標(biāo)本采集和保存技術(shù)要求一覽表

1、附件1標(biāo)本采集和保存技術(shù)要求一覽表病人類型種類采集時(shí)間和頻次采集方法保存條件備注所有病例全血1、入院后立即采集；2、間隔35天采集一次；3、逝前采集一次。真空采血管無菌采集血清分裝2管血塊單獨(dú)保存低溫保存，-70最佳，-20亦可血塊用于細(xì)菌檢測(cè)抗凝血入院后立即采集真空抗凝采血管無菌采集最好在使用抗生素前采血同上傳染病所要求如5天內(nèi)能送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，可010保存，如否，可低溫冷凍保存咽拭子入院后立即采集塑料桿拭子擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭分別浸入含3ml病毒或細(xì)菌采樣液的螺口塑料管中同上詳見表下注。漱口液入院后立即采集10ml不含抗菌素的采樣液漱口，無菌螺口塑料管收集同上詳見表下注。尿標(biāo)本1

2、、入院后立即采集；2、臨床檢查采集標(biāo)本時(shí)留樣無菌管采集中段尿標(biāo)本10ml同上詳見表下注。便標(biāo)本1、入院后立即采集；2、臨床檢查采集標(biāo)本時(shí)留樣無菌管采集糞便標(biāo)本同上詳見表下注。下呼吸道標(biāo)本氣管插管時(shí)采集采集呼吸道抽取物或分泌物同上詳見表下注。痰液有痰液時(shí)采集同上詳見表下注。心臟穿刺組織死亡后未做尸檢時(shí)采集同上詳見表下注肺穿刺組織心包液胸腔積液尸檢標(biāo)本2份同上，1份福爾馬林充分固定后，4保存應(yīng)盡量多采集各器官組織標(biāo)本，例如肺組織、胸腔積液、心臟組織、心包液、肝、腎、脾組織，如果有神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)，還需采集腦組織以及其它可能受累的器官標(biāo)本有明確 腦膜腦炎或腦炎癥狀病例腦脊液急性期無菌采集同上有出疹癥狀病

3、例皰疹液有皰疹時(shí)無菌采集同上注：1、以上標(biāo)本分別用于開展病毒和細(xì)菌等病原體檢測(cè)2、采集咽拭子標(biāo)本、下呼吸道標(biāo)本、痰液、心臟穿刺組織、肺穿刺組織、心包液、胸腔積液使用的樣品保存液應(yīng)不含抗生素或不用樣品保存液，現(xiàn)場(chǎng)無菌接種，并將接種后剩余的標(biāo)本立即冷凍（-20以下）保存。漱口液、尿標(biāo)本和糞便標(biāo)本現(xiàn)場(chǎng)無菌接種，并將接種后剩余的標(biāo)本立即冷凍（-20以下）保存。附件2手足口病例標(biāo)本送檢登記表患者姓名 性別 出生日期 年 月 日（陰/陽(yáng)歷）家長(zhǎng)姓名 家庭住址 市 鄉(xiāng)（鎮(zhèn)、街辦） 村（居） 號(hào)家庭電話 發(fā)病日期 年 月 日初診日期 年 月 日；初診單位 （省級(jí)/市級(jí)/縣級(jí)/鄉(xiāng)級(jí)/村級(jí)） 初步診斷：_住院治療

4、（是/否），如住院，則：入院日期 年 月 日，入院診斷 出院日期 年 月 日，出院診斷 病程 天預(yù)后：痊愈/好轉(zhuǎn)/未愈/死亡/其他 ；后遺癥（有， ；無）標(biāo)本統(tǒng)一編號(hào)：標(biāo)本類型采樣日期送檢日期是否冷藏標(biāo)本量收樣日期檢測(cè)日期報(bào)告日期實(shí)驗(yàn)結(jié)果RDHEp-2中和抗體滴度咽拭子血清急性期恢復(fù)期糞便標(biāo)本腦脊液皰疹液注：送檢標(biāo)本編號(hào)為“標(biāo)本統(tǒng)一編號(hào)+標(biāo)本類型”，其中“T”為咽拭子代碼， “S1”為急性期血清代碼，“S2” 為恢復(fù)期血清代碼，“F”為糞便標(biāo)本代碼，“CSF”為腦脊液代碼，“H”為皰疹液代碼。采樣人： 采樣單位： 送樣人： 附件3手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方案（試行）為規(guī)范手足口病的標(biāo)本采集、運(yùn)送及實(shí)

