)先解決的問題之-0由于IIRSV自然感染激發(fā)的機(jī)體免疫是不完全免疫，需再次或多次的HRSV感染才能完善，疫苗需要多次給荷才能達(dá)到保護(hù)嚴(yán)幣下呼吸道感染的免疫水平。因此.獲得免疫原性高的病毒株，才能為后續(xù)制備RSV單克隆抗體及裂解疫苗的研究打下基礎(chǔ)”鑒FRSV感染后,T細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子在致病和抗病中有著幣:要的作用。對(duì)Thl/Th2細(xì)胞因子的研究，在RSV疫苗及治療藥物方而有樣枳極意義。至今對(duì)KSV的研究已經(jīng)涉及很多方面，但對(duì)RSVA亞型山嘩株免疫原性的基礎(chǔ)研究還未見報(bào)道，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。材料與方法1. 材料:(1)細(xì)胞和病毒:Hep-2細(xì)

11、胞、KMB”細(xì)胞由本所質(zhì)質(zhì)檢定室提供;RSV修叫株購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。(2)主要儀器和試劑：BDFACSCanto【I流式細(xì)胞儀為I巾公司產(chǎn)品；IW聯(lián)免疫分析儀/多功能生物檢測(cè)儀為美國(guó)BIOTEK公司產(chǎn)品；Bl()-RAI)Chemi!)<><rMImagingSystem為美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品；一抗:兔抗RSVIgC為美國(guó)IMG-ENEX公司產(chǎn)品；半抗兔-HRP為alxarn公司產(chǎn)品；AI(0H),佐劑(濃度為2.0mg/ml)為本所甲肝疫苗生產(chǎn)室自制；BDCytomrlricBead.Xrray(CBA)MouseThl/Th2/Thl7CytokineKi

12、t(lol：3072948),購(gòu)于BD公司；化學(xué)發(fā)光底物:ImmobilonWesternChemiluminecentHRPSubstrate(lot：1131801)，購(gòu)于Milliport*公司。(3)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)ICR(InstituteofCancerResearch)小鼠,4周齡，雌旋各半，體9(16-18g,由筆者單位靈長(zhǎng)類中心小動(dòng)物部提供實(shí)臉動(dòng)物合格證弓：SYXK(滇)2010007,2. 方法：(1)實(shí)撿性疫苗制務(wù)：取生K狀態(tài)良好的致密單ISHep2細(xì)胞，培養(yǎng)并收狀病誰(shuí)；初純、超濾濃縮；選擇Seph-arosIFF凝膠”純化.用雙抗體夾心法檢測(cè)RSV抗原含時(shí).將RSV抗原

13、含W而的不同收集樣品合并即為純化的HRSV樣品，合并的樣品用30kDa的超濾離心管.4000r/min,20min離心濃縮純化HKSV加AI()H),或不加AI(OH),制備成為實(shí)輪組樣品(2)純化產(chǎn)物的檢測(cè)：不同純化收集的產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳；濃筋后樣品用蛋白檢測(cè)試劑盒PierceBCAProleinAssayKit檢測(cè)蛋白含仙，具體方法見試劑盒說明B；Westernblot法鑒定SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)印至PDVF股上.以5%脫脂奶粉37Y封閉lh后，加-抗(兔抗RSVIgG多克隆抗體,濃度I：500)4T過夜、加二抗(乍抗兔IgG-HRPI：500)37T反應(yīng)lh,化學(xué)發(fā)光底物

14、曝光顯影>(3)免疫原性評(píng)價(jià)：選取ICK小鼠40只.隨機(jī)分為4組，每組10只。2組實(shí)輪性樣品：純化HRSV組無AI(OH),佐劑、純化HRSV+Ai(OH)j佐削組AI(0H使用濃度為l.0mg/ml；同時(shí)設(shè)兩個(gè)對(duì)照m：0.01mol/LPBS(pH7.4)對(duì)照組、AI(OH),對(duì)照組O.OImol/LPBS(pH7.4)配制的l.0mg/mlA1(OH)3佐劑。免疫注射劑景：每只0.5ml,腹腔注射。免疫程序：分別于0天、28天免疫.共免疫2次.于初免后28天、加強(qiáng)后7天采血分離血清，檢測(cè)血清中和抗體效價(jià)及IL-2JL-4JL-6JFN-7JNFJL-17AJL-IO共7種細(xì)胞因于“(

