菌產(chǎn)品的微生物檢測微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)

1、非無菌產(chǎn)品微生物檢測：微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)1. 簡介這個實(shí)驗(yàn)敘述了從今以后在有氧條件下嗜溫性細(xì)菌和真菌生長的定量計(jì)數(shù)要求。設(shè)計(jì)這個實(shí)驗(yàn)旨在確定藥物或制劑是否符合已建立的微生物質(zhì)量要求規(guī)范。當(dāng)用作上述目的時，可參考下面的說明，包括所取樣品的量及以結(jié)果的解釋。該方法不適用于將微生物作為有效成分的產(chǎn)品?？梢赃\(yùn)用包括自動化方法在內(nèi)的替代微生物方法。但要求已被證明其等價于藥典方法。2. 通用方法在擬定的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，擬定的條件旨在避免待測產(chǎn)品的外在微生物污染。采取的避免污染的措施必須不影響任何測試中需要披露的微生物。 如果待測產(chǎn)品具有抗菌活性，盡可能取消或者解除這個活性。如果是用滅活劑，則它的效用和毒性情況

2、必須說明。3. 計(jì)數(shù)方法按照規(guī)定使用膜過濾法或者平板計(jì)數(shù)法。最可能數(shù)目法（MPN）是微生物計(jì)數(shù)法中精密度最差的方法。然而，對于特定的低生物負(fù)荷的產(chǎn)品組，可能是最適宜的方法。 方法的選擇是基于如產(chǎn)品屬性，微生物限度要求等因素進(jìn)行選擇的。 選擇的方法必須進(jìn)行大量的樣品檢測來判斷是否符合規(guī)范。并建立其方法的適用性。4. 促生長實(shí)驗(yàn)，計(jì)數(shù)方法的適用性和陰性對照4-1. 總則需建立有樣品進(jìn)行試驗(yàn)的條件下微生物測試的性能狀況。檢驗(yàn)條件改變或樣品改變時，因影響其測量結(jié)果，則應(yīng)確定其適用性。4-2. 試驗(yàn)菌株制備用標(biāo)準(zhǔn)的、穩(wěn)定的試驗(yàn)菌株懸浮液或者將它們按以下步驟制備。因使用種子批培養(yǎng)保留技術(shù)（種子批技術(shù)），則

3、用于接種的可用的微生物從原始的第一代開始繼代培養(yǎng)不能超過5代。且按照.-1表所示將每一批細(xì)菌和真菌等試驗(yàn)菌株進(jìn)行獨(dú)立培養(yǎng)。 來制備實(shí)驗(yàn)所用的菌懸液。對于曲霉孢子菌懸液，可以將0.05%的聚三梨醇酯80加入到緩沖溶液中。且應(yīng)在2小時或2-8條件下24小時內(nèi)應(yīng)用。稀釋曲霉或者枯草桿菌的新鮮營養(yǎng)細(xì)胞懸浮液得到穩(wěn)定的孢子懸浮液，然后取適宜體積的孢子懸浮液用于試驗(yàn)接種。這個穩(wěn)定的孢子懸浮液可在2-8的條件下，驗(yàn)證時間內(nèi)保存。4-3. 陰性對照為了驗(yàn)證試驗(yàn)條件，使用選擇的稀釋劑代替供試品進(jìn)行試驗(yàn)，它不能有微生物生長。第5部分的產(chǎn)品檢測中也要有陰性對照。如果陰性對照失敗，應(yīng)進(jìn)行調(diào)查。4-4. 培養(yǎng)基的促生長

4、測試每一批制備好的培養(yǎng)基，和由脫水制備或者按成分制備每一批培養(yǎng)基。按表.-1所示，在酪蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基和酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基中接種少量微生物菌種（不超過100個菌落形成單位），且每一種菌都單獨(dú)使用培養(yǎng)基。在沙氏-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上接種菌種少量微生物菌種（不超過100個菌落形成單位），每一種菌都單獨(dú)使用培養(yǎng)基。按1所示的條件下培養(yǎng)。對于固體培養(yǎng)基，獲得的生長結(jié)果不得超過由標(biāo)準(zhǔn)接種而來的計(jì)算值的兩倍范圍。對新制備的菌種，微生物的生長狀況應(yīng)與以前測試過的、經(jīng)批準(zhǔn)的培養(yǎng)基的微生物作比較。對于液體培養(yǎng)基，其與以前測試過的、經(jīng)批準(zhǔn)的培養(yǎng)基比較有清晰可見的微生物生長，那么液體培養(yǎng)基被認(rèn)為是可試用的。表.-