5、驗(yàn)室檢測(cè)操作程序，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性，從而為手足口病的明確診斷和相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供可靠的依據(jù)，特制定本方案。手足口病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)原則和程序手足口病的診斷一般是通過采集適當(dāng)?shù)呐R床標(biāo)本后進(jìn)行病毒分離和病毒鑒定，如果沒有采到合適的臨床標(biāo)本，或無法進(jìn)行病毒分離，也可以通過血清學(xué)檢測(cè)（如中和實(shí)驗(yàn)）來檢測(cè)血清中的中和抗體，或直接從臨床標(biāo)本中檢測(cè)病毒的核酸來診斷（見下圖：手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷流程圖）。一般是由省級(jí)病毒實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒的分離，爆發(fā)疫情范圍較大時(shí)，國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室也可以提供技術(shù)支持。病毒分離成功后，送至國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行鑒定或復(fù)核，同時(shí)對(duì)全國(guó)手足口病的病原進(jìn)行病毒學(xué)監(jiān)測(cè)。國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室接到標(biāo)本后，在30日

6、內(nèi)將結(jié)果反饋給省級(jí)實(shí)驗(yàn)室。很多血清型的腸道病毒能引起手足口病，不同細(xì)胞系對(duì)不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同時(shí)期腸道病毒的流行株也不同。通常用于腸道病毒分離的細(xì)胞系為RD細(xì)胞（對(duì)CA16和EV71敏感）、HEp-2細(xì)胞（對(duì)某些柯薩奇B組病毒敏感）等，聯(lián)合使用上述兩種或更多細(xì)胞（如Vero細(xì)胞）有助于分離到更多的腸道病毒。使用血清型特異性的中和抗血清進(jìn)行的中和實(shí)驗(yàn)是腸道病毒鑒定的基本方法，如果使用了適當(dāng)?shù)目寡?，?shí)驗(yàn)結(jié)果是比較可靠的。因?yàn)槟c道病毒包括若干個(gè)血清型，通常使用組合抗血清進(jìn)行鑒定，有些組合抗血清已經(jīng)商品化。當(dāng)無法進(jìn)行病毒分離或得不到適用于病毒分離用的標(biāo)本時(shí)，血清學(xué)檢測(cè)可以為腸道病毒的

7、感染提供一個(gè)間接的證據(jù)。一般用急性期血清與恢復(fù)期血清的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，抗體滴度呈四倍或以上增高證明有急性感染。但是，無癥狀的腸道病毒感染也是常見的，所以對(duì)檢測(cè)結(jié)果的解釋要慎重一些。為了提高檢測(cè)速度，也為了輔助中和實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行毒株鑒定，最近很多實(shí)驗(yàn)室都使用分子生物學(xué)方法。目前，用分子生物學(xué)方法對(duì)腸道病毒進(jìn)行定型還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，而且要根據(jù)檢測(cè)目的選擇使用適用的方法。檢測(cè)結(jié)果的評(píng)價(jià)如果從臨床標(biāo)本中分離到腸道病毒，尤其是分離自腦脊液、皰疹液，那么很可能該病毒就是病因病原。當(dāng)無法進(jìn)行病毒分離或未分離到病毒時(shí)，血清學(xué)診斷方法可以作為病毒感染的間接證據(jù)。對(duì)于難以分離到的腸道病毒，分子生物學(xué)方法如RT-PC

8、R是很有用的。腸道病毒有時(shí)引起無癥狀感染，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果的實(shí)際意義應(yīng)結(jié)合臨床過程和流行病學(xué)資料進(jìn)行解釋。實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)手、足、口等部位典型皮疹即可作出HFMD臨床診斷，流行病學(xué)接觸史有助于診斷，臨床診斷病例中符合下列之一，即為實(shí)驗(yàn)室診斷病例：1，患者的糞便標(biāo)本、咽拭子標(biāo)本中病毒分離陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于對(duì)照人群；2，腸道病毒型特異性中和抗體滴度1256；或恢復(fù)期血清中腸道病毒型特異性中和抗體較急性期有4倍或4倍以上增高；3，在病變組織中如皰疹液或腦脊液中分離到病毒；4，自患者血清、皰疹液或腦脊液等標(biāo)本中檢測(cè)到病原體核酸。一、標(biāo)本采集對(duì)象標(biāo)本采集對(duì)象是暴發(fā)疫情出現(xiàn)時(shí)手足口病的臨床診斷病例和病例發(fā)病所在社

9、區(qū)（村）的臨近無病例的社區(qū)（村）或托幼機(jī)構(gòu)的5歲以下的兒童（作為健康對(duì)照人群）。用于病毒分離的標(biāo)本包括糞便、咽拭子和皰疹液，如果患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，可以采集腦脊液標(biāo)本。對(duì)于血清學(xué)診斷，需要在急性期和恢復(fù)期采集雙份血清標(biāo)本。臨床標(biāo)本在運(yùn)輸和貯存過程中要避免反復(fù)凍融，如果不能確保-20的條件，應(yīng)該在08運(yùn)輸和保存。標(biāo)本應(yīng)冷凍運(yùn)輸，運(yùn)輸時(shí)要附有必要的信息，如標(biāo)本編號(hào)、發(fā)病日期和標(biāo)本采集日期。二、標(biāo)本種類及采集、運(yùn)送（一）糞便標(biāo)本采集病人發(fā)病7日內(nèi)的糞便標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。糞便標(biāo)本采集量58g/份，采集后立即放入無菌采便管內(nèi)，4暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，20以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存