15、4)血清中和抗體效價(jià)檢測(cè)：采用固定羯荏稀釋血清的微砒中和試驗(yàn)法來檢測(cè)血清中和抗體效價(jià)。待測(cè)血清56弋滅活30min后，做2倍系列稀釋.每稀料度50微升/孔，可加入2000CCID/ml病毒50微升/孔,混勻,37*中和lh后，加入IxIO6/ml濃度的Hep-2細(xì)胞100微升/孔.置37Y、4%CO,孵箱中培葬。同時(shí)設(shè)置病毒對(duì)照、細(xì)胞對(duì)照和明性血清對(duì)照。于第7天判定結(jié)果。以抗體效價(jià)Nl：4為陽(yáng)性。(5)血清細(xì)胞因子的檢測(cè)：用BD公BDCytometricBeadArray(CBA)Moum*Thl/Th2/Thl7CytokineKit,流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠血清中的IL-2等7種細(xì)胞因子。具體方

16、法見試劑食說明書°3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析分別對(duì)組間進(jìn)行比較.對(duì)于不滿足正態(tài)分布的，采用非參數(shù)檢臉的方法進(jìn)行比較；滿足正態(tài)分布旦方差齊性，采用兩獨(dú)立樣本的，檢驗(yàn).以P<0.05為差異行統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1. Sepharose4FF凝膠過濾層析法純化樣品：收獲病毒液感染性效價(jià)為6.l25lgCCID“/ml,抗原效價(jià)為1：64,純化得率為44.4%。Sepharose4FF凝膠過濾純化曲線(圖I)。圖1Sepharose4FF凝膠過浦層析法純化樣品的純化曲線2. SDS-PAGE電泳和Westernblot：經(jīng)檢測(cè)RSV抗原含量高的樣品合并，用5

17、0kl)a的離心管離心濃縮，即為實(shí)驗(yàn)樣品，SDS-PAGE電泳，Bio-Rad的QuantityOne軟件分析表明，純度達(dá)95%以上。Westernblot檢測(cè)，可見為3個(gè)條帶:G蛋白90kDa、F蛋白55k【)a及N蛋白46kDa(圖2)。用蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白含址為3.66mg/mlo3. HRSV純化樣品的中和抗體：將樣品合并濃縮后，加AI(OH),或不加AI(OH)3制備成實(shí)驗(yàn)性樣品。經(jīng)免疫程序(一免1針或二免2針)免疫ICR小550005500010000350002500015000藉MMr9(XMX)05500046<XM)燉化MrRSVMMr13()0001000007

18、000055(MK)35()002S(XX)圖2Sepharose4FF»膠過津?qū)游龇兓瘶悠返腟DS-PAGE和Westernblot結(jié)果鼠，每組10只，每只腹腔注射0.5ml實(shí)驗(yàn)性樣品。分別于-免后28天，加強(qiáng)免疫后7天，采血，分離血清檢測(cè)中和抗體效價(jià)(表1),一免后，加AI(OH)3樣品組與無Al(OH),樣品組的抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率分別為60%和50%,抗體效價(jià)分別為1=4.49及1：5.27,兩組間抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率及GMT值均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.409)e二免后2個(gè)實(shí)驗(yàn)組抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率均升高為100%,GMT分別為1：17.15及I：10.56,均有明顯增高，與一免后結(jié)果相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

19、(P<0.01),但Al(OH),樣品組與無佐劑病毒抗原組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.220)。表1HRSVLong株純化樣品免疫ICR小鼠中和抗體效價(jià)I組繩化HRSVAKOH),組，0天、28天免疫紐;2如純化HRSV組，不加Al(OH),樣品，0天、28天免疫組；3組.Al(OH),對(duì)照組；4中和抗體效價(jià)純化HRSV+AI(OH),飩化HRSVAI(OH)j0.0lmol/LPBS一免二免免二免一免二免一免二免<1：44050101010101：4513200001：8132400001：16020200001：32020200001：6402000000動(dòng)物怠數(shù)10101010

