生物反應(yīng)器培養(yǎng)干細胞的研究進展強化1301王慧琳1020613114

1、生化反應(yīng)器在干細胞培養(yǎng)中的研究進展王慧琳 強化1301班 1020613114摘要：干細胞是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞, 在再生醫(yī)學(xué)、藥物篩選及毒理學(xué)等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域呈現(xiàn)出誘人的前景。通過目前的干細胞分離培養(yǎng)技術(shù)可獲得的干細胞數(shù)量極少, 遠遠不能滿足臨床需要, 因此體外大規(guī)模擴增培養(yǎng)干細胞是亟待解決的問題。該文簡述了適用于干細胞培養(yǎng)的各種生物反應(yīng)器的特點, 以及懸浮生物反應(yīng)器體系在不同類型干細胞群中的研究應(yīng)用。關(guān)鍵詞：干細胞; 生物反應(yīng)器; 旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器；間充質(zhì)細胞；神經(jīng)干細胞；微載體干細胞是機體內(nèi)存在的一類未分化的、尚不成熟的特殊細胞, 具有自我更新、增殖及多向分化的潛能,

2、在體外可分離、擴增和冷凍保存, 且能在適當條件下被誘導(dǎo)分化為不同的組織細胞和器官, 具有潛在的再生功能。由于干細胞具有的能夠穩(wěn)定生存增殖并保持多向分化潛能的特性，使其在遺傳性疾病和組織器官移植領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用前景。但是通過目前的干細胞分離培養(yǎng)技術(shù)可獲得的干細胞數(shù)量極少, 遠遠不能滿足臨床需要, 因此體外大規(guī)模擴增培養(yǎng)干細胞是亟待解決的問題。神經(jīng)干細胞(NSCs),是指具有自我更新能力并且能夠分化產(chǎn)生三種中樞神經(jīng)組織細胞一神經(jīng)元,星型膠質(zhì)細胞,少突膠質(zhì)細胞的一種干細胞。它移植入腦后可替代損傷和死亡的神經(jīng)元,重建神經(jīng)元回路,并在損傷部位的首端和尾端起中斷作用,恢復(fù)損傷的腦功能。它為重建受損的神經(jīng)

3、系統(tǒng)組織、治療以帕金森癥為代表的神經(jīng)退行性疾病帶來了可能,但是, 一般情況下, 可從供體中獲得的干細胞數(shù)量是很少的。因此, 若要將干細胞推向臨床應(yīng)用化及產(chǎn)業(yè)化等實際應(yīng)用, 迫切需要解決的一個問題就是如何在體外大規(guī)模擴增這些干細胞, 使干細胞產(chǎn)品在量上達到臨床治療的要求。目前, 生物反應(yīng)器(bioreactor)的提出為干細胞培養(yǎng)提供了一種有效的方法, 利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)干細胞能實現(xiàn)規(guī)?；瘮U增, 并能有效地維持干細胞的未分化特性, 進而滿足臨床上細胞治療量的要求。動物細胞生物反應(yīng)器必須要滿足低剪切力及良好的氣體混合能力這兩個特點,具體應(yīng)考慮如下要求:(1)要有好的生物相容性,能較好地模擬細胞的體

4、內(nèi)生長環(huán)境；(2)提供足夠的停留時間,符合過程反應(yīng)動力學(xué)的要求；(3)要滿足物質(zhì)傳遞的要求；(4)可調(diào)控反應(yīng)過程中的熱量,不存在過熱點；(5)能有效隔離對細胞有毒性作用的反應(yīng)物或產(chǎn)物,有良好的抗污染能力；(6)便于操作和維修。生物反應(yīng)器的早期研究側(cè)重于細胞擴增倍數(shù)的放大，近年研究則側(cè)重于3D培養(yǎng)環(huán)境對細胞的表面標志物、細胞的增殖能力、分化能力等的影響。選擇合適的3D培養(yǎng)方法，能夠為細胞創(chuàng)造良好環(huán)境，用以保持培養(yǎng)過程中干細胞的特性。1 幾種生物反應(yīng)器的介紹1.1 滾瓶式生物反應(yīng)器利用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器在不斷搖動的細胞培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。此種方法操作最簡單, 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器具有使用方便、價格低廉等特點。但此

