q-pcr結(jié)果分析

1、摘要：現(xiàn)在最常用的兩種分析實(shí)時(shí)定量PCR 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方法是絕對定量和相對定量。絕對定量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算起始模板的拷貝數(shù)；相對定量方法則是比較經(jīng)過處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表達(dá)差異。2CT方法是實(shí)時(shí)定量PCR 實(shí)驗(yàn)中分析基因表達(dá)相對變化的一種簡便方法，即相對定量的一種簡便方法。本文介紹了該方法的推導(dǎo)，假設(shè)及其應(yīng)用。另外，在本文中我們還介紹了兩種2CT衍生方法的推導(dǎo)和應(yīng)用，它們在實(shí)時(shí)定量 PCR 數(shù)據(jù)分析中可能會被用到。關(guān)鍵詞：反轉(zhuǎn)錄PCR 定量PCR 相對定量 實(shí)時(shí)PCR Taqman反轉(zhuǎn)錄 PCR （RT-PCR ）是基因表達(dá)定量非常有用的一種方法（1 - 3 ）。實(shí)時(shí)PCR

2、技術(shù)和RT-PCR 的結(jié)合產(chǎn)生了反轉(zhuǎn)錄定量 PCR 技術(shù)（4 ,5 ）。實(shí)時(shí)定量 PCR 的數(shù)據(jù)分析方法有兩種：絕對定量和相對定量。絕對定量一般通過定量標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定我們所感興趣的轉(zhuǎn)錄本的拷貝數(shù)；相對定量方法則是用來確定經(jīng)過不同處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表達(dá)差異或是目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本在不同時(shí)相的表達(dá)差異。絕對定量通常在需要確定轉(zhuǎn)錄本絕對拷貝數(shù)的條件下使用。通過實(shí)時(shí) PCR 進(jìn)行絕對定量已有多篇報(bào)道（6 - 9 ），包括已發(fā)表的兩篇研究論文（10,11 ）。在有些情況下，并不需要對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行絕對定量，只需要給出相對基因表達(dá)差異即可。顯然，我們說 X 基因在經(jīng)過某種處理後表達(dá)量增加 2.5 倍比

3、說該基因的表達(dá)從1000 拷貝/ 細(xì)胞增加到2500 拷貝/ 細(xì)胞更加直觀。用實(shí)時(shí)PCR 對基因表達(dá)進(jìn)行相對定量分析需要特殊的公式、假設(shè)以及對這些假設(shè)的驗(yàn)證。2CT方法可用于定量PCR 實(shí)驗(yàn)來計(jì)算基因表達(dá)的相對變化：2CT公式的推導(dǎo)，以及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，有效性評估在Applied Biosystems User Bulletin No.2（P/N4303859）中有介紹。用2CT方法分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)在文獻(xiàn)中也有報(bào)道（5,6）。本文介紹了該方法的推導(dǎo)、假設(shè)以及應(yīng)用。另外，本文還介紹了2CT兩種衍生方法的推導(dǎo)和應(yīng)用，它們在實(shí)時(shí)定量PCR 數(shù)據(jù)分析中都可能被用到。1. 2CT方法1.1. 2CT方法的推導(dǎo)

4、PCR 指數(shù)擴(kuò)增的公式是：這里，Xn 是第 n 個(gè)循環(huán)後目標(biāo)分子數(shù)，X0 是初始目標(biāo)分子數(shù)，Ex 是目標(biāo)分子擴(kuò)增效率，n 是循環(huán)數(shù)，C T 代表目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。因此：X T 是目標(biāo)分子達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)的分子數(shù)。C T,X 是目標(biāo)分子擴(kuò)增達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)。Kx 是一個(gè)常數(shù)。對于內(nèi)參反應(yīng)而言，也有同樣的公式：用XT 除以RT 得到：對于使用 Taqman 探針的實(shí)時(shí)擴(kuò)增而言， XT 和 RT 的值由一系列因素決定：包括探針?biāo)鶐У臒晒鈭?bào)導(dǎo)基團(tuán)、探針序列對探針熒光特性的影響、探針的水解效率和純度以及熒光閾值的設(shè)定。因此常數(shù)K 并不一定等于1 。假設(shè)目標(biāo)序列與內(nèi)參序列擴(kuò)增效率相