20、10101010抗體附性故6105100000抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率(%)60100501000000中和抗體GMT1：4.491：17.151：5.271：!0.560000m.0.01mol/LPBS對(duì)照組4. 血清中細(xì)胞因子檢測(cè)：用BD公司MouseThl/Th2/Thl7CytokineKit檢測(cè)小鼠血清，小鼠血清中的IL-2JL-4、IL-6、IFN、TNF、IL-17AJL-10共7種細(xì)胞因子僅1L-6及TNF2種細(xì)胞因子顯著上升，其余5種皆無表達(dá)(圖3、圖4)。純化HRSV+Al(OH)j組、純化HRSV組、A1(OH)3對(duì)照組與0.01mol/LPBS對(duì)照組共4個(gè)組，一免與二免(組內(nèi))、加

21、A1(OH)3與不加AI(OH)3樣品組(組間)之間，其細(xì)胞因子1L-6.TNF兩種細(xì)胞因子組間皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,表2)。表2不同免疫組IL-6與TNF兩種細(xì)胞因子含量IL-2JL-4.IL-10JFV-7含址均為。細(xì)胞因子純化HRSV+AI(OH),純化HRSVAKOH),0.01mol/LPBS一免二免一免二免1L-615.35±3.5137.52±5.817.71±2.3813.46±2.036.25*4.014.16±0.68TNF81.27±13.11111.49±11.0059.06±

22、7.2974.96±9.3324.39"3324.67±3.91討論針對(duì)傳染病及流行病的預(yù)防，傳統(tǒng)經(jīng)典疫苗是主要的研究方向，所以應(yīng)獲得代表國(guó)內(nèi)流行的病毒株，且應(yīng)能在體外高效增殖、遺傳穩(wěn)定性高'免疫原性好的優(yōu)勢(shì)毒株，所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)HRSVLong株進(jìn)行免疫原性初步探索。將純化蛋白加入AI(OH),或不加入AI()H)3佐劑制備為實(shí)驗(yàn)樣品組，免疫ICR小鼠，病毒中和試驗(yàn)結(jié)果表明，第1次免疫后抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率達(dá)6。%及50%，加強(qiáng)免疫后，抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率皆達(dá)I。，抗體幾何平均效價(jià)(GMT)分別為1：17.15和1：10.56,平均增長(zhǎng)3.8倍和2.0倍，但一免及二免后中和抗體

23、鋁佐圖3純化HRSVLong株免疫小版不同組別IL-6含A.純化HRSVAKOH）,組第次免疫小M.;B.純化HRSV+AI（OH）j蛆第2次免疫小鼠；C.純化ilRSV第1次免疫小鼠:D.純化HRSV組第2次免疫小鼠；E.Al（OH）：對(duì)照組；F.0.01mol/LPBP對(duì)照組50454035302520151050wox)olow)o。4<2O<86<4I2111(wl)IS:&XNf-a-左昌圖4純化RSVLong株免疫小鼠不同組別TNF含A.純化HRSV+AKOH）,組第I次免疫小鼠；B.純化HRSV»Al（OH）j祖第2次免疫小鼠；C.純化IIRS

24、V祖第I次免疫小隊(duì)；D.純化HKSV組第2次免疫小鼠；E.AI（OH）j對(duì)照祖；F.0.Olmol/LPBP對(duì)照組劑組與無佐劑組GMT差異皆無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？贵w水平顯著升高，但是效價(jià)較低，這與文獻(xiàn)7報(bào)道的RSVA2株的免疫結(jié)果相符。實(shí)驗(yàn)雖然不是同一病毒株，但都屬于A亞型，究其原因：是否由于RSV病毒是有包膜的病毒，經(jīng)過病毒的初純、超濾濃縮、凝膠純化及再濃縮（超濾離心）一系列處理對(duì)病毒的影響所導(dǎo)致。另一個(gè)原因是否由于該毒株的生物學(xué)特性及基因編碼與其他病毒的具體差異所致，在獲得RSVLong株后，對(duì)病毒株擴(kuò)大培養(yǎng)至第5代，并進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增病毒的F基因、G基因及N基因，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)（比對(duì)株

