WB原理步驟及總結(jié)

1、蛋白質(zhì)印跡是把電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)上， 然后利用抗原抗體反 應來檢測特異性的蛋白分子的技術(shù)， 包括三個部分：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳， 蛋白質(zhì)的電泳轉(zhuǎn)移，免疫印跡分析。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳主要用于測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量，SDS是陰離子 去污劑，能斷裂蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的氫鍵， 使分子去折疊， 破壞其高級結(jié)構(gòu)。 SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比為:1，由于SDS帶有大量的負電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合 時掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別， 使各種蛋白質(zhì)帶有相同密度的負電 荷，形似長橢圓棒， 蛋白遷移率與蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的對數(shù)呈線性關(guān)系。 因此， 利用相對分子質(zhì)量標準蛋白所作的標準曲線

2、，可以求得未知蛋白的相對分子質(zhì) 量。電泳后蛋白質(zhì)分子嵌在凝膠介質(zhì)中，探針分子很難通過凝膠孔，將蛋白質(zhì)從 凝膠轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)上可以對蛋白質(zhì)進行免疫檢測分析。 方法有兩種： 水平半 干式轉(zhuǎn)移即將凝膠和固定基質(zhì)似三明治樣夾在緩沖液浸濕的濾紙中間，通電 1030min可完成垂直濕式轉(zhuǎn)移即將凝膠和固定基質(zhì)夾在濾紙中間，浸在轉(zhuǎn)移 裝置的緩沖液中，通電 24h 或過夜可完成。固定基質(zhì)通常有硝酸纖維素膜、聚 偏二氟乙烯膜和尼龍膜。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固定化膜上之后，通過蛋白質(zhì)染料如麗春紅S檢測膜上的總蛋 白，或用考馬斯亮藍檢測凝膠上的蛋白剩余量， 以驗證轉(zhuǎn)移是否成功。 用抗體作 為探針進行特異性的免疫反應檢測抗原蛋白

3、，分為4步：用非特異性、非反應活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由結(jié)合區(qū)， 以防止作為探針的抗體結(jié)合 到膜上，出現(xiàn)檢測時的高背景固定化膜用專一性的一抗溫育，使一抗與膜上的抗原蛋白分子特異性結(jié)合酶標二抗與一抗特異結(jié)合加入酶底物，適當保溫， 膜上便可見到顏色反應，檢測出抗原蛋白區(qū)帶。主要溶液10%分離膠水 、 30% 丙烯酰胺混合液 、 L Tris ()、 10% SDS、 10%過硫酸銨、 TEMED5%濃縮膠水、 30%丙烯酰胺混合液、 L 、 10%10%過硫酸銨、1X Tris -甘氨酸電泳緩沖液Tris 堿、甘氨酸、SDS 1g,用去離子水定容至1L2X SDS凝膠加樣緩沖液Tris

4、-HCI () 100mmol/L,B -巰基乙醇 10% 10%t油，溴酚藍，10%SDS 轉(zhuǎn)移緩沖液Tris ，甘氨酸，甲醇100mL加去離子水至1LTBSTTris NaCI ，Tween-20 1 mL，加去離子水至 1LStrippingTris(pH )，4mL10%SDS140卩l(xiāng) B -巰基乙醇，用水定容到 20mL實驗步驟1 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠配置 分離膠的配置： 將配置好的分離膠液混勻后迅速倒入膠槽中， 至距離短玻 璃板頂端約2cm處，停止灌膠。檢查是否有氣泡，若有用濾紙條吸出。然后在膠 液界面上加蒸餾水進行水封。 1530min 后，凝膠和水封層界面清晰，說明膠

