他克莫司對周圍神經(jīng)損傷后脊髓組織中肝細胞生長因子表達的影響

1、他克莫司對周圍神經(jīng)損傷后脊髓組織中肝細胞生長因子表達的影響 作者：潘峰，陳安民，陶鳳華，陳家祿，陶海鷹，彭昊，祝成亮【摘要】 目的 探討他克莫司對大鼠周圍神經(jīng)損傷后脊髓組織中肝細胞生長因子 (HGF) 表達的影響。方法成年雄性大鼠 50 只，隨機分為正常組、損傷組和治療組，后兩組行雙側(cè)坐骨神經(jīng)切斷。術(shù)后治療組頸后皮下注射他克莫司 (1 mg/kg)，損傷組注射生理鹽水。術(shù)后不同時間點取 L46脊髓，應(yīng)用 Western blotting 技術(shù)及免疫熒光標記對脊髓組織中HGF 的表達變化進行定量和定位檢測。結(jié)果HGF 在脊髓灰質(zhì)前角、中間帶和后角的各類神經(jīng)元中均有表達；損傷組與正常組大鼠脊髓組織

2、中 HGF 的表達之間無顯著性差異 (P>0.05)，治療組大鼠脊髓組織中 HGF 的表達在術(shù)后 7、14 d 時明顯高于損傷組 (P< 0.05)。結(jié)論 (1) 周圍神經(jīng)損傷本身并不能使脊髓組織中 HGF 的表達上調(diào)；(2) 他克莫司能誘導(dǎo)周圍神經(jīng)損傷后內(nèi)源性 HGF 的高表達，從而保護相應(yīng)神經(jīng)元，促進軸突生長。 【關(guān)鍵詞】 周圍神經(jīng)； 創(chuàng)傷與損傷； 肝細胞生長因子； 他克莫司 Abstract：ObjectiveTo explore the effect of tacrolimus on expression of hepatocyte growth facto

3、r (HGF) in rat spinal cord following peripheral nerve injury.MethodFifty male rats were randomly divided into normal group,injury group and treatment group.Models of peripheral nerve injury were established by transection of bilateral sciatic nerve at 0.5 cm distal to piriform muscle.Then treatment

4、group received subcutaneous injection of tacrolimus (1 mg/kg) at the back of the neck,while injury group received 0.9 % saline.The L46 spinal cords were harvested at various time points after surgery.Western blotting and immunofluorescence staining were used to detect the level and position of HGF i

5、n the spinal cord.ResultHGFpositive neurons were located in anterior horn,intermediate zone and posterior horn of gray matter in normal spinal cord.There was no significant difference in the expressions of HGF between injury group and normal group,while the expression of HGF was significantly higher

6、 in treatment group than that in injury group at 7 and 14 days after surgery.ConclusionPeripheral nerve injury does not upregulate the expression of HGF in spinal cord,while tacrolimus can induce high expression of endogenous HGF after injury to protect neurons and promote axonal outgrowth. Key word

7、s：peripheral nerves; wounds and injuries; hepatocyte growth factor; tacrolimus 周圍神經(jīng)損傷可引起相應(yīng)脊髓節(jié)段神經(jīng)元的死亡，嚴重影響了周圍神經(jīng)再生及后期功能恢復(fù)。新型免疫抑制劑他克莫司，已被證實對大鼠坐骨神經(jīng)切斷后的脊髓神經(jīng)元具有保護作用，使其免遭凋亡1，但其機制有待進一步闡明。肝細胞生長因子 (hepatocyte growth factor，HGF) 是最新發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，在腦和脊髓的不同區(qū)域均有表達，具有促進神經(jīng)元存活、加速神經(jīng)再生的作用2。本研究的目的在于明確誘導(dǎo)內(nèi)源性 HGF 的表達上調(diào)是否構(gòu)成周圍