10、于70冰箱。（二）咽拭子標(biāo)本采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有35ml保存液（維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥。4暫存立即（12h內(nèi)）送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，20以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于70冰箱。（三）血清標(biāo)本采集急性期（發(fā)病03d）和恢復(fù)期（發(fā)病1430d）雙份配對(duì)血清用于抗體檢測(cè)。靜脈采集35ml全血，置于真空無菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清置于20以下冰箱中冷凍保存。（四）皰疹液在手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷中，從皰疹液中分離到病

11、毒具有很高的診斷價(jià)值，可同時(shí)采集多個(gè)皰疹作為一份標(biāo)本。先用75%的酒精對(duì)皰疹周圍的皮膚進(jìn)行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有35ml保存液（維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封。所采集標(biāo)本4暫存立即（12h內(nèi)）送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，20以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于70冰箱。（五）腦脊液標(biāo)本出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例，要采集腦脊液標(biāo)本，進(jìn)行病原和抗體檢測(cè)，從腦脊液中分離病毒也具有很高的診斷價(jià)值。采集時(shí)間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3天內(nèi)，采集量為1.02.0ml。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)

12、室，20以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于70冰箱。（六）病例密切接觸者的標(biāo)本采集選擇典型病例所在的托幼機(jī)構(gòu)、或所在村，以新發(fā)病例密切接觸者為采樣對(duì)象，采集單份糞便和血清標(biāo)本。（七）健康對(duì)照的標(biāo)本采集選擇患兒發(fā)病所在社區(qū)（村）的臨近無病例的社區(qū)（村）或托幼機(jī)構(gòu)。采集5歲以下的兒童單份糞便和血清標(biāo)本。三、標(biāo)本采集注意事項(xiàng)在手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷中，從皰疹液或腦脊液中分離病毒具有很高的診斷價(jià)值，但對(duì)于不同血清型的腸道病毒，腦脊液中的病毒分離率是大不相同的。用于采集咽拭子的無菌拭子要放在適當(dāng)?shù)谋４嬉褐校缇S持液或生理鹽水，以防干燥。用于分子生物學(xué)診斷的標(biāo)本采集與病毒分離標(biāo)本的采集方法一樣。為了保證

13、檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性，標(biāo)本應(yīng)在病例發(fā)病后盡早采集，盡快檢測(cè)。不能立即檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)冷凍保存。對(duì)于血清學(xué)診斷，急性期血清應(yīng)該在發(fā)病后盡早采集，恢復(fù)期血清在發(fā)病兩周后采集。四、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程（一）病毒分離1.試劑配置（1）細(xì)胞的生長(zhǎng)液、維持液的配制見下表生長(zhǎng)液（GM）維持液（MM）Eagles液(MEM)86.5ml92.5mlL-谷氨酰胺200mM1.0ml1.0ml胎牛血清10.0ml2.0ml7.5%NaHCO3溶液2.5ml3.5mlP.S溶液*(青霉素及鏈霉素)1.0ml1.0ml（2）糞便標(biāo)本的處理液完全PBS液中加入PS溶液，終濃度為青霉素500單位/ml，鏈霉素為500g/

14、ml。2病毒分離細(xì)胞系許多細(xì)胞系可支持人腸道病毒（如EV71、CA16）生長(zhǎng)。對(duì)于檢測(cè)手足口病的病原來說，建議所有懷疑含EV71、CA16的標(biāo)本均需接種到以下兩種細(xì)胞系：Ø RD細(xì)胞，來源于人橫紋肌肉瘤細(xì)胞。Ø HEp-2細(xì)胞，來源于人喉癌上皮細(xì)胞。3標(biāo)本的處理（1）糞便標(biāo)本的處理操作步驟：1.1在離心管上標(biāo)記標(biāo)本號(hào)；1.2每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；1.3在生物安全柜中將每一份糞便標(biāo)本取大約2g加入標(biāo)記好的離心管中（確保離心管上的標(biāo)號(hào)與原始標(biāo)本的標(biāo)號(hào)一致）；1.4剩余的原始標(biāo)本最好留在原容器中，凍存于20；1.5確保擰緊離心管，用機(jī)械震蕩器劇烈震蕩