5、種培養(yǎng)體系只適合于貼壁依賴型細胞的培養(yǎng)。1.2 攪動懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器此種體系設(shè)計是最經(jīng)典、最早被采用的一種生物反應(yīng)器。通常由罐體、管路、閥門、泵和馬達等組成, 由馬達帶動槳葉混合培養(yǎng)液, 通過攪拌器的作用使細胞和養(yǎng)分在培養(yǎng)液中均勻分布, 罐體上安裝的不同傳感器在線持續(xù)檢測培養(yǎng)液的pH、溫度、溶氧等參數(shù)。此法操作也較簡單, 既適用于以細胞團塊或單細胞形式進行的懸浮細胞培養(yǎng), 也適合貼壁型細胞的微載體培養(yǎng)。但是機械攪動會對細胞造成一定的損傷, 死細胞比較多。1.3 搖袋式生物反應(yīng)器裝置中, 細胞及培養(yǎng)液被置于一個預(yù)先消過毒的無菌一次性塑料袋中, 通入由除菌過濾器過濾的空氣后會形成具有一定空間的培

6、養(yǎng)容器, 袋子被置于一個搖動的平臺上,隨著搖動平臺的左右搖動, 培養(yǎng)基液體在袋子中形成波浪式的運動, 起到良好的混合作用。此種方法通過一次性耗材進行細胞培養(yǎng), 使污染的可能性降到最低, 更符合標準化操作的要求, 但是操作中細胞的放取及監(jiān)控細胞培養(yǎng)狀態(tài)等具有不簡便性, 同時成本花費比較大。1.4 旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器是目前組織工程領(lǐng)域最為廣泛應(yīng)用的生物反應(yīng)器。主要由培養(yǎng)室,供應(yīng)室和半透膜三部分組成。它的主要特點就是培養(yǎng)器在動力帶動下繞水平軸或垂直軸旋轉(zhuǎn),帶動容器內(nèi)培養(yǎng)液和培養(yǎng)物作旋轉(zhuǎn)層流運動,通過氣液兩相膜進行氣體交換,以無菌注射器換液來補充養(yǎng)分。它可為細胞提供一個與體內(nèi)生長環(huán)境

7、非常相似的體外生長環(huán)境。另外,由于反應(yīng)器沒有推進器,并且氣體是通過滲透膜進入培養(yǎng)室,因此反應(yīng)器對細胞產(chǎn)生的剪切力較小。而動物細胞由于沒有細胞壁,恰恰對剪切力十分敏感,對反應(yīng)器提供的剪切力要求較高。最后,旋轉(zhuǎn)壁式反應(yīng)器為細胞生長提供了良好的共培養(yǎng)環(huán)境。1.5 平板型生物反應(yīng)器此系統(tǒng)通常由多層平板、中空支架和外殼三部分組成。此種體系可實現(xiàn)細胞的大規(guī)模培養(yǎng),其培養(yǎng)過程中細胞新陳代謝產(chǎn)生的副產(chǎn)物可以隨時去除, 使其有毒代謝物含量比較低, 但是同時細胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的分泌性因子也隨之減少, 對細胞培養(yǎng)也有一定的害處。1.6 固定流化床式生物反應(yīng)器 通過3D支架來為細胞的貼壁和生長提供依附, 細胞被固定在多孔

8、的載體上, 載體固定在中空管中, 培養(yǎng)基在管內(nèi)流動。在此種體系中細胞與細胞間、細胞與基質(zhì)間的相互作用能更好地模仿生物體內(nèi)的復(fù)雜結(jié)構(gòu), 更有助于細胞的生長。但相比于其他生物反應(yīng)器, 不能進行大規(guī)模的擴增細胞。1.7 氣升式生物反應(yīng)器它的工作狀況柔和,操作簡單,有較好的傳熱、傳質(zhì)和混合特性,培養(yǎng)液的濃度也比較均勻,因此比較適合動物細胞的培養(yǎng)。但氣泡上升時產(chǎn)生的渦流以及氣泡破裂時產(chǎn)生的瞬間張力將對它附近的細胞產(chǎn)生很大的破壞作用。1.8 中空纖維反應(yīng)器中空纖維反應(yīng)器由于剪切力小而廣泛用于動物細胞的培養(yǎng)。這類反應(yīng)器由中空纖維管組成 ,管壁是多孔膜,O2和C02等小分子可以自由透過膜擴散,動物細胞貼附在中

