堿裂解法制備質(zhì)粒的各種溶液的作用及提取中可能出現(xiàn)的問題

1、堿裂解法制備質(zhì)粒的各種溶液的作用及提取中可能出現(xiàn)的問題一、質(zhì)粒提取三種溶液的作用：為了方便理解，這里羅列一下堿法質(zhì)粒抽提用到三種溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸鉀 / 2 M 醋酸。1、溶液I：任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的pH，因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不過的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？說起來不可思議，加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實(shí)

2、對(duì)質(zhì)粒的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響。所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達(dá) 10 mM 的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價(jià)金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實(shí)也沒什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長的時(shí)間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會(huì)迅速被降解，因?yàn)樽罱K溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質(zhì)粒呢？實(shí)話告訴你，只要用等體積的水，或LB培養(yǎng)基來懸浮菌體就可以了。有一點(diǎn)不能

3、忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。2、溶液II：這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。很多人不知道其實(shí)破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實(shí)上NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，碰到了堿都會(huì)幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下），自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒

4、。如果只用SDS當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因?yàn)镾DS也是堿性的，只是弱了點(diǎn)而已。很多人對(duì)NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒有正確理解一些書上的有關(guān)DNA變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細(xì)胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點(diǎn)：第一，時(shí)間不能過長，千萬不要這時(shí)候去接電話，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對(duì)待女孩子一樣），不然基因組DNA也會(huì)斷裂。基因組DNA的斷裂會(huì)帶來麻煩，后面我再詳細(xì)說明。3、溶液III：加入溶液III后就會(huì)有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)

5、。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關(guān)系。如果在溶液II中不加SDS會(huì)怎樣呢，也會(huì)有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來的蛋白質(zhì)。既然SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會(huì)不會(huì)是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會(huì)產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實(shí)是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來

6、，溶液III加入后的沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個(gè)過程不難想象，因?yàn)榛蚪MDNA太長了，長長的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。那么2 M的醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和NaOH，因?yàn)殚L時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷DNA，所以要中和之?；蚪MDNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉淀了

7、。所以堿處理的時(shí)間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會(huì)有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認(rèn)為是溶液III加入后基因組DNA無法快速復(fù)性就被沉淀了，這是天大的誤會(huì)，因?yàn)樽冃缘囊埠脧?fù)性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來是為了溶解細(xì)胞而用的，DNA分子的變性其實(shí)是個(gè)副產(chǎn)物，與它是不是沉淀下來其實(shí)沒有關(guān)系。溶液III加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點(diǎn)。不要以為PDS沉淀的形成就能將所有的蛋白質(zhì)沉淀了，其實(shí)還有很多蛋白質(zhì)不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提，然后進(jìn)行酒精沉淀才能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒D

8、NA，不然時(shí)間一長就會(huì)因?yàn)榛烊氲腄Nase而發(fā)生降解。這里用25/24/1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的，這里做個(gè)全面的介紹。酚（Phenol）對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用遠(yuǎn)大于氯仿，按道理應(yīng)該用酚來最大程度將蛋白質(zhì)抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氰酸胍），離心后酚相會(huì)跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點(diǎn)，酚與水有很大的互溶性，如果單獨(dú)用酚抽提后會(huì)有大量的酚溶解到水相中，而酚會(huì)抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)），因此如果單獨(dú)用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合

9、液進(jìn)行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時(shí)就會(huì)被除干凈而不必?fù)?dān)心酶切等反應(yīng)不能正常進(jìn)行。至于異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。二、質(zhì)粒提取常見問題解析1、涂布棒在酒精蘸一下，然后燒一下，能不能保證把所用的菌燒死？參考見解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即時(shí)殺菌。蘸了酒精后再燒一小會(huì)，燒的是酒精而不是涂布棒。建議涂布棒還是干燒較長時(shí)間后，冷卻了再涂。同時(shí)作多個(gè)轉(zhuǎn)化時(shí)，應(yīng)用幾個(gè)涂布棒免得交叉污染。2、原先測序鑒定沒有問題的細(xì)菌，37搖菌后發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒大小或序列出現(xiàn)異常?參考見解：這種情況出現(xiàn)的幾率較小，常出現(xiàn)在較大質(zhì)?；虮容^特殊的序列中