5、1試驗(yàn)菌的制備及應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)菌株的制備促生長有樣品的情況下，微生物計(jì)數(shù)方法的適用性總需氧微生物計(jì)數(shù)總酵母菌和霉菌的計(jì)數(shù)總需氧微生物計(jì)數(shù)總酵母菌和霉菌的計(jì)數(shù)金黃色葡萄球菌ATCC6538NCIMB9518CIP4.83NBRC13276酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基或酪蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基30-3518-24h酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基和酪蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基100CFU30-353天酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基100CFU30-35 3天 綠膿假單胞菌ATCC9027NCIMB8626CIP82.118 NBRC13275酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基或酪蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基30-3518-24h酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基和酪

6、蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基100CFU30-353天酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基100CFU30-35 3天 枯草芽孢桿菌ATCC6633NCIMB8054CIP52.62NBRC3134酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基或酪蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基30-3518-24h酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基和酪蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基100CFU30-353天酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基100CFU30-35 3天 白色念珠菌ATCC10231NCPF3179IP48.72NBRC1594沙氏-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20-252-3天酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基100CFU30-355天 沙氏-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基100C

7、FU20-255天酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基100CFU30-355天沙氏-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基100CFU20-255天黑曲霉ATCC16404IMI149007IP1431.83NBRC9455 沙氏-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄培養(yǎng)基糖瓊脂培養(yǎng)基20-255-7天，或直到獲得好的芽孢酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基100CFU30-355天 沙氏-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基100CFU20-255天 酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基100CFU30-355天沙氏-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基100CFU20-255天4-5. 樣品存在時計(jì)數(shù)方法的適用性4-5-1. 樣品的制備根據(jù)被測樣品的物理特征選用合適的樣品制

8、備方法。如果以下描述的方法都不行，則應(yīng)開發(fā)替代方法。 水溶性產(chǎn)品 用pH7.0的氯化鈉蛋白胨緩沖溶液或pH7.2的磷酸鹽緩沖溶液或酪蛋白大豆 肉湯培養(yǎng)基溶解、稀釋測產(chǎn)品（通常1：10的稀釋）。必要時，調(diào)節(jié)pH在6-8.之間；用同一稀釋劑稀釋成更高倍數(shù)的稀釋液。水不溶性非脂肪產(chǎn)品 用pH7.0的氯化鈉蛋白胨緩沖溶液或pH7.2的磷酸鹽緩沖溶液或酪蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基獎產(chǎn)品制成懸浮液（通常1：10）?？蓪⒈砻婊钚詣┤?g/ml的聚三梨醇酯80加入到懸浮液中以增強(qiáng)可濕性差的的物質(zhì)的懸浮。必要時，調(diào)節(jié)pH在6-8.之間；用同一稀釋劑稀釋成更高倍數(shù)的稀釋液。脂肪性產(chǎn)品 將其溶解于十四酸異丙酯中，無菌膜過濾

9、或者將產(chǎn)品與最少需要量的無菌聚三梨醇酯80或者其他非抑制性無菌的表面活性劑混合。必要時，加熱至不超過40，對于特殊產(chǎn)品不超過45。小心的混勻，必要的時候在水浴鍋中保溫。加入足量的預(yù)先溫?zé)岬南♂寗┲瞥稍籍a(chǎn)品1：10的稀釋溶液。混勻后，應(yīng)盡量縮短其保溫時間以免形成乳膠。用含有合適濃度的聚三梨醇酯80或其他非抑制性無菌的表面活性劑得相同稀釋劑稀釋成更高倍數(shù)的懸浮液。液體或固體噴霧劑 無菌條件下，轉(zhuǎn)移產(chǎn)品至薄膜過濾器中或者其它滅菌容器中待進(jìn)一步取樣。取容器中所有的量或規(guī)定量用于檢測。貼劑 撕開貼劑的保護(hù)層（露出內(nèi)襯），膠貼面朝上放置在滅菌玻璃或者塑料托盤上。用無菌多孔材料如無菌紗布蓋住膠貼面，以防止

10、貼劑黏在一起，然后將貼劑放入含有滅活劑如聚三梨醇酯80或卵磷脂的稀釋劑中，劇烈振蕩至少30min。4-5-2接種和稀釋將一定體積的微生物懸浮液加入到按照（4-5-1）準(zhǔn)備好的樣品和對照溶液（不含檢測樣品）中，其結(jié)果不能超過100個的菌落形成單位。且其微生物懸浮液的接種體積不能超過稀釋樣品體積的1%。為了測定樣品中的微生物回收率，應(yīng)用準(zhǔn)備好的樣品的最低稀釋劑進(jìn)行試驗(yàn)，如果其產(chǎn)品具有抗菌活性或溶解性差時，應(yīng)找其他可可用的方法替代。如果不能避免樣品中微生物出現(xiàn)生長抑制時，則微生物的懸浮液應(yīng)在中和、稀釋或過濾后加入。4-5.3中和/除去抗菌活性按4-5-2中稀釋樣品和按4-5-4中方法培養(yǎng)樣品得到的微