9、空纖維管外壁生長,可以很方便地獲取氧分。1.9 膜式生物反應(yīng)器膜式生物反應(yīng)器主要特點是有一個起傳質(zhì)作用的透析性膜。是一種由半透膜傳遞營養(yǎng)物質(zhì)并將細胞分離的生物反應(yīng)器。它的主要優(yōu)點是細胞或組織留在反應(yīng)器內(nèi),反應(yīng)器連續(xù)灌流;使用膜包埋技術(shù),這是比較溫和的一種方法,這對于培養(yǎng)容易受到剪應(yīng)力破壞的動物細胞是很合適的,加上它可以降低血清的使用量,又能連續(xù)長時間無菌操作,因此被認為最有希望應(yīng)用于人體組織的培養(yǎng)。由于膜的通透性限制，不適用于動物細胞高濃度培養(yǎng)。2 旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器的應(yīng)用2.1 旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞間充質(zhì)干細胞（MSCs)是中胚層來源的具有定向分化能力的干細胞,主要存在于全身結(jié)

10、締組織和器官間質(zhì)中,以骨髓組織中含量最為豐富,胎兒臍血中亦可分離得到。間充質(zhì)干細胞在一定的誘導(dǎo)條件下具有向成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、肌鍵細胞、成肌細胞以及基質(zhì)細胞等中胚層分化的能力,同時間充質(zhì)干細胞還可以向外胚層的神經(jīng)元細胞和內(nèi)胚層的肝卵圓形細胞分化。間充質(zhì)干細胞(MSCs)是典型的貼壁依賴型細胞。該細胞只有黏附在固體基質(zhì)表面才能夠增殖。微載體為MSCs提供貼壁環(huán)境，支持細胞的大量增殖。微載體培養(yǎng)系統(tǒng)具有顯著優(yōu)勢: (1) 同時兼具單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)，且是均相培養(yǎng)； (2) 細胞所處環(huán)境均一；(3) 具有較高表面比；(4) 環(huán)境條件容易測量監(jiān)控；(5) 操作可系統(tǒng)化、自動化，降低了污染發(fā)

11、生的機會。微載體的產(chǎn)品很多，基本可分為實心微載體和大孔微載體兩類。實心微載體: 實心微載體易于細胞在微球表面貼壁、鋪展和病毒生產(chǎn)時的細胞感染。是一種由葡聚糖機制表面交聯(lián)變形凝膠的實心圓形微粒，它可以同細胞緊密鏈接，由此被廣泛應(yīng)用于貼壁細胞的培養(yǎng)中。實心微載體比表面積較小，細胞易受攪拌、球間碰撞、流動剪切力等動力學(xué)因素破壞。而大孔微載體彌補了這樣的缺點。大孔微載體是一種用于大規(guī)模高密度動物細胞培養(yǎng)的支持物，其內(nèi)部具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的小孔，細胞可在其內(nèi)部生長，降低血清用量，增加細胞固定化穩(wěn)定性，增大比表面積，又可避免細胞遭受機械損傷。用旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器進行細胞培養(yǎng)主要具有如下特點:(1)低剪切力對細胞

12、無機械損傷, 膜式氧合氣進行氣體代謝,清除氣泡防止渦流產(chǎn)生, 物流轉(zhuǎn)移率高, 從而改善離體細胞的培養(yǎng)條件；(2)細胞在旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器中有一定程度的三維空間自由, 有利于細胞-細胞、細胞-基質(zhì)之間按組織學(xué)特性相互接觸, 有利于細胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前可以成功應(yīng)用生物反應(yīng)器進行MSCs的培養(yǎng)和定向分化。下面是一個骨髓間充質(zhì)干細胞在旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的應(yīng)用實例：一、 細胞形態(tài)： 接種后120h后，生物反應(yīng)器內(nèi)細胞在微載體上的生長形態(tài)圖接種后120h后，靜態(tài)培養(yǎng)狀態(tài)下細胞在微載體上的生長形態(tài)圖從以上兩圖可以看出，部分細胞貼附在微載體上,之后細胞在微載體上擴增,且通過細胞基質(zhì)黏附在一起,有搭橋現(xiàn)

13、象；而在靜態(tài)培養(yǎng)條件下細胞黏附在微載體的周圍,微載體呈分散分布。這說明,骨髓間充質(zhì)干細胞在旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)時,細胞借助于該系統(tǒng)所提供的三維生長環(huán)境大大的提高了細胞之間獲取聯(lián)系的機會,相對于傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)顯示出很大的優(yōu)勢。二、兔骨髓間充質(zhì)干細胞的生長曲線細胞在生物反應(yīng)器中擴增了10倍而在靜態(tài)培養(yǎng)中僅擴增了3倍。細胞在旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器中擴增的倍增時間遠遠小于在培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)的倍增時間,而比生長速率也明顯高于后者。這也說明三維培養(yǎng)環(huán)境由于與體內(nèi)微環(huán)境相似而更適合細胞在體外的培養(yǎng)。三、兔骨髓間充質(zhì)干細胞擴增倍數(shù)比較兔骨髓間充質(zhì)干細胞在旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器的三維動態(tài)培養(yǎng)條件下,細胞一代的擴增倍數(shù)為