5、已 經(jīng)聚合完全，然后用濾紙吸取水封層，濾紙切勿接觸到凝膠面。 （使蛋白樣品分 離） 濃縮膠的配置： 將配置好的濃縮膠灌注在分離膠之上， 直至短玻璃板的頂 端，然后插入樣品槽梳子。室溫下濃縮膠聚合，約2030min。（使蛋白樣品濃縮） 蛋白樣品的處理將蛋白樣品溶于樣品溶解液，終濃度為 1mg/ml。然后轉(zhuǎn)移到小離心管中， 輕輕蓋上蓋子（不能塞緊，以免加熱時液體迸出），在100C沸水浴中加熱3min, 取出冷卻后備用， 使用前需要將樣品離心除去顆粒物質(zhì)。 暫時用不到的話， 可放 在-20C冰箱長期保存，使用時沸水浴中加熱3mi n,以除去亞穩(wěn)聚合態(tài)物質(zhì)。上樣前的樣品一定要均勻以防電泳時出現(xiàn)縱向條帶

6、。加樣 拔去樣品槽梳子，倒入電極緩沖液，沒過短板約以上，若樣品槽中有氣泡， 用槍頭挑除。 按順序向凝膠樣品槽中加入標準蛋白和未知蛋白樣品， 每孔的加樣 量要相同，一般加樣體積為 1030卩l(xiāng)，加樣時槍頭深入到加樣槽內(nèi)，盡量接近 底部，記錄加樣順序。電泳上槽接負極，下槽接正極，打開直流穩(wěn)壓電源，先 80V 過了濃縮膠后改為 120V,待溴酚藍指示劑遷移到凝膠下沿 1cm時停止電泳。2 蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移水平半干式電轉(zhuǎn)移 戴乳膠手套剪濾紙6張，濾紙長與寬比SDS-PAGE交各大1cm 裁剪與SDS-PAGE膠長寬相等的NC膜。 將3張濾紙和SDS-PAGE交浸在負極轉(zhuǎn)移液中待用。 將另3張濾紙和NC轉(zhuǎn)

7、移膜浸在正極轉(zhuǎn)移液中待用。 將浸在負極轉(zhuǎn)移液中的濾紙取出， 盡量少帶液體， 置于轉(zhuǎn)移槽負極上， 然 后在負極濾紙上依次鋪放SDS-PAGE交、NC膜、3張用正極轉(zhuǎn)移液飽和的濾紙。 注意排除氣泡，因為 氣泡會產(chǎn)生高阻抗點， 形成低效印跡區(qū)， 即所謂“禿斑”。 蓋上石墨陽極板，設定50mA恒流，轉(zhuǎn)移一定時間。垂直濕式轉(zhuǎn)移 凝膠片的平衡：把電泳后的凝膠從玻璃板上轉(zhuǎn)移至成有適量轉(zhuǎn)移緩沖液的 大培養(yǎng)皿中，浸泡3060min,以除去膠中的SDS使其pH及離子強度和印跡緩沖 液相一致，防止凝膠發(fā)生膨脹或皺縮。 將轉(zhuǎn)移緩沖液冷卻至4C 準備NC膜和濾紙：戴乳膠手套裁剪與凝膠大小相同的NC膜和4張濾紙，用轉(zhuǎn)移緩

8、沖液浸潤膜和濾紙15mi n,直到?jīng)]有氣泡， 將海綿在轉(zhuǎn)移緩沖液中充分浸濕 打開蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移槽的轉(zhuǎn)移夾， 依次放入： 浸濕的海綿， 兩張用轉(zhuǎn)移緩沖液飽和的濾紙，用轉(zhuǎn)移緩沖液浸過的膠，NC膜，兩張用轉(zhuǎn)移緩沖液飽和的濾紙，浸濕的海綿，然后合上轉(zhuǎn)移夾。 轉(zhuǎn)移槽中倒入轉(zhuǎn)移緩沖液，然后將轉(zhuǎn)移夾置于槽中，凝膠靠近負極NO!靠近正極將轉(zhuǎn)移槽放到4 °C冰箱內(nèi)，電轉(zhuǎn)移，恒流80 mA 4 h。3 免疫印跡分析NC膜上總蛋白的染色和脫色：將電泳轉(zhuǎn)移完后的NCS取出，置于培養(yǎng)皿中。 麗春紅S染色3min后，用鉛筆輕輕標出標準蛋白帶的位置以備計算特異性蛋白 質(zhì)相對分子質(zhì)量所需。然后，用麗春紅 S脫色液輕輕漂