15、20min；1.6在確保離心機(jī)的蓋子蓋好和離心桶密封的情況下，用冷凍離心機(jī)在1500g條件下離心20min；1.7在生物安全柜中將每一份標(biāo)本的上清液分別吸入2個(gè)有外螺旋蓋的凍存管中（如果上清液不清澈，應(yīng)再用氯仿處理一次）；1.8一管糞便懸液凍存于20作為備份，另一管存于48以備接種。（2）皰疹液標(biāo)本的處理皰疹液標(biāo)本通常直接用于病毒分離。（3）腦脊液標(biāo)本的處理腦脊液標(biāo)本通常直接用于病毒分離。（4）咽拭子標(biāo)本的處理咽拭子要在標(biāo)本運(yùn)輸（保存）液中充分?jǐn)噭?dòng)（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細(xì)胞等，然后在4條件下，10000 rpm離心20min，用上清接種到細(xì)胞上，如果發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌污染，

16、須用濾器過濾除菌。4接種和觀察（病毒分離）（1）顯微鏡下觀察單層細(xì)胞，以確保細(xì)胞是健康的。一個(gè)健康的單層細(xì)胞會(huì)在傳代后3d左右形成；（2）倒掉生長(zhǎng)液（GM），換上11.2ml的維持液（MM）；（3）每一份標(biāo)本需要同時(shí)接種2支RD細(xì)胞和2支HEp-2細(xì)胞，正確標(biāo)記每支細(xì)胞培養(yǎng)管（包括標(biāo)本的編號(hào)、日期、傳代數(shù)）；（4）每一種細(xì)胞至少標(biāo)記一管作為陰性對(duì)照；（5）每支試管接種0.2ml的標(biāo)本懸液，培養(yǎng)溫度要求36（對(duì)于AHC標(biāo)本的病毒分離，尤其是EV70的分離培養(yǎng)，強(qiáng)烈建議降低培養(yǎng)溫度，一般可為3435）；（6）使用倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞培養(yǎng)管，以觀察有特征性的腸道病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）的出現(xiàn)（

17、如細(xì)胞變圓，折光增強(qiáng)并脫離管壁等）；（7）記錄接種管和對(duì)照管細(xì)胞所發(fā)生的變化至少一周，記錄CPE（1+4+）、提示細(xì)胞受毒性反應(yīng)、老化或污染的影響而發(fā)生的變化（1+，<25%; 2+, 25%50%; 3+, 50%75%; 4+, 75%100%）；（8）如果有特征性的腸道病毒CPE出現(xiàn)，要如實(shí)記錄，并觀察直到75%的細(xì)胞發(fā)生變化（3+ CPE），然后儲(chǔ)藏在20以備二次傳代。同一病例的二次傳代的病毒分離物可以放到一起用于進(jìn)一步的鑒定；（9）第1代培養(yǎng)見可疑細(xì)胞病變時(shí)繼續(xù)傳代，待細(xì)胞病變穩(wěn)定出現(xiàn)后20或70凍存；（10）一代陽(yáng)性分離物再傳二代，如果又有明顯的CPE出現(xiàn)，將病毒保存在20冰

18、箱（二代病毒）。因二代病毒滴度高于用一代病毒，所以選用二代病毒進(jìn)行鑒定。（11）如果7d之后沒有CPE出現(xiàn)，那么盲傳1代繼續(xù)觀察7d。（注意：同一病例標(biāo)本的細(xì)胞培養(yǎng)物不能混在一起再傳代，例如：不同細(xì)胞的培養(yǎng)物應(yīng)單獨(dú)傳代）；（12）盲傳2代后，仍然沒有出現(xiàn)CPE的，則判定為陰性；（13）注意：如果接種后24h內(nèi)出現(xiàn)CPE，很可能是標(biāo)本中的非特異性成分導(dǎo)致的毒性反應(yīng)。取100l陽(yáng)性分離物傳二代，繼續(xù)觀察；或者在接種標(biāo)本吸咐1h后用維持液清洗細(xì)胞層，可能會(huì)降低毒性反應(yīng)。（14）幾個(gè)概念： A：毒性反應(yīng)：如果在接種后12d內(nèi)細(xì)胞快速地調(diào)亡，這可能是由于標(biāo)本中含有毒性物質(zhì)而導(dǎo)致的非特異性毒性反應(yīng)。這些已

19、接種標(biāo)本的試管應(yīng)在20凍存，融化后取0.2ml接種到同一類型細(xì)胞中（此時(shí)是第二代）。如果又出現(xiàn)了毒性反應(yīng)，那么應(yīng)該取原始標(biāo)本用PBS稀釋10倍，再次接種到同種細(xì)胞中。這時(shí)應(yīng)被認(rèn)為是第一代。 B：微生物污染：由于細(xì)菌污染而造成培養(yǎng)液混濁或細(xì)胞死亡經(jīng)常使病毒造成的CPE無法確定或根本無法出現(xiàn)。重新取原始標(biāo)本，用氯仿處理，按上述步驟重新接種到新鮮細(xì)胞上。 C：盲傳：有時(shí)一周之后傳代細(xì)胞會(huì)老化，甚至細(xì)胞對(duì)照也出現(xiàn)了病變。這時(shí)已接種標(biāo)本的試管應(yīng)在20凍存，融化后取0.2ml接種到同一類型的新鮮單層細(xì)胞中，再觀察710d。如果盲傳兩代后仍然沒有產(chǎn)生CPE，那么認(rèn)為這個(gè)標(biāo)本是陰性的。5病毒分離結(jié)果解釋：RD

