使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)的ROS

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)的ROS基本原理：CM-H2DCFDA在細(xì)胞內(nèi)水解成DCFH , DCFH被胞內(nèi)的氧化劑氧化成高熒光強(qiáng)度的DCF，用于檢測(cè)ROS的生成。Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)是非極性的化學(xué)物質(zhì)能自由通透細(xì)胞膜。進(jìn)入細(xì)胞后，被easterase去掉兩個(gè)乙基,形成具有極性的2,7- dichlorodihydrofluorescein(DCFH),保留在細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生H2O2與DCFH反應(yīng),使DCFH形成了2,7 dichlorodihydrofluorescein(DCF)，通過(guò)流式細(xì)胞

2、儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度，即可對(duì)單個(gè)細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞內(nèi)ROS進(jìn)行原位實(shí)時(shí)檢測(cè)，從而根據(jù)熒光強(qiáng)度直接反映細(xì)胞內(nèi)自由基的變化程度。（見(jiàn)下圖）主要試劑：1.PC-12細(xì)胞株2.DCFH-DA粉劑（sigma）3.5 mg溶解于721 ul 100%乙醇中（這時(shí)的濃度為10.0 mM），之后用DMEM培養(yǎng)液稀釋上述溶液10倍，配置成1.0 mM的儲(chǔ)存液。-20避光保存。3.A25-35（終濃度為30uM）4.AP（終濃度為10 uM）5其它如培養(yǎng)細(xì)胞常用試劑（DMEM高糖、胎牛血清、胰酶等），MTT操作方法：（1） 收集細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度至（110）106/mL（2） 分

3、別加入A、A+AP（六孔板），培養(yǎng)24小時(shí)（3） 裝載探針：加入終濃度為10uM的DCFH-DA，37 5 % CO2培養(yǎng)箱中靜置0.5 h，每隔3-5min混勻一下，使探針和細(xì)胞充分作用。（4）用無(wú)血清的培養(yǎng)基或溫暖的PBS液洗滌細(xì)胞3次，去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。（5）收獲各組細(xì)胞，上流失細(xì)胞儀檢測(cè)ROS。激發(fā)光488nm，發(fā)射光525nm（6）實(shí)驗(yàn)分四組：PC-12(空白對(duì)照組)、PC-12+DCFH-DA(探針對(duì)照組)、PC-12+DCFH-DA+A25-35（實(shí)驗(yàn)組）、PC-12+DCFH-DA+A25-35+AP（給藥組）結(jié)果分析：注意事項(xiàng)：（1） 處理過(guò)程絕對(duì)避光（紫外燈能不能開？）（2） 染料與細(xì)胞混合時(shí)間要充分（3） 探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，否則會(huì)導(dǎo)致背景較高（4） 盡量縮短探針裝載后到測(cè)定所用的時(shí)間（刺激時(shí)間除外），以減少各種可能的誤差（5） 細(xì)胞應(yīng)保持良好的活性狀態(tài)。貼壁細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)不應(yīng)超過(guò)瓶底面積的75%，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)其數(shù)目不能超過(guò)5105/mL；貼壁細(xì)胞在消化處理時(shí)要盡量溫和、快速，避免產(chǎn)生過(guò)多的細(xì)胞碎片（6） 使用流式細(xì)胞儀要確保側(cè)面的細(xì)胞分散開（在與染料混合和處理時(shí)）（7）流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞數(shù)目有一定的要求，一般為106，可以使用六孔板（8）雖然一般要求將陰性對(duì)照組細(xì)胞調(diào)節(jié)電壓至陰性置信區(qū)，但如果正常對(duì)照細(xì)胞DCFH