8、神經(jīng)損傷后他克莫司發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用的因素之一。 1 材料與方法 1.1 動物分組與模型制備 成年雄性健康 Wistar 大鼠 50 只 (武漢大學(xué)實驗動物中心提供)，體質(zhì)量 200250 g。隨機分為損傷組和治療組，每組各 20 只，剩余 10 只設(shè)為正常組。損傷組和治療組大鼠行雙側(cè)坐骨神經(jīng)切斷術(shù)：大鼠經(jīng) 1 % 戊巴比妥鈉 30 mg/kg 腹腔內(nèi)麻醉后，取俯臥位，術(shù)區(qū)剪毛、消毒鋪單，無菌條件下行臀部斜行切口，長1.5 cm，在臀肌間隙暴露坐骨神經(jīng)，距梨狀肌下緣 0.5 cm 處切斷坐骨神經(jīng)，近端以 5-0 號線雙重結(jié)扎，遠端切除 1 cm 后埋入股二頭肌中，縫合切口。術(shù)后治療組大

9、鼠頸后皮下注射他克莫司 (1 mg/kg)，損傷組大鼠以相同方法給予生理鹽水，正常組大鼠未作任何處理。動物分籠標記，統(tǒng)一喂養(yǎng)。 1.2 Western blotting 檢測 HGF 的表達 分別于術(shù)后 1、7、14 d 切取損傷組和治療組大鼠脊髓組織，每組每個時間點隨機取 5 只。大鼠經(jīng)腹腔內(nèi)麻醉后，暴露雙側(cè)坐骨神經(jīng)，循神經(jīng)根逆行追蹤暴露與之相連的 L46節(jié)段脊髓，切取該段脊髓組織，加入裂解液冰上孵育并徹底勻漿，12 000 r/min 離心 20 min 后留取上清，考馬斯亮藍 G-250 法測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，全濕式電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5 % 脫脂奶粉封閉

10、1 h 后加入兔抗鼠 HGF 多克隆抗體 (武漢博士德生物工程公司)，內(nèi)參為兔抗鼠肌動蛋白，4 孵育過夜。TBST 溶液 (含 0.1 % Tween20 的 TBS) 洗滌 10 min × 3 次，加入辣根過氧化物酶 (HRP) 標記的羊抗兔 IgG (北京中山生物公司)，37 孵育 60 min，TBST 洗膜 10 min × 3 次，二氨基聯(lián)苯胺 (DAB) 顯色，結(jié)果以目的條帶灰度值與同一樣本肌動蛋白灰度值的比率來表示。正常組隨機取 5 只大鼠于第一個時間點與其余兩組一起取材檢測。 1.3 免疫熒光染色檢測 HGF 的分布 1.3.1 標本取材及準備 以 Wes

11、tern blotting 結(jié)果得出的 HGF 表達高峰時間確定免疫熒光染色觀察時間點為術(shù)后 7 d，每組取 5 只大鼠。大鼠經(jīng)腹腔內(nèi)麻醉后開胸，將 11 號針頭從左心室插至升主動脈，右心房開一小口。先以生理鹽水 250 ml 行主動脈灌注，待流出液體變清后再以 4 % 多聚甲醛灌注 30 min。同法切取 L46節(jié)段脊髓，置于 4 % 多聚甲醛后固定 2 h，繼而轉(zhuǎn)入含 20 % 蔗糖的磷酸緩沖液 (PBS) 中 4 冰箱內(nèi)過夜，至標本沉底。20 恒冷箱切片機中連續(xù)橫向切片，片厚 10 m。 1.3.2 免疫熒光染色 從各組術(shù)后 7 d 每只大鼠的冰凍切片中隨機抽取，4 % 多聚甲醛 37

12、固定 15 min，PBS 漂洗 5 min × 3 次，3 % 小牛血清白蛋白 (BSA) 37 封閉 1 h，滴加兔抗鼠 HGF 多克隆抗體 (武漢博士德生物工程公司)，以 PBS 代替一抗作陰性對照，置于濕盒內(nèi) 4 孵育過夜，PBS漂洗后，滴加異硫氰酸四甲基羅丹明 (TRITC) 標記的羊抗兔 IgG (北京中山生物公司)，37 避光孵育 60 min 后 PBS 漂洗 5 min × 3 次，含有防淬滅劑的 50 % 甘油磷酸緩沖液封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。 1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用統(tǒng)計分析軟件 SPSS 12.0 進行處理，計量資料以 ± s 表示，組