14、9.6,而在靜態(tài)培養(yǎng)下其擴增倍數(shù)為3.1。由此可見,由于生物反應(yīng)器為細胞提供了更接近于體內(nèi)的三維生長環(huán)境,相對于靜態(tài)培養(yǎng)中的二維生長環(huán)境,生物反應(yīng)器更適合骨髓間充質(zhì)干細胞在體外的擴增。四、營養(yǎng)物質(zhì)代謝：對于葡萄糖,隨著培養(yǎng)時間的增長,旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器培養(yǎng)體系中營養(yǎng)物質(zhì)濃度呈平穩(wěn)下降的趨勢,說明細胞在不斷地消耗營養(yǎng)物質(zhì)而進行分裂增殖。同樣在乳酸的比較中, 旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器培養(yǎng)體系中細胞代謝的乳酸量不斷增加并且在很長的一段時間內(nèi)高于靜態(tài)培養(yǎng)中的。這些結(jié)果說明旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器內(nèi)兔骨髓間充質(zhì)干細胞的新陳代謝活動旺盛。這可能是由于培養(yǎng)基的不斷循環(huán)及培養(yǎng)室內(nèi)流體的旋轉(zhuǎn)層流運動,使得生物反應(yīng)器內(nèi)的養(yǎng)分

15、供應(yīng)充足、均勻,反應(yīng)器內(nèi)的傳質(zhì)性能優(yōu)越,因而間充質(zhì)干細胞在旋轉(zhuǎn) 壁式生物反應(yīng)器內(nèi)生長代謝活躍。五、小結(jié)：旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞顯示了較好的生長狀態(tài)、擴增能力和細胞活性,并且其內(nèi)的骨髓間充質(zhì)干細胞的擴增倍數(shù)多于靜態(tài)培養(yǎng)中的擴增倍數(shù)。2.2 旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器培養(yǎng)神經(jīng)干細胞一、神經(jīng)干細胞生長曲線旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器內(nèi)的神經(jīng)干細胞增殖的更快一些。這可能是因為旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器內(nèi)流體的層流運動以及培養(yǎng)基的不斷循環(huán)混合,使細胞分裂增殖信號快速而有效的在培養(yǎng)室內(nèi)傳遞,從而導(dǎo)致細胞的快速增殖。二、神經(jīng)干細胞倍增時間比較：旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器中細胞倍增時間遠小于在T形瓶中培養(yǎng)細胞的倍增時間，說

16、明細胞在旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器內(nèi)具有更旺盛的生命力，這是由于相比于T型瓶中靜態(tài)的二維生長環(huán)境,旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器為細胞生長提供了更加接近自然生長狀態(tài)的三維生長環(huán)境,使得細胞處于積極的分裂增殖狀態(tài)。因此旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器在培養(yǎng)神經(jīng)干細胞方面顯示了優(yōu)越的潛能。三、營養(yǎng)物質(zhì)代謝：對于葡萄糖,隨著培養(yǎng)時間的增長,旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器培養(yǎng)體系中營養(yǎng)物質(zhì)濃度呈平穩(wěn)下降的趨勢,說明細胞在不斷地消耗營養(yǎng)物質(zhì)而進行分裂增殖。同樣在乳酸的比較中, 旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器培養(yǎng)體系中細胞代謝的乳酸量不斷增加并且在很長的一段時間內(nèi)高于T形瓶中的。這些結(jié)果說明旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器內(nèi)神經(jīng)干細胞的新陳代謝活動旺盛。這可能是由于培養(yǎng)基的不斷循環(huán)及培養(yǎng)室內(nèi)流體的旋轉(zhuǎn)層流運動,使得生物反應(yīng)器內(nèi)的養(yǎng)分供應(yīng)充足、均勻,反應(yīng)器內(nèi)的傳質(zhì)性能優(yōu)越,因而神經(jīng)干細胞在旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器內(nèi)生長代謝活躍。四、小結(jié)：旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器是一種理想的神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)的三維體系。其內(nèi)生長的神經(jīng)干細胞有較好的生長狀態(tài)、擴增能力和細胞活性,并且神經(jīng)干細胞的擴增倍數(shù)略多于T一Flask中的擴增倍數(shù),倍增時間遠小于T-Falks中的倍增時間。同時,免疫熒光化學(xué)法、誘導(dǎo)分化以及染色體數(shù)目和核型分析分另d從不同角度證實了旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器培養(yǎng)的神經(jīng)干