10、。解決辦法：（1）、 降低培養(yǎng)溫度，在2025下培養(yǎng)，或室溫培養(yǎng)可明顯減少發(fā)生概率。（2）、 使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重組酶，如rec類等，使得質(zhì)粒復(fù)制更加穩(wěn)定。（3）、 質(zhì)粒抽提有一個(gè)酶切不完全的原因就是溶液中的NaOH濃度過高造成的，請(qǐng)大家注意一下！3、未提出質(zhì)?；蛸|(zhì)粒得率較低，如何解決？參考見解：（1）、 大腸桿菌老化：涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。（2）、 質(zhì)?？截悢?shù)低：由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。  （3）、 菌體中無質(zhì)粒：有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可

11、能造成質(zhì)粒丟失。例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長期保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。（4）、 堿裂解不充分：使用過多菌體培養(yǎng)液，會(huì)導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液的用量。對(duì)低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時(shí)可加大菌體用量并加倍使用溶液，可以有助于增加質(zhì)粒提取量和提高質(zhì)粒質(zhì)量。（5）、 溶液使用不當(dāng)：溶液2和3在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。（6）、 吸附柱過載：不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請(qǐng)分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB或2×YT，菌液體積必須減少；若質(zhì)

12、粒是非常高的拷貝數(shù)或宿主菌具有很高的生長率，則需減少LB培養(yǎng)液體積。（7）、 質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時(shí)) ：洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長溶解時(shí)間。（8）、 乙醇?xì)埩簦浩匆合礈旌髴?yīng)離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。（9）、 洗脫液加入位置不正確：洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì)完全覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率。（10）、 洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過低可能導(dǎo)致洗

13、脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60后使用，有利于提高洗脫效率。（11）、 洗脫體積太?。合疵擉w積對(duì)回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。（12）、 洗脫時(shí)間過短：洗脫時(shí)間對(duì)回收率也會(huì)有一定影響。洗脫時(shí)放置1min可達(dá)到較好的效果。4、細(xì)菌離心加入溶液I蝸旋振蕩后，發(fā)現(xiàn)菌體呈絮狀不均勻或呈細(xì)砂狀？參考見解：（1）、 很可能是細(xì)菌發(fā)生溶菌，可減少培養(yǎng)時(shí)間或者試試平板培養(yǎng)，質(zhì)粒提取前用PBS將菌落洗下，相較來說固體培養(yǎng)基上細(xì)菌生長的要好一些。（2）、 質(zhì)粒抽提過程很大程度上是受細(xì)菌生長情況決定的，剛活化的菌比負(fù)80保存菌種

14、所培養(yǎng)出來的菌液狀態(tài)好，保存久的菌株可能會(huì)造成質(zhì)粒濃度低，質(zhì)粒丟失等不明原因。（3）、 判斷生長的菌液是否正常，可以用肉眼觀察，在光線明亮處搖蕩新鮮培養(yǎng)液，如果發(fā)現(xiàn)菌液呈漂絮狀，情況很好。如果發(fā)現(xiàn)呈泥水狀，即看不到絮狀，只是感覺很渾濁，則可能提不出好的質(zhì)粒，或者沒有質(zhì)粒。（4）、 菌液不宜生長太濃，搖床速度不宜過高。達(dá)到OD600 1.5就可以了，（尤其是對(duì)于試劑盒提取要注意）另外如果只是簡單的酶切驗(yàn)證根本無需酚氯仿抽提（安全考慮，慎重），只要溶液I/ II /III比例恰當(dāng)，轉(zhuǎn)管過程仔細(xì)吸取不會(huì)有太多雜志。5為什么加了溶液后，菌體沒有逐漸由混濁變澄清？提出來的條帶幾乎沒有，但是RNA很亮（沒

15、加RNA酶）？ 溶液主要就是NaOH，如果菌液沒有由混濁變澄清，參考見解： （1）、 可能是因?yàn)槿芤簝?chǔ)存不當(dāng)，或?qū)掖尾僮鳑]有及時(shí)蓋好溶液瓶蓋，導(dǎo)致其吸收空氣中的CO2失效。RNA在菌體中量較多，相對(duì)少量的菌體裂解，可有較DNA明顯的條帶。（2）、 可能是菌量大，加溶液后，菌體并不能完全裂解，所以沒有變清，這也會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒產(chǎn)率低下（3）、 可能是質(zhì)粒的拷貝數(shù)不高，質(zhì)粒產(chǎn)率不高如果是使用自己配的試劑，建議做中提或大提；或者買試劑盒提用自己配的試劑，不加RNA酶，最后RNA是很亮的，要去除干凈就要用比較好的酶。（4）、 如果不是試劑的原因，可能是質(zhì)粒表達(dá)的過程中使膜蛋白變化（數(shù)量變多），很難使用堿裂解