11、生物數(shù)與對照組中的微生物數(shù)作比較。如果生長被抑制（減少超過2倍量），那么對計(jì)數(shù)試驗(yàn)進(jìn)行修改并對結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。修改的步驟可能包括：例如，（1）增加稀釋劑或培養(yǎng)基的用量，（2）在稀釋劑中加入指定的或者通用中和劑，（3）薄膜過濾（4）將上述措施相結(jié)合。中和劑 中和劑可用于中和藥物的抗菌活性（表.-2），它們可以在所選擇的稀釋劑或培養(yǎng)基滅菌前加入。使用時，應(yīng)通過有中和劑無樣品的空白對照來表明其中和劑對微生物的效力和毒力。表.-2-常見的干擾物質(zhì)的中和劑干擾物質(zhì)可用的中和方法戊二醛，有機(jī)汞制劑 亞硫酸氫鈉（亞硫酸氫鈉）酚醛樹脂，醇，醛，山梨酸酯稀釋醛甘氨酸季銨化合物（QACs），羥基苯甲酸，2

12、-雙胍類卵磷脂季銨化合物（QACs），碘，羥基苯甲酸 聚山梨酯汞制劑 巰基醋酸酯汞制劑，鹵素，醛 硫代硫酸鹽EDTA（乙二胺四醋酸鹽）鎂離子或者鈣離子如果找不到適宜的中和方法，則可將分離微生物失敗的原因歸因于產(chǎn)品的微生物活性。此信息表示產(chǎn)品不太可能被特定種類微生物污染。然而，產(chǎn)品可能只抑制某些特定的微生物，而不抑制另外的、沒有包括在試驗(yàn)菌株內(nèi)的微生物或者不具有代表性的微生物。然后，用最高稀釋倍數(shù)的樣品做微生物的生長和具體驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)兼容性測試。4-5-4. 有樣品時微生物的回收率對于每一個列出的微生物都必須進(jìn)行單獨(dú)的試驗(yàn)。只計(jì)算試驗(yàn)菌的生長數(shù)量。4-5-4-1. 薄膜

13、過濾使用有標(biāo)稱孔徑不超過0.45m的膜進(jìn)行過濾。應(yīng)選擇細(xì)菌截留率不受被測樣品的組分影響的過濾材料。對列出的每一種微生物都個使用一個過濾器。按照4-5-1至4-5-3所準(zhǔn)備的樣品取適量(一般為產(chǎn)品的1g量，如預(yù)期的cfu較大時，可以取少量)至膜過濾器，用適宜體積的稀釋液沖洗膜過濾器。 對于總需氧菌數(shù)的測定(TAMC)，轉(zhuǎn)移過濾后的膜至酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基平板上。為了測定酵母菌和霉菌的總數(shù)（TYMC)，轉(zhuǎn)移過濾后的膜至沙氏-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。根據(jù)表.-2.定義的接種上述培養(yǎng)基，進(jìn)行計(jì)數(shù)。4-5-4.2. 平板計(jì)數(shù)法平板計(jì)數(shù)法要求每種培養(yǎng)基至少配制兩個以上，結(jié)果用平均計(jì)數(shù)法計(jì)算。4-5-4-2

14、-1. 倒板法用直徑為9厘米的培養(yǎng)皿，加入1ml的根據(jù)4-5-1至4-5-3制備的樣品和1520ml的酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基或者沙氏-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基的溫度不超過45。如果使用較大的培養(yǎng)皿，可以適當(dāng)增加培養(yǎng)基的用量。對于每一個表.-1中列示的微生物，至少制備兩個培養(yǎng)皿。并1.定義培養(yǎng)。每個培養(yǎng)基按算術(shù)平均計(jì)數(shù)，并計(jì)算最初接種的cfu值。4-5-4-2-2. 表面擴(kuò)散法 在直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，加入15-20ml 45左右的酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基或者沙氏-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，固化。假如使用較大的培養(yǎng)皿，可以適當(dāng)增加培養(yǎng)基的用量。在層流空氣流柜或者培養(yǎng)箱內(nèi)干燥平板，對于在表.-1中所列示的每