13、間比較用單因素方差分析 (OneWay ANOVA)，P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 2 結(jié) 果 2.1 Western blotting 分析 HGF 在正常脊髓中有表達，其 鏈的相對分子質(zhì)量約為 69 000，與理論值相一致 (圖 1)。坐骨神經(jīng)損傷后脊髓組織中 HGF 的表達并未隨時間升高，術(shù)后 1、7、14 d 時的灰度值比值與正常組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)。應(yīng)用他克莫司治療后，相應(yīng)脊髓組織中 HGF 的表達呈明顯時間依賴性升高，術(shù)后 7 d 達峰值，14 d 仍有較明顯表達。治療組的灰度值比值與損傷組、正常組相比在術(shù)后 7、14 d 時

14、差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05，P<0.01)(表 1)。表1 大鼠脊髓組織中 HGF 的表達變化 2.2 免疫熒光染色 在三組大鼠脊髓組織切片中均觀察到免疫熒光染色陽性細胞。在脊髓前角的運動神經(jīng)元內(nèi)有明顯的 HGF 陽性熒光染色，主要分布于神經(jīng)元胞體和部分突起中，在灰質(zhì)中間帶和后角也可見有陽性熒光染色的神經(jīng)元，熒光染色強度由弱至強不等，廣泛分布于灰質(zhì)-層大、中、小各類神經(jīng)元的胞質(zhì)及突起中。正常組大鼠脊髓組織切片顯示，HGF 在正常脊髓中有恒定表達，但坐骨神經(jīng)損傷后 HGF 的表達并無明顯變化，其陽性染色神經(jīng)元的數(shù)目及熒光強度并未增加。應(yīng)用他克莫司治療后 HGF

15、的表達增強，陽性染色神經(jīng)元的數(shù)量多于損傷組 (圖 24)，與 Western blotting 的檢測結(jié)果相一致。圖2 正常大鼠脊髓組織中 HGF 的表達 (免疫熒光染色，×200) 圖3 術(shù)后 7 d，損傷組大鼠脊髓組織中 HGF 的表達 (免疫熒光染色，×200) 圖4 術(shù)后 7 d，治療組大鼠脊髓組織中 HGF 的表達 (免疫熒光染色，×200) 3 討 論 周圍神經(jīng)損傷后的成功再生涉及一系列復(fù)雜的病理生理過程，其中 Fansa 等3將損傷神經(jīng)元胞體的存活列為首要因素。而神經(jīng)元作為一個整體，胞體與軸突之間的聯(lián)系是十分密切的，軸突損傷實質(zhì)上是一種細胞損傷，必然

16、會累及相應(yīng)的神經(jīng)元胞體，而神經(jīng)元的功能狀態(tài)也必將會影響軸突的再生及功能的恢復(fù)。因此，周圍神經(jīng)損傷后再生治療重點已經(jīng)從局部外科修復(fù)，發(fā)展到采用多因子、多因素防止神經(jīng)元胞體、神經(jīng)纖維、效應(yīng)器的變性，來保護損傷神經(jīng)元，促進神經(jīng)再生。臨床廣泛應(yīng)用的免疫抑制劑他克莫司已被證實具有神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用4。在大鼠坐骨神經(jīng)切斷縫合術(shù)后局部應(yīng)用他克莫司緩釋膜片可保護脊髓神經(jīng)元免遭凋亡1。亦有文獻報道，他克莫司在體外可促進背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元軸突的延伸5。目前關(guān)于此種神經(jīng)保護藥物用于周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的研究中，往往關(guān)注的是其在實驗?zāi)Ｐ椭械闹委熜Ч?，而他克莫司若要真正?yīng)用于臨床，尚需要從分子生物學(xué)的角度闡明其作用機制，

17、而明確誘導(dǎo)內(nèi)源性 HGF 的表達上調(diào)是否構(gòu)成周圍神經(jīng)損傷后他克莫司發(fā)揮神經(jīng)保護作用的因素之一則正是本研究意義所在。 HGF是由6.845萬u 的 鏈和3.373萬u 的 鏈組成的異二聚體蛋白，最初被鑒定為一種強大的原代肝細胞的絲裂原，現(xiàn)證實也是一種新的神經(jīng)營養(yǎng)因子，通過自分泌、旁分泌及經(jīng)典的軸突運輸方式與特異性酪氨酸激酶受體 cMet 結(jié)合發(fā)揮其活性，在體內(nèi)和體外對中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的多種神經(jīng)元具有神經(jīng)營養(yǎng)作用6。研究發(fā)現(xiàn) HGF 參與大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的發(fā)育過程，促進軸突生長及神經(jīng)元存活2。在正常生理條件下，HGFcMet 自分泌和/或旁分泌機制為脊髓運動神經(jīng)元提供局部直接的營養(yǎng)支持7。本實驗