16、法，可以嘗試用其他比較劇烈的方法(比如高溫或者低溫研磨等),然后使用一般的發(fā)放。（5）、 可能質(zhì)粒隨乙醇一起倒掉了。6、加入溶液II后，菌液仍然呈渾濁狀態(tài)，或者混濁度沒有明顯的改變？參考見解：（1）、 問題可能是發(fā)生在溶液II上。首先看看10SDS是否是澄清的？NaOH是否是有效的？如果使用的是試劑盒，也要首先確認(rèn)溶液II是否澄清沒有沉淀？（2）、 可能是細(xì)菌濃度很高，適當(dāng)調(diào)整增加溶液I/II/III的體積。（3）、 可能是“雜菌”污染，如果菌液生長異?？欤陀锌赡鼙浑s菌污染。這種情況一般表現(xiàn)為和目的菌有相同的抗性，生長速度異常，能夠提出質(zhì)粒，跑膠的條帶也異常的亮，但產(chǎn)物不是自己想要的質(zhì)粒，要

17、特別注意一下。抽提DNA去除蛋白質(zhì)時(shí)，為什么要是酚/氯仿混合使用？怎樣使用酚與氯仿較好？參考見解：酚與氯仿都是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。   作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約1015的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯

18、仿與水不相混溶，不會(huì)帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時(shí)一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時(shí)，將酚與氯仿混合（1:1）使用。7、呈粉紅色的酚可否使用？如何保存酚不被空氣氧化？參考見解：保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧化而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以使用。為了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羥基喹琳至終濃度為0.1。8-羥基喹琳是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris pH8.0水溶液飽和后的酚，最好分

19、裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子為宜，如有可能，可充氮?dú)夥乐古c空氣接觸而被氧化。平時(shí)保存在4或20冰箱中，使用時(shí)，打開蓋子吸取后迅速加蓋，這樣可使酚不變質(zhì)，可用數(shù)月。8、為什么用酚與氯仿抽提DNA時(shí)，還要加少量的異戊醇？參考見解：在抽提DNA時(shí)，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時(shí)在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，可以降低抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時(shí)異

20、戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。9、加入酚/仿抽提，離心后在水相和有機(jī)相間沒有出現(xiàn)變性蛋白相層，在隨后的乙醇沉淀步驟中卻出現(xiàn)大量的半透明沉淀，溶解后發(fā)現(xiàn)蛋白濃度很高？乙醇沉淀時(shí)，較純的質(zhì)粒沉淀是白色的（PEG純化的沉淀是透明的肉眼不易發(fā)現(xiàn)），如沉淀是半透明的凝膠狀，則應(yīng)是蛋白含量高。參考見解：首先看看平衡酚是否已被氧化？pH是否是8.0？其次檢測溶液III反應(yīng)完成后的離心上清pH是否在8.0左右？有時(shí)由于溶液III配置的問題，會(huì)出現(xiàn)溶液III反應(yīng)后離心的上清pH與8.0偏差較大的現(xiàn)象，這會(huì)降低平衡酚抽提蛋白抽的有效性，pH偏差過大也會(huì)導(dǎo)致水相和平衡

21、酚互溶。10、使用酚仿抽提方法，質(zhì)粒的純度很好，但酶切不能完全切開?參考見解：（1）、 確認(rèn)酶的有效性。（2）、 平衡酚是否被氧化（正常是黃色，而氧化后是棕色的）。（3）、 是否不小心吸入了痕量的酚。（4）、 乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分（殘留的鹽類會(huì)影響酶切）。（5）、 乙醇漂洗后是否完全干燥（殘留的乙醇會(huì)影響酶切）。11、堿裂解法提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定時(shí)，看到的三條帶分別是什么？參考見解：堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA， 得到的三條帶是以電泳速度的快慢排序的，分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即沒有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過度

22、振蕩，會(huì)有第四條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。12、提取質(zhì)粒中RNA沒有去除 ？可能是RNase失效或效率不高。參考見解：（1）、 更換RNase A，并保證其儲(chǔ)存條件是正確的（2）、 手工提取質(zhì)粒的，可單獨(dú)增加一步去除RNA的步驟 ，溶液III反應(yīng)后，在離心的上清中加RNase，室溫下去除RNA 10min30min（需要保證RNase A是經(jīng)過失活DNase的），同時(shí)較高溫度（如50）會(huì)更加快速完全的去除RNA，經(jīng)驗(yàn)所得經(jīng)過高溫處理的質(zhì)粒質(zhì)量不是很高。13、提取的質(zhì)粒電泳后，為連續(xù)的一片火箭狀？參考見解：（1）、 質(zhì)粒如果鹽離子多，會(huì)有