20、細(xì)胞支持HFMD的主要病原體CA16和EV71的復(fù)制，CA16和EV71均能在RD細(xì)胞培養(yǎng)中引起特殊的腸道病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、分散、胞漿內(nèi)顆粒增加，最后細(xì)胞自管壁脫落。但相同滴度的CA16和EV71在RD細(xì)胞中生長(zhǎng)的速度不同，EV71的生長(zhǎng)速度要快于CA16，表現(xiàn)為EV71感染RD細(xì)胞后出現(xiàn)CPE的時(shí)間比CA16早，EV71接種細(xì)胞后出現(xiàn)CPE很快，但CA16一般要經(jīng)過2次以上傳代才出現(xiàn)明顯的CPE。若在使用RD細(xì)胞分離的同時(shí)再增加HEp-2細(xì)胞，可提高腸道病毒的分離率（分離出其它可能致HFMD的病原體，如一些柯薩奇B組病毒）。但CA16和EV71在HEp-2細(xì)胞中均

21、不繁殖。從HFMD患兒的腦脊液、血液、皰疹液等臨床標(biāo)本中分離出病毒有診斷價(jià)值，但單從咽拭子或糞便中分離到病毒不能確診。從有上述臨床癥狀群患者的咽拭子或糞便中重復(fù)分離到同一型病毒，且從周圍患同樣疾病者中也檢出相同的病毒，且病毒分離率遠(yuǎn)高于正常人群，則有診斷的參考價(jià)值。（二）測(cè)定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度比較患者急性期血清與恢復(fù)期血清中和抗體滴度，可作為腸道病毒感染的血清學(xué)診斷方法，最常用的是中和實(shí)驗(yàn)，即用微量板法測(cè)定抗體滴度，是目前人腸道病毒抗體檢測(cè)的最常用方法，該方法精確且具有型特異性。作為腸道病毒感染的診斷方法之一，可以測(cè)定血清（或腦脊液）中腸道病毒中和抗體的滴度，通常用急性期血清與恢復(fù)期

22、血清滴度進(jìn)行比較，抗體滴度4倍或4倍以上增高證明病毒感染。但是，不明顯的腸道病毒感染（隱性感染）也很常見，所以在評(píng)估檢測(cè)結(jié)果時(shí)就要小心一些。在中和實(shí)驗(yàn)中，一般要用人腸道病毒參考毒株（即原型株，EV71原型株為BrCr株，CA16原型株為G-10株），有時(shí)同時(shí)（或單獨(dú)）使用臨床分離株會(huì)有助于得到更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。使用對(duì)腸道病毒敏感的細(xì)胞，如RD細(xì)胞。用病毒（血清）稀釋液（下面液體配制中的C液，可用維持液代替）稀釋血清和制備病毒懸液，因?yàn)槭怯貌《緛泶_定血清（CSF）中抗體的滴度，所以要使用參考病毒（原型株），但有時(shí)使用所分離到的毒株（臨床分離株）有助于得到更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，當(dāng)然，分離株的滴度（10

23、0 CCID50/0.05ml）要事先測(cè)定。中和實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)原理：病毒感染敏感靶細(xì)胞后，引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），特異性中和抗體與病毒結(jié)合后，可使病毒顆粒失去感染性，抑制CPE的出現(xiàn)。1液體配制A液：血清處理液：（100ml中含下列液體） MEM85ml 3% L-谷氨酰胺1ml 7.5%碳酸氫鈉2ml 胎牛血清2ml 青、鏈霉素（各10000U/ml）10mlB液：細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液：（按生長(zhǎng)液配方配制，100ml中含下列液體） MEM85ml 3% L-谷氨酰胺1ml 7.5%碳酸氫鈉2ml HEPES1ml 胎牛血清10ml 青、鏈霉素（各10000U/ml）1ml C液：

24、病毒（血清）稀釋液：（按維持液配方配制，100ml中含下列液體） MEM93ml 3% L-谷氨酰胺1ml 7.5%碳酸氫鈉2ml HEPES1ml 胎牛血清2ml 青、鏈霉素（各10000U/ml）1ml2攻擊病毒CCID50滴定和滴度梯度制備（1）將增殖后的病毒懸液凍融3次，然后在4、12000rpm條件下離心10min，取上清液分裝于2支凍存管中，每管1.5ml，一般每管應(yīng)在一次試驗(yàn)中用完，有剩余者應(yīng)廢棄；（2）加Eagle液10倍系列稀釋為10-1至10-8病毒液，各加入細(xì)胞板內(nèi)，每孔50l，每稀釋度4孔細(xì)胞；（3）每孔加細(xì)胞懸液50l，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照（50l稀釋液+50l細(xì)胞懸液），