5、同： 或：XN 代表經(jīng)過均一化處理過的初始目標(biāo)分子量；CT表示目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因CT值的差異（CT,XCT,R ）整理上式得：最后用任一樣本q 的XN 除以參照因子（calibrator, cb）的XN得到：在這里對于一個(gè)少于150bp 的擴(kuò)增片斷而言，如果 Mg2+ 濃度、引物都進(jìn)行了適當(dāng)?shù)膬?yōu)化，擴(kuò)增效率接近于1 。因此目標(biāo)序列的量通過內(nèi)均一化處理之后相對于參照因子而言就是1.2. 2CT方法的假設(shè)和應(yīng)用要使CT計(jì)算方法有效，目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率必須相等。看兩個(gè)反應(yīng)是否具有相同的擴(kuò)增效率的方法是看他們模板濃度梯度稀釋後擴(kuò)增產(chǎn)物CT如何變化。圖1 顯示的是 cDNA 樣品在

6、100 倍稀釋范圍內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對于每一個(gè)稀釋樣本，都用GAPDH 和c-myc 特異的熒光探針及引物進(jìn)行擴(kuò)增。計(jì)算出c-myc 和 GAPDH 的平均CT值以及CT值，通過cDNA 濃度梯度的log值對CT值作圖，如果所得直線斜率絕對值接近于0，說明目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的擴(kuò)增效率相同，就可以通過CT方法進(jìn)行相對定量。在圖1中，直線斜率是0.047，因而假設(shè)成立，CT方法可以用來分析數(shù)據(jù)。如果兩個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)效率不同，則需要通過定量標(biāo)準(zhǔn)曲線和絕對定量的方法來進(jìn)行相對定量；或者也可以重新設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化反應(yīng)條件使得目標(biāo)序列和內(nèi)參序列具有相同的擴(kuò)增效率。1.3. 2CT內(nèi)標(biāo)和參照因子的選擇使用內(nèi)標(biāo)基因的目

7、的是為了對加入到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的RNA 進(jìn)行均一化處理。標(biāo)準(zhǔn)的看家基因一般都可被用作內(nèi)標(biāo)基因。適合于實(shí)時(shí) PCR 反應(yīng)內(nèi)標(biāo)基因包括GAPDH， -actin，2-microglobulin 以及rRNA 。當(dāng)然，其它的看家基因也同樣能被用作內(nèi)標(biāo)。我們推薦在應(yīng)用某一基因作為內(nèi)標(biāo)之前首先確證該基因的表達(dá)不會受實(shí)驗(yàn)處理的影響。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)處理是否對內(nèi)標(biāo)基因表達(dá)產(chǎn)生影響的方法在2.2 部分有描述。2CT方法中參照因子的選擇決定于基因表達(dá)定量實(shí)驗(yàn)的類型。最簡單的設(shè)計(jì)就是把未經(jīng)處理的樣品作為參照因子（calibrator ）。經(jīng)內(nèi)標(biāo)基因均一化處理後，通過方法計(jì)算，目標(biāo)基因表達(dá)差異通過經(jīng)過處理的樣本相對于未經(jīng)處理

8、的樣本的倍數(shù)來表示。對于未經(jīng)處理的參照樣，CT=0，而20=1。所以根據(jù)定義，未處理樣本的倍數(shù)變化為1 。而對于那些經(jīng)過處理的樣本，相對于參考因子基因表達(dá)的倍數(shù)為2CT。同樣的分析也可用于不同時(shí)相的基因表達(dá)差異，在這種情況下，一般選0 時(shí)刻的樣本作為參照因子。有些情況下，并不是比較不同處理樣本基因表達(dá)差異。例如，有的是想看某一器官中特定 mRNA 的表達(dá)。在這種情況下，參照因子可能是另一器官中該 mRNA 的表達(dá)。表1顯示了大腦和腎臟總RNA 中c-myc 和GAPDH 轉(zhuǎn)錄本的CT 值。在這一個(gè)例子中，大腦被人為的選擇為參照因子，通過計(jì)算得到腎臟c-myc 表達(dá)量經(jīng)GAPDH 校正後相對于大