15、種微生物至少制2個平板。然后取不少于0.1ml按4-5-1至4-5-3描述準(zhǔn)備的樣品到培養(yǎng)基表面上涂布。按4-5-4-2-1所描述的培養(yǎng)和計(jì)數(shù)。4-5-4-3最可能數(shù)目法（MPN） MPN的精密度和準(zhǔn)確度小于膜過濾法和平板計(jì)數(shù)法。特別是模具枚舉法得到的不可靠的結(jié)果。由于這個原因MPN法是好氧微生物測定的保留方法，在沒有其它方法可用的情況下可用。假如使用的方法是合理的，按照如下所述進(jìn)行。 準(zhǔn)備一系列至少3個順序的產(chǎn)品的十倍稀釋液如4-5-1至4-5-3所述。從每個稀釋水平，3等分1g或者1ml用于接種3個裝有9-10ml大豆酪蛋白消化肉湯培養(yǎng)基的試管。如果有必要，表面活性劑例如吐溫80或者抗生素

16、抑制劑可能被加入到介質(zhì)中。因此，假如3個水平的稀釋液被制備，要接種9個試管。 所有試管的接種在30-35下進(jìn)行不超過3天的時間。如果結(jié)果讀取較為困難或者由于被測產(chǎn)品的性質(zhì)而不確定 ，在同樣的肉湯培養(yǎng)基內(nèi)次培養(yǎng)，或者在大豆酪蛋白消化肉湯中相同溫度下培養(yǎng)1-2天，使用此結(jié)果。從.-4.測定每g或者每ml被測產(chǎn)品中最有可能的微生物數(shù)量。4-6. 結(jié)果和詮釋當(dāng)驗(yàn)證膜過濾法或者平板計(jì)數(shù)法的適用性時，其任意一個試驗(yàn)菌株的試驗(yàn)結(jié)果的平均值應(yīng)在按4-5-2定義制得的無樣品參與的對照組獲得的數(shù)值的2倍范圍內(nèi)。當(dāng)驗(yàn)證MPN法時，其接種所得的計(jì)算值應(yīng)在對照組測試結(jié)果的95%的置信區(qū)間內(nèi)。 如果所用方法中的任意一種或

17、多種微生物測得結(jié)果不符合上述準(zhǔn)則，則選擇與標(biāo)準(zhǔn)最接近的方法和實(shí)驗(yàn)條件用于產(chǎn)品檢測。5產(chǎn)品檢測5-1檢驗(yàn)量除非另有規(guī)定，取10g或者10ml的產(chǎn)品用于檢測。對于液體或者固體噴霧劑，抽取10個容器的樣品。對于貼劑，取樣10貼。如果滿足以下條件的活性物質(zhì)可以減少其檢驗(yàn)量：每個劑量（如：片劑，膠囊劑，注射劑）的總量不超過1mg或每g/每ml樣品中所含的劑量少于1mg。在這樣的情況下，檢驗(yàn)量不少于十份單位劑量或產(chǎn)品的10g或10ml。對于取樣量被限制或產(chǎn)品的批量極?。ㄈ缧∮?000ml或1000g）的活性物質(zhì)，其檢驗(yàn)量應(yīng)為批量的1%，除非有特別規(guī)定或已修改且經(jīng)批準(zhǔn)時可以減少檢驗(yàn)量。對于一批總量少于200

18、的產(chǎn)品（例如用于臨床試驗(yàn)），檢驗(yàn)量可減少到2個單位。若批量少于100時，可減少到1個單位。 從大批量或者可用制劑容器內(nèi)隨機(jī)取樣。為了獲得要求的檢驗(yàn)量，可混合足量的小批量藥品 再取樣。5-2樣品檢查5-2-1膜過濾法 使用可以轉(zhuǎn)移過濾膜至培養(yǎng)基的過濾裝置。按照第4部分所描述的方法制備樣品，然后取適量樣品至過濾器內(nèi)，每份樣品制兩張過濾膜，立即過濾。用適宜的方法沖洗濾器。 對于總需氧菌數(shù)（TAMC）的測定，轉(zhuǎn)移其中一張濾膜至酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基的表面。對于酵母菌和霉菌總數(shù)（TYMC）的測定，轉(zhuǎn)移另一個濾膜至沙氏-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的表面。將酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基在30-35條件下培養(yǎng)3-5天，將沙氏-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基在20-25條件下培養(yǎng)5-7天。計(jì)算每g或者每ml產(chǎn)品的cfu值。 當(dāng)測定透皮貼劑，將4-5-1中所制備的樣取10%的體積進(jìn)行過濾，且每一個樣制2張濾膜。一張放在酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行總需氧菌計(jì)數(shù)，另一張放在沙氏-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行總酵母菌和霉菌計(jì)數(shù)。 5-2-2平板計(jì)數(shù)法5-2-2-1倒平板法使用第4部分的方法制備樣品。每一個稀釋級樣品的每種培養(yǎng)基至少制備兩個培養(yǎng)皿。將酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基在30-35條件下培養(yǎng)3-5天。沙氏-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基在20-25條件下培養(yǎng)5-7天。