25、 36培養(yǎng)7d，觀察細(xì)胞病變；（4）按Behrens-Kärber公式計(jì)算出分離病毒株的CCID50；log CCID50 = L-d (S -0.5 )，其中：L = 實(shí)驗(yàn)中使用的最低稀釋度的log值；d = 稀釋梯度的log值； S = 終判時(shí)陽(yáng)性部分的總和（即出現(xiàn)CPE的細(xì)胞孔所占的比例之和）。（5）正式試驗(yàn)前應(yīng)先滴定攻擊病毒23次，取其平均值，求出每0.05ml中含100 CCID50的病毒載量；（6）按照計(jì)算好的稀釋比例配制攻擊病毒，求出試驗(yàn)所需的病毒總量（即100 CCID50/0.05ml）；（7）取3支小試管，每只加病毒稀釋液（液體配制中的C液）0.9ml；（8）用帶

26、濾芯的吸尖（ART吸尖）吸0.1ml已經(jīng)稀釋好的攻擊病毒液（即10 CCID50/0.05ml）到第一支小試管中，換另一支ART吸尖，輕輕并徹底地混勻，避免產(chǎn)生大量氣溶膠，按照此方法依次稀釋至1 CCID50/0.05ml和0.1 CCID50/0.05ml。3稀釋血清（1）發(fā)病13d內(nèi)采取患者急性期血清，發(fā)病后24周采取恢復(fù)期血清，分別20凍存?zhèn)錂z。（2）取無菌小試管若干支（每份血清使用一支）置試管架上，每管加血清處理液（上面液體配制中的A液）0.3ml，加待測(cè)血清0.1ml，蓋緊塞子，震搖混勻，放4冰箱過夜，即為1：4稀釋血清。次日56、30min滅活。（3）打開獨(dú)立無菌包裝48孔組織培養(yǎng)

27、板，縱向使用，每孔加血清稀釋液（上面液體配制中的C液）0.3ml，每份血清使用一排，每排4孔。使用移液器取處理過的血清0.1ml加入第一孔（即為1：16），吹吸810次，吸0.1ml加入第二孔（即為1：64），依次至1：1024，血清稀釋的過程中不必?fù)Q吸尖。即每份血清標(biāo)本進(jìn)行4倍倍比稀釋，即1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024。（4）每份血清標(biāo)本的每個(gè)稀釋度都要平行做兩孔。4病毒中和抗體測(cè)定的操作步驟：（1）取一塊96孔板橫向使用，每塊板可以做8份（4對(duì)）待測(cè)血清，版面設(shè)計(jì)如下圖所示。A1-A2孔（B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H

28、2）中每孔加入1:1024稀釋度的待測(cè)血清0.05ml，不必?fù)Q吸尖，在A3-A4孔（B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4、H3-H4）中每孔加入1:256稀釋度的待測(cè)血清0.05ml，A5-A6孔（B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6）中每孔加入1:64稀釋度的待測(cè)血清0.05ml，A7-A8孔（B7-B8、C7-C8、D7-D8、E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8）中每孔加入1:16稀釋度的待測(cè)血清0.05ml，A9-A10孔（B9-B10、C9-C10、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G

29、9-G10、H9-H10）中每孔加入1:4稀釋度的待測(cè)血清0.05ml，A11-A12孔（B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12、F11-F12、G11-G12、H11-H12）為每份待測(cè)血清對(duì)照孔，每孔中補(bǔ)加稀釋液0.05ml；（2）上述孔中分別加入病毒0.05ml（病毒滴度事先已經(jīng)稀釋為100 CCID50/0.05ml）；（3）蓋好蓋子后用微量板混勻器混勻，放入36 CO2孵箱中孵育2h；（4）另取一塊96孔板縱向使用，做100 CCID50/0.05ml病毒滴度的核實(shí)（每次實(shí)驗(yàn)都必須做）。每孔先加病毒稀釋液（試劑配制中的C液）0.05ml，然后從0.1 CCID

30、50/0.05ml加起，每孔0.05ml，每個(gè)稀釋度8孔，不必更換吸尖，一直加至100 CCID50/0.05ml；同時(shí)留出4孔做為細(xì)胞對(duì)照孔，每孔加入0.1ml病毒稀釋液，然后放入4冰箱中暫存；（5）在孵育期間，用消化液消化細(xì)胞，準(zhǔn)備細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液的濃度為2×105個(gè)/ml，每塊96孔板至少需要準(zhǔn)備10ml；（6）孵育結(jié)束后每個(gè)待測(cè)血清孔、血清對(duì)照孔（待檢標(biāo)本板）和病毒回滴孔和細(xì)胞對(duì)照孔（病毒回滴板）分別加入0.1ml細(xì)胞懸液，然后用微量板混勻器混勻，放入36 CO2孵箱中孵育培養(yǎng)；（7）使用倒置顯微鏡每天觀察CPE，并記錄病毒滴定結(jié)果，以不產(chǎn)生細(xì)胞病變的血清最高稀釋度的倒數(shù)為