25、GenBank登錄號(hào):AY911262.1）:RSV-N蛋白核昔酸同源性為97.48%,RSV-F蛋白為94.01%,RSV-G蛋白為99.78%。該毒株的F蛋白同源性較G蛋白低，與文獻(xiàn)報(bào)道不一致，但都大于90.00%，同源性的差異是否與血清效價(jià)有直接關(guān)系，有待進(jìn)步實(shí)驗(yàn)。20世紀(jì)60年代研制的甲醛滅活疫苗（F1-RSV）的研究發(fā)現(xiàn)，HRSV滅活疫苗具有疾病加強(qiáng)作用，可能原因是破壞了小鼠輔助性T細(xì)胞Thl和Th2亞群動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。本次研究小鼠血清的細(xì)胞因于實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，僅有1L-6及TNF2種細(xì)胞因子升高，而IFN-7JL-4JL-2皆未升高。實(shí)驗(yàn)中A1（OH、佐劑的使用，主要于注射位點(diǎn)的沉積.

26、誘導(dǎo)動(dòng)物模型的Th2型免疫應(yīng)答，但結(jié)果顯示佐劑的使用并未顯著增加HRSV的免疫效果，所產(chǎn)生的抗體與無佐劑組無顯著差異"°）。所以該RSVLong株所誘導(dǎo)的免疫是平衡的，未見明顯的疾病加強(qiáng)指標(biāo)。另外,IL-6及TNF2種細(xì)胞因子的升高，是否可以從以下得到解釋:Levitz等山報(bào)道無論是在體內(nèi)和體外，IL-6促炎細(xì)胞因子是宿主對(duì)呼吸道合胞病毒感染的反應(yīng)產(chǎn)物。Pribul等發(fā)現(xiàn)肺部早期趨化因子分泌的峰值是由巨噬細(xì)胞驅(qū)動(dòng)，肺泡巨噬細(xì)胞受激活導(dǎo)致大量促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生包括MIPla、TNF-a、IL-6、IL-8。實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)的IL-6及TNF2種細(xì)胞因子升高，是否由于肺泡巨噬細(xì)胞激

27、活所致尚待進(jìn)一步證實(shí)cChoi等”報(bào)道腫瘤壞死因子（TNF）與兒童呼吸道感染RSV引起嗜酸性粒細(xì)胞炎癥有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，人外周血多形核顆粒細(xì)胞（PMN）感染RSV后可分泌IL-6JIIL-6的含量與接觸病毒的數(shù)所有密切關(guān)系，Grell等報(bào)道的IL-6的產(chǎn)生呈現(xiàn)年齡依賴性，即年齡越小的動(dòng)物越容易產(chǎn)生。綜上所述，如何在保持免疫原性的基礎(chǔ)上，使RSV病毒樣品能誘導(dǎo)平衡的Thl/Th2反應(yīng)，增加疫苗的安全性，是RSV疫苗研究的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)初步探討了RSVLong株抗原的免疫原性，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，本研究所制備的HRSV能誘導(dǎo)產(chǎn)生明顯的體液免疫及細(xì)胞免疫，為進(jìn)一步系統(tǒng)研究HRSV疫苗提供了實(shí)驗(yàn)資料。參考文

28、獻(xiàn)1 RobinsonKA.OdelolaOA,SaldanhaU.etal.PalivizumabforprophylaxisagainstrespiratorysyncytialvirusinfectioninchildrenwithcysticGbrosisfJ.CochraneDatabaseSystRev,2012,2:C1X）07743SchmidtMR,McGinnesLW,KenwardSA,elal.Long-termandmemoryimmuneresponsesinmiceagainstnewcastlediseasevirus-likeparticlescontaini

29、ngrespiratorysyncytialvirusglycoproteincctodo-mainsfJ,JVirology.2012,86（21）：11654-116622 StoreyS.Respiratorysyncytialvirusmarket.NaturereviewsJ.DrugDiscovery2010,9：15-16NairH.NokesDJ.GeiwnerBD.eial.Globalburdenofacutelowerrrspiratoryinfectionsduetorespiratorysyncytialvirusinyoungchildren：asystematic