18、Western blotting 分析證實，正常脊髓中存在 HGF 的恒定表達，免疫熒光染色則顯示 HGF 主要分布于灰質(zhì) -層神經(jīng)元的胞質(zhì)及突起中，與國外學(xué)者8的報道相符，說明脊髓前角、灰質(zhì)中間帶及后角神經(jīng)元在生理狀態(tài)下均合成 HGF，其營養(yǎng)作用對于維持神經(jīng)元自身存活及行使正常生理功能是必需的。 盡管研究表明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷2或缺血9等病理狀態(tài)下，HGF 在損傷周圍區(qū)域表達上調(diào)，在脊髓損傷后再生和腦組織缺血后修復(fù)過程中起著關(guān)鍵性作用。但本實驗數(shù)據(jù)顯示，損傷組術(shù)后各時間點 HGF 的表達與正常組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，即坐骨神經(jīng)損傷后脊髓組織中 HGF 的合成并未增加。這一結(jié)果與 Hashim

19、oto 等8的報道一致。他們的研究顯示在脊髓和背根神經(jīng)節(jié)均檢測到 HGF mRNA，而坐骨神經(jīng)結(jié)扎并未改變其表達，與作者的實驗結(jié)果相互印證，除說明周圍神經(jīng)損傷對中樞神經(jīng)元 HGF 表達的影響不同于中樞神經(jīng)系統(tǒng)本身的損傷外，也提示：對周圍神經(jīng)的傷害性刺激不足以啟動內(nèi)源性 HGFcMet 系統(tǒng)來挽救損傷神經(jīng)元和防止軸突變性，而是需要通過其他途徑來上調(diào)周圍神經(jīng)損傷后 HGF 的表達。 鑒于神經(jīng)損傷后內(nèi)源性 HGF 的表達匱乏，人們致力于將重組 HGF 蛋白或病毒載體 HGF 基因轉(zhuǎn)移入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，期望外源性 HGF 能對受損神經(jīng)元起到神經(jīng)營養(yǎng)作用。如 Hayashi 等6在成年大鼠脊神經(jīng)根撕脫傷后

20、應(yīng)用重組腺病毒載體編碼的 hHGF 基因轉(zhuǎn)移防止運動神經(jīng)元的死亡。但上述方法由于重組蛋白的半衰期較短及血神經(jīng)屏障的存在，實際治療效果并不盡人意；病毒載體基因轉(zhuǎn)移具有潛在的危險性，如產(chǎn)生免疫應(yīng)答，與病毒感染相關(guān)的各種毒副作用等都限制了其廣泛應(yīng)用，因此尋找新的以促進內(nèi)源性 HGF 合成為靶點的治療策略成為研究熱點。本研究治療組的結(jié)果顯示，神經(jīng)損傷后皮下注射他克莫司可上調(diào)脊髓組織中 HGF 的表達，傷后7 d 達高峰，持續(xù)至傷后 14 d 仍較損傷組有明顯升高，表明他克莫司可有效誘導(dǎo)內(nèi)源性 HGF 的高表達，這可能是周圍神經(jīng)損傷后他克莫司發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用的因素之一。在此，他克莫司充當了促進

21、 HGF 合成的啟動因子，而上調(diào)的 HGF 又可通過自身正反饋機制促進損傷部位 HGF 的合成，與特異性受體結(jié)合發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用，從而保護相應(yīng)神經(jīng)元，誘導(dǎo)近側(cè)殘端或中樞神經(jīng)元軸突再生，重建神經(jīng)環(huán)路；同時 HGF 也是一種高效的血管生成因子，通過軸突運輸?shù)竭_損傷部位，介導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖、分化，促進微血管形成10，為再生過程提供良好的微循環(huán)，這對神經(jīng)再生有著重要的意義。 本研究揭示了坐骨神經(jīng)損傷后內(nèi)源性 HGF 在脊髓組織中的表達、分布及時間變化規(guī)律，并從中樞神經(jīng)元的角度闡明了他克莫司通過 HGF 促進周圍神經(jīng)再生的機制，為臨床應(yīng)用他克莫司治療周圍神經(jīng)損傷進一步的提供了理論依據(jù)。【參考文獻】 1 張

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