31、終點(diǎn)效價(jià)。當(dāng)100 CCID50/0.05ml的病毒對(duì)照孔出現(xiàn)完全病變時(shí)，判定最終結(jié)果（約57d）；（8）注意：如果病毒對(duì)照結(jié)果（病毒回滴）不在32320 CCID50/0.05ml的范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)無效，就要重復(fù)實(shí)驗(yàn)。5結(jié)果判定：當(dāng)最高稀釋度血清的2孔中有1孔出現(xiàn)細(xì)胞病變，另一孔不出現(xiàn)細(xì)胞病變，該稀釋度的倒數(shù)計(jì)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)；當(dāng)高稀釋度2孔完全病變，相鄰低稀釋度2孔完全不病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)；當(dāng)兩個(gè)相鄰稀釋度血清均出現(xiàn)1孔細(xì)胞病變，另1孔不出現(xiàn)細(xì)胞病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)。對(duì)于HFMD的雙份血清中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果來說，如

32、果恢復(fù)期血清較急性期血清EV71或CA16中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高即可確診；如果恢復(fù)期血清較急性期血清其它腸道病毒中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高可證實(shí)該腸道病毒感染，是否為病因需要其它相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)；如果單份血清中和抗體滴度大于1:256也有診斷意義，血清中和抗體滴度為1:128判定為可疑陽(yáng)性。（三）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）1RNA提取可使用商業(yè)化試劑盒來提取RNA，如使用QIAGEN Viral RNA Mini Extraction Kit（CAT：52904）從臨床標(biāo)本或病毒分離培養(yǎng)物中提取病毒RNA；（1），向一支1.5ml離心管中加入560l的AVL緩沖液（含

33、Carrier RNA）；（2），再向這支離心管中加入140l臨床標(biāo)本或病毒分離培養(yǎng)物，充分混勻至少15s；（3），室溫下（1525）放置10min，然后瞬時(shí)離心；（4），加入560l純酒精，充分混勻至少15s，瞬時(shí)離心；（5），小心加入約630l的混合溶液至QIAamp柱中（試劑盒附帶），將QIAamp柱套在收集管上，然后8000 rpm離心5s，使液體通過濾膜；（6），棄去收集管中的液體，重復(fù)第6步驟；（7），棄去收集管中的液體，小心加入750l的AW1緩沖液，8000 rpm離心5s，使液體通過濾膜；（8），棄去收集管中的液體，小心加入750l的AW2緩沖液，8000 rpm離心5s，使

34、液體通過濾膜；（9），棄去收集管中的液體，13000 rpm再次離心1min；（10），將QIAamp柱放入一支干凈的1.5ml的離心管中；（11），向膜上加入40l的EB緩沖液，然后室溫下靜置25min；（12），在離心機(jī)中以8000 rpm的速度離心1min，離心下來的液體即為所需的核酸溶液。2RT-PCR擴(kuò)增（1）引物序列合成1）人腸道病毒（包括EV71、CA16）核酸檢測(cè)通用引物序列：PE2（上游）：5- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3PE1（下游）：5- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -32）EV71核

35、酸檢測(cè)引物序列：EV71-S（上游）：5- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3EV71-A（下游）：5- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -33）CA16核酸檢測(cè)引物序列：Cox A16-S（上游）：5-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3Cox A16-A（下游）；5-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3（2）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1）在PCR記錄紙（實(shí)驗(yàn)記錄紙）上記錄本次實(shí)驗(yàn)操作者姓名，實(shí)驗(yàn)日期，所鑒定標(biāo)本的名稱以及標(biāo)本的順序，與PCR儀排列的順序一致。2）標(biāo)記好加標(biāo)本和對(duì)照的PCR管（陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照和試劑對(duì)照）。

36、A：陽(yáng)性對(duì)照：無感染性的對(duì)照RNA。B：細(xì)胞對(duì)照：使用未接種病毒的細(xì)胞懸液，最好使用與擴(kuò)增病毒所用的細(xì)胞類型與代數(shù)相同的細(xì)胞。每一次實(shí)驗(yàn)設(shè)2個(gè)細(xì)胞對(duì)照。C：試劑對(duì)照：用去離子水代替標(biāo)本。（3）RT-PCR擴(kuò)增 1）在冰面上融化病毒標(biāo)本和各種PCR試劑； 2）配下列試劑主溶液：10×PCR Buffer························