30、reviewandmela-analysisJ.lancet.2010,375：1545-15553 張竟，佝浩林.梅興國(guó).呼吸道合胞病毒（RSV）與Thl/Th2細(xì)胞因子的關(guān)系研究進(jìn)展J.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,25(12)：1016-1020金奇，畢勝利，陳繼明.醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)M.北京：科學(xué)出版社，2001:461-4796 童莉蛆，李華，蔣乾物，等.人呼吸道合胞病毒不同純化方法的比較研究J.醫(yī)學(xué)研究雜志,2011.40(4):73-76李光，井申榮.呼吸道合胞病毒蛋白的研究進(jìn)展J).中國(guó)生物制品雜志,2006,19(5):541-5477 BrewerJM.ConacherM,Sat

31、oakerA.etal.Ininterleukin-4-deficientmice,alumnotonlygeneratesThelper1responsesequivalenttoFreund'scompleteadjuvant,butcontinuestoinduceThelper2cytokineproductionJ.EURJImmunol,1996,26(9)：2062-2066MosmannTR,CherwinskiH,BondMW.elal.TwotypesofmurinehelperTcellclone.I.Definitionaccordingtoprofilesof

32、lymphokineactivitiesandsecretedproteinsJ.JImmunol.1986,136(7)：2348-2357LevitzR,WattierR.PhillipsP,etal.InductionofIL-6andCCL5(RANTES)inhumanrespiratoryepithelial(A549)cellsbyclinicalisolatesofrespiratorysyncytialvirusisstrainspecificJ.Virol,2012,(190)9：l-98 PribulPK,HarkerJ,WangB,etal.Alveolarmacrop

33、hagesareamajordeterminantofearlyresponsestovirallunginfectionbutdonotinfluencesubsequentdiseasedevelopmenttJ.JVirol.2008,82(9):4441-4448ChoiJ,CallawayZ,KimHB,elal.TheroleofTNF-aineosinophilicinflammationassociatedwithRSVbronchiolitisJ.PediatricAllergyImmunology,2010,21:474-479(收稿日期：2013-12-25)(修回日期：

34、2013-12-30)人結(jié)直腸癌細(xì)胞Drosha基因敲除細(xì)胞模型的構(gòu)建李蕓僑李尚澤宋偉王任先張曉東王琳芳摘要目的為研究核酸酶Drosha與結(jié)直腸癌的關(guān)系，利用腺相關(guān)病毒（AAV）介導(dǎo)的染色體同源重組技術(shù)，構(gòu)建Drosha基因敲除的HCT116結(jié)直腸癌細(xì)胞模型。方法設(shè)計(jì)引物通過PCR擴(kuò)增Drosha基因的同源臂，構(gòu)建Drosha的AAV病毒打靶栽體，通過病毒的包裝、感染、抗生素新霉素（G418）藥物篩選、PCR以及Westernblot鑒定獲得基因敲除陽(yáng)性細(xì)胞株，通過Cre病毒感染去除抗性基因，最終建立敲除Drosha基因的結(jié)直腸癌細(xì)胞模型。結(jié)果經(jīng)過兩輪打靶，分別將DNA雙輕上的Drosha基因

35、去除并經(jīng)Westernblot鑒定，獲得Drosha-/-陽(yáng)性的HCTU6細(xì)胞株。結(jié)論通過AAV病毒介導(dǎo)的染色體同源重組技術(shù)，成功構(gòu)建Drosha基因敲除的HCT116細(xì)胞系。關(guān)鍵詞基因敲除Drosha同源重組結(jié)直腸癌中圖分類號(hào)R735文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)袒AEstablishmentofDrosha-/-cellModelinHCT116.LiYurujiao,LiShangze,SongWei,etal.StateKeyLaboratoryofMedicalMolecularBiology,InstituteofBasicMedicalSciences,CAMSandSchoolofBasicMedicine,PUMC,Beijing10000