23、走膠變形的現(xiàn)象， 如果提到的質(zhì)粒不夠純，會(huì)有電泳條帶不平齊的現(xiàn)象。（2）、 當(dāng)電壓太大時(shí)，容易出現(xiàn)火箭狀，而降解應(yīng)該是彌散狀。（3）、 可能是宿主菌影響的，質(zhì)粒抽提好后，用酚-氯仿處理一下再酶切，若有改善，則為宿主菌影響。轉(zhuǎn)化到其它宿主菌再切 。（4）、 NaOH的濃度過高，會(huì)出現(xiàn)火箭狀的結(jié)果。14、用堿裂解法提取質(zhì)粒，裂解5分鐘，沒有用酚 / 氯仿抽提，最后用滅菌水溶解質(zhì)粒DNA15min。雙酶切后跑膠一條帶都沒有，原因是什么？參考見解：（1）、 溶解時(shí)間稍微短了點(diǎn)，但是根據(jù)各個(gè)實(shí)驗(yàn)室RNase不同，這個(gè)條件是不同的。在溶解的過程要渦旋處理促進(jìn)溶解。（2）、 確認(rèn)一下酶切過程中是不是有DNA

24、酶的污染，比如酶切體系的Buffer或者是水，特別是水中；其次是酶切體系的問題；建議再把提取的產(chǎn)物用70%酒精重新洗滌一遍，也可以用酚 / 氯仿重新抽提一下。（3）、 也可能在用乙醇洗時(shí)把質(zhì)粒倒掉了。（4）、 沒有用RNase消化，不要用放久的 RNase否則會(huì)有DNA酶的污染；（5）、 在沒有進(jìn)行酶切時(shí),把所提的質(zhì)粒跑一下核酸電泳看看,如果是提核酸的問題那這一步電泳結(jié)果應(yīng)該沒有大于三千的條帶,這樣可以先排除核酸提取的問題. 若是沒有酶切時(shí)間過長等其他問題的話可以那可以檢查一下所用的溶解DNA的溶液是否有DNAse污染的問題，建議將超純水換成TE。15、用堿裂解法提取的質(zhì)粒,取3ul轉(zhuǎn)化感受態(tài)

25、大腸桿菌涂amp抗性平板，卻出現(xiàn)陽性克隆較少（含綠色熒光蛋白，陽性克隆應(yīng)該顯綠色，在紫外燈下非常明顯，就幾十個(gè)菌落）大部分菌落不發(fā)綠，這些菌落比發(fā)綠的菌落小一些的現(xiàn)象，為什么？參考見解：（1）、 做一次陰性對(duì)照,拿空白菌涂布在含amp的平板上,如生長,說明amp過期,一般這種情況不多見。一般粉末狀的amp不容易失效,如果amp有效的話,可以配制遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)的濃度,如果細(xì)菌耐藥的話,也能生長良好,如不耐藥,則放置數(shù)天仍不見細(xì)菌生長。（2）、 拿陰性和陽性的細(xì)菌各取數(shù)個(gè)放于高濃度的amp液體培養(yǎng)基中,如能生長,說明空白菌中帶有耐藥菌,建議換菌. （3）、 提質(zhì)粒的菌受污染了，重新劃線挑單克隆。16、

26、培養(yǎng)基、抗生素、質(zhì)粒提取都沒有問題，而細(xì)菌菌液提取不到質(zhì)粒？參考見解：如果是氨芐抗性的，有可能是質(zhì)粒丟失造成的。主要是培養(yǎng)時(shí)間較長，導(dǎo)致培養(yǎng)基中的beta-內(nèi)酰胺酶過多，作用時(shí)間過長，同時(shí)培養(yǎng)基pH值降低，氨芐青霉素失活，從而使無質(zhì)粒的菌株大量增殖。解決的辦法：可以添加葡萄糖，縮短培養(yǎng)時(shí)間，改用羧芐青霉素。17、為什么用無水乙醇沉淀DNA？用無水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67左右。因而也可改用95乙醇來替代無水乙醇（因?yàn)闊o水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95乙醇昂貴）。但是加95的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時(shí)，就會(huì)影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時(shí)可用95乙醇代替無水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置1530分鐘即可。18、在用乙醇沉淀DNA時(shí)，為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達(dá)0.10.25mol/L？在pH為8左右的溶液中，