37、···········································5.0ldNTPs（2.5mM each）···

38、83;·················································

39、83;·2.0l上游引物（0.1g/l）··············································

40、;···········1.0l下游引物（0.1g/l）····································&

41、#183;····················1.0lRNA酶抑制劑（RNasin,40U/l）·························

42、·············0.5lTaq DNA聚合酶（5U/l）·································

43、3;···············0.5lAMV逆轉(zhuǎn)錄酶（10U/l）·······························

44、3;··················1.0l模板RNA······························&

45、#183;···········································3.0lRNase Free dH2O···

46、··················································

47、······36.0l 50.0l3）在PCR儀上進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)步驟如下：42························45min95············&#

48、183;···········3min95························20s45············

49、83;···········25s ×32個(gè)循環(huán) 72························30s72··········

50、3;·············10min 4························Soak3電泳分析1）將已經(jīng)聚合的3%的瓊脂糖凝膠放在電泳裝置上；2）在帕拉膜（Parafilm）上加上6 × 電泳載樣緩沖液（

51、每個(gè)反應(yīng)需1l）。再加上5l的PCR反應(yīng)產(chǎn)物與之混合；3）將電泳緩沖液倒在電泳裝置中，用吸尖將樣品與載樣緩沖液的混合溶液加到孔中；4）蓋上蓋子，接通電源，以10V/cm電壓（恒定電壓）電泳，大約3540min，直到溴酚藍(lán)跑到凝膠的底部的時(shí)候，停止電泳；5）將膠取出，并注意保持凝膠的方向；6）在1g/ml的溴化乙錠溶液中染色15min，注意：溴化乙錠溶液是有毒、致畸、并且致腫瘤的物質(zhì)，操作時(shí)要加小心，并戴雙層手套。如果儲(chǔ)存在避光的容器中，溴化乙錠溶液可以重復(fù)使用；7）在蒸餾水中涮一下凝膠；8）在紫外透射儀下觀察PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，并照相作記錄。4結(jié)果解釋通過比較標(biāo)本的PCR產(chǎn)物與陽(yáng)性對(duì)照的PCR

52、產(chǎn)物在凝膠上的位置以及大小來解釋結(jié)果。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果解釋表待檢標(biāo)本RT-PCR結(jié)果鑒定結(jié)果所有引物（）非腸道病毒（NEV）EV（），EV71（），CA16（）非EV71、CA16的其它腸道病毒EV（），EV71（），CA16（）EV71EV（），EV71（），CA16（）CA16五、生物安全根據(jù)2006年1月11日衛(wèi)生部制訂的人間傳染的病原微生物名錄，柯薩奇病毒、?？刹《?、腸道病毒 71型和目前分類未定的其它腸道病毒均屬于危害程度第三類的病原微生物。因此在保證安全的前提下，對(duì)臨床和現(xiàn)場(chǎng)的未知樣本檢測(cè)操作可在生物安全I(xiàn)I級(jí)或以上防護(hù)級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，涉及病毒分離培養(yǎng)的操作，應(yīng)加強(qiáng)個(gè)體防護(hù)和

53、環(huán)境保護(hù)。操作糞便、腦脊液和血液等臨床標(biāo)本時(shí)要特別注意生物安全，要在II級(jí)生物安全柜中進(jìn)行標(biāo)本處理、病毒分離和病毒鑒定，無脊灰疫苗免疫史的人員要進(jìn)行脊灰疫苗免疫。滅活后的血清抗體檢測(cè)與PCR檢測(cè)可在生物安全I(xiàn)級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。所有操作應(yīng)遵守國(guó)家相關(guān)法律法規(guī)。附件4 手足口病個(gè)案調(diào)查表編號(hào)： 調(diào)查單位：_（按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編碼：省編碼市編碼縣編碼病例序號(hào)）一、一般情況患者姓名 性別 出生日期 年 月 日（陰/陽(yáng)歷）職業(yè) 工作單位（就讀學(xué)校或托幼機(jī)構(gòu)） 家長(zhǎng)姓名 家庭住址 市 鄉(xiāng)（鎮(zhèn)、街辦） 村（居） 號(hào)家庭電話： 二、發(fā)病及就診情況1、發(fā)病日期 年 月 日2、初診日期 年 月 日；初診單位 （省級(jí)/市級(jí)/縣級(jí)/鄉(xiāng)級(jí)/村級(jí)） 初步診斷：_3、住院治療（是/否），如住院，則：所住醫(yī)院_ ，入院日期 年 月 日，入院診斷 ，出院日期 年 月 日，出院診斷 ，病程 天。4、預(yù)后：痊愈/好轉(zhuǎn)/未愈/死亡/其他 ；后遺癥（有， ；無）三、臨床情況（一）臨床癥狀 如有請(qǐng)打“”1、發(fā)熱（有， / 無）； 2、皮疹（有，主要部位： / 無）3、口腔炎：口腔