9、洗數(shù)次至紅色消失。特異性抗體檢測 脫色后的NC膜置于培養(yǎng)皿中，加入封閉液，并在水平搖床上不斷振搖， 室溫下封閉2h以上。（將膜上未結(jié)合目的蛋白的區(qū)域封閉以防止一抗的結(jié)合） 倒出封閉液，加入漂洗液，水平搖床上不斷振搖，洗膜3次，每次5min。（除去封閉液） 漂洗完后，將膜轉(zhuǎn)移至雜交袋中，加入特異性一抗，4C搖床過夜或室溫放搖3h （一抗與目的抗原蛋白特異性結(jié)合） 利用水平搖床，用TBST洗膜3次，每次5min。（洗去未結(jié)合的一抗） 將膜轉(zhuǎn)移到稀釋的酶標二抗中，在室溫下孵育30mi n 傾去二抗，用TBST洗膜，室溫搖洗三次，每次5min，蛋白面朝上，置于 保鮮膜中，將ECL的A液和B液以1:1體

10、積混合，于暗室中，按的量滴加于膜表 面，孵育1mi n,濾紙吸去多余液體用保鮮膜包好，立即于暗室內(nèi)曝光數(shù)秒。在暗室中，將1 X顯影液和定影液分別到入塑料盤中； 在紅燈下取出X 光 片，剪裁適當大?。ū饶さ拈L和寬均需大 1cm）;打開X-光片夾，把X 光片放 在膜上，一旦放上，便不能移動，關(guān)上 X-光片夾，開始計時；根據(jù)信號的強弱 適當調(diào)整曝光時間，一般為1min或5min，曝光完成后，打開X-光片夾，取出 X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時間 一般為12min （2025C）,溫度過低時（低于16 C）需適當延長顯影時間； 顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影

11、液中，定影時間一般為510min,以膠片 透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。注意事項 在合適的鹽濃度下，應保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復性； 不同濃度的凝膠用于分離不同相對分子質(zhì)量的蛋白 選擇合適的表面活性劑和還原劑， 破壞所有非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復合物和共價鍵、二硫鍵；對于多亞基蛋白或含多條肽鏈的蛋白，SDS- PAGER能測定它們的亞基或單條肽鏈的相對分子質(zhì)量。 盡量除去核酸、多糖、脂類等干擾分子； 蛋白質(zhì)樣品在處理過程中應低溫下進行， 以避免細胞破碎釋放出各種酶對 其進行修飾 盡量使用新鮮的 loading buffer ，樣品要與 loading buffer 混合均勻，

12、 不可將蛋白質(zhì)反復凍融使用以防改變蛋白質(zhì)的抗原特性， Buffer 一定要漫過梳子孔，否則可能會發(fā)現(xiàn)蛋白跑不動； 電泳時先用低電壓跑過濃縮膠， 再換高電壓跑分離膠， 特別是對于高分子 量的目的蛋白， 硝酸纖維素（NC）膜：NC與蛋白質(zhì)靠疏水作用結(jié)合，無需預先活化，對蛋白質(zhì)的活性影響小； 非特異性本底顯色淺；價格低廉，使用方便。但結(jié)合在 NC 上的小分子蛋白質(zhì)在洗滌時易丟失；NC韌性較差，易損壞。聚偏二氟乙烯（PVDF）膜：與蛋白質(zhì)親和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化 膜上的正電基團，使其更容易與帶負電荷蛋白結(jié)合。但價格上稍貴。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小要先將膜晾干，

13、然后浸入20%勺甲醇，待完全浸濕后取出透光觀察即可看到蛋白條帶（適用 于PVDF膜）。傳統(tǒng)方法是將膜用1X麗春紅染液染5min （于脫色搖床上搖），然 后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易 產(chǎn)生較高的背景。 高背景可能的原因：膜未均勻浸泡；膜或緩沖液污染；封閉 不充分；抗體與封閉液出現(xiàn)交叉反應；抗體濃度過高。解決方法有：轉(zhuǎn)膜前用 100%?醇將膜完全浸泡；雜交前檢測一抗、二抗；檢測一抗、二抗與封閉液是否 有交叉反應。轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預染蛋白質(zhì)分子量標準，通常分子量最大的 1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也

14、可以用麗春紅染色液對膜進行染色， 以觀察實際的轉(zhuǎn)膜 效果。也 可以用考 馬斯亮藍快 速染色 液對完成轉(zhuǎn) 膜的 SDS-PAG膠進行染色，以觀察蛋白的殘留情況。作用定性分析蛋白質(zhì)，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測和測定蛋白質(zhì)分子量，分析目的蛋白表達的特異性。蛋白樣品的制備（1）單層貼壁細胞總蛋白的提?。?、倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵?直立放置一會兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。2、每瓶細胞加3ml 4 C預冷的PBS（）。平放輕輕搖動 1min洗滌 細胞，然后棄去洗液。重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。3、按1ml

15、裂解液加10卩l(xiāng) PMSF （ 100mM，搖勻置于冰上。（ PMSF 要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。）4、每瓶細胞加400卩1含PMSF勺裂解液，于冰上裂解 30min，為使 細胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回搖動。5、裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動作要快），然后用槍將細胞碎片和裂解液移至離心管中。（整個操作盡量在冰上進行。）6、于4°C下12000rpm離心5min。（提前開離心機預冷）7、將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到離心管中放于20 C保存。（2）組織中總蛋白的提取：1、將少量組織塊置于 12ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組 織塊盡量剪碎。2、加400卩1單去

16、污劑裂解液裂（含 PMSF于勻漿器中，進行勻漿。 然后置于冰上。3、幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復碾幾次使組織盡量碾碎。4、 裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至離心管中，然后在4C 下12000rpm離心5min，取上清分裝于離心管中并置于 20C保存。（3）加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取：由于受藥物的影響，一些細胞脫落下來，除了按（一）操作外還應收 集培養(yǎng)液中的細胞。培養(yǎng)液中細胞總蛋白的提取：1、 將培養(yǎng)液倒至 15ml離心管中，于 2500rpm離心5min。2、 棄上清，加入 4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心 5min。棄上清后用 PBS重復洗滌

17、一次。3、 用槍洗干上清后，加 100 1裂解液（含 PMSF冰上裂解30min， 裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細胞充分裂解。4、 將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4C、12000rpm離心5min，取 上清分裝于離心管中并置于20C保存。（三）蛋白含量的測定（1）制作標準曲線1、從一20C取出1mg/ml BSA，室溫融化后，備用。2、取18個離心管，3個一組，分別標記為 0mg,。3、按下表在各管中加入各種試劑。0mg1mg/ml BSA100m L NaCIG250考馬斯亮藍溶 液1ml1ml1ml1ml 1ml 1ml4、混勻后，室溫放置 2min。在生物分光光度計上比色分析。（2）檢測

18、樣品蛋白含量1、 取若干離心管，每管加入4°C儲存的考馬斯亮藍溶液1ml。室溫放置30min后即可用于測蛋白。2、 取一管考馬斯亮藍加 L NaCl溶液100 ml，混勻放置2分鐘可做為 空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標準曲線的程序下按blank測空白 樣品。3、 棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次（每次），再用無菌水 洗一次。4、 取一管考馬斯亮藍加95 L NaCl NaCl溶液和5ml待測蛋白樣品，混勻后靜置2min，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。注意：每測一個樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次，無菌水洗一次?？赏瑫r混合好多個樣品再一起測，這樣對測定大量的蛋白樣品可節(jié) 省很多時間。測得的結(jié)果是 5 ml樣品含的蛋白量。主要參考生物化學實驗教程劉箭主編分子生物學實驗指導魏群主編還有百度上搜的關(guān)于 wb的方法步驟及試驗中出現(xiàn)的問題熱致相分離法的英文縮寫TIPS，是Thermally Induced PhaseSeparation的簡稱