9、腦的表達(dá)量的結(jié)果。盡管相對定量方法可用于這種組織之間的比較，但結(jié)果的生物學(xué)解釋是相當(dāng)復(fù)雜的。不同種類細(xì)胞中目標(biāo)和參照轉(zhuǎn)錄本單一的相對量變化可能在任何特定的組織中都存在。表 1 給出了目標(biāo)基因（c- myc ）和內(nèi)參基因（GAPDH ）在不同管中擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在這里不應(yīng)該把任一單個(gè)的 c-myc 管子和 GAPDH 管子作比較，而應(yīng)該分別計(jì)算出 c-myc 和 GAPDH 的平均CT 來計(jì)算CT 。1.4. 2CT方法的數(shù)據(jù)分析實(shí)時(shí)定量PCR所得到CT值可以很容易的輸出到表格程序如Microsoft Excel中去。為了顯示數(shù)據(jù)分析過程，我們在這里給出了一個(gè)基因表達(dá)定量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和樣本列表。通

10、過-actin 均一化處理，我們對目標(biāo)基因fos-glo-myc 的表達(dá)變化進(jìn)行了監(jiān)測。在8h 的時(shí)間范圍內(nèi)，在每一時(shí)間點(diǎn)都取3 個(gè)重復(fù)樣本，每一樣本在cDNA 合成之後都做定量PCR ，數(shù)據(jù)分析用到了公式9，即：Time x 表示任意時(shí)間點(diǎn)，Time 0表示經(jīng) -actin 校正后1 倍量的目標(biāo)基因表達(dá)。0 時(shí)刻目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的平均CT（見圖2 第8 欄）被用于公式9 中。通過公式9 計(jì)算出每一個(gè)樣本目標(biāo)基因表達(dá)通過 -actin 均一化處理後相對于0 時(shí)刻的倍數(shù)（見圖2 第9 欄）。平均SD，CV 由每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)所取的三個(gè)重復(fù)樣求得。用這種分析方法，在0 時(shí)刻的平均倍數(shù)變化接近于1。我

11、們發(fā)現(xiàn)通過檢測在 0 時(shí)刻平均倍數(shù)變化是否為1 可以很方便的驗(yàn)證三個(gè)重復(fù)樣品之間是否有錯(cuò)誤或者誤差。如果得到的結(jié)果與1偏差很大，則表明存在計(jì)算錯(cuò)誤或者是很高的實(shí)驗(yàn)誤差。在前面的例子中，在每一時(shí)間點(diǎn)上分別取了三個(gè)獨(dú)立的 RNA 樣本進(jìn)行了分析。因此對每一個(gè)樣本分別處理，通過計(jì)算後取結(jié)果的平均值就非常重要。如果是同一樣本進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增的重復(fù)，這就需要首先求出平均CT，然後再進(jìn)行 計(jì)算。怎么樣計(jì)算平均值就要看目標(biāo)基因和內(nèi)參基因是在同一個(gè)管子中擴(kuò)增還是在不同的管子中擴(kuò)增。表 1 給出了目標(biāo)基因（c- myc ）和內(nèi)參基因（GAPDH ）在不同管中擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在這里不應(yīng)該把任一單個(gè)的 c-myc

12、 管子和 GAPDH 管子作比較，而應(yīng)該分別計(jì)算出 c-myc 和 GAPDH 的平均CT 來計(jì)算CT 。重復(fù)實(shí)驗(yàn)中CT值的估計(jì)偏差通過標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)計(jì)算轉(zhuǎn)化成最後結(jié)果中相對量的變化。但其中的一個(gè)難點(diǎn)是 CT值與相應(yīng)的拷貝數(shù)成指數(shù)關(guān)系（見第4 部分），因此，在最後的計(jì)算中，的誤差通過CT 加上標(biāo)準(zhǔn)偏差和CT 減去標(biāo)準(zhǔn)偏差來評估，這就使得求得的數(shù)值相對于平均值呈不對稱分布。不對稱分布是因?yàn)榻Y(jié)果經(jīng)指數(shù)處理後轉(zhuǎn)化成量的線性比較造成的。通過不同熒光染料標(biāo)記的探針，我們可以在同一管中同時(shí)擴(kuò)增目標(biāo)序列和內(nèi)標(biāo)序列。表2 給出了目標(biāo)基因（c- myc）和內(nèi)標(biāo)基因（GAPDH）在同一管中擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。對于任意一個(gè)

13、管子，目標(biāo)基因（c- myc）和內(nèi)參基因（GAPDH）擴(kuò)增時(shí)加入的cDNA 量都是一樣多的，所以可以分別對每個(gè)管子計(jì)算CT 值，這些值取平均后再進(jìn)行計(jì)算。 在這里估計(jì)誤差值也是一個(gè)不對稱的范圍，反映了誤差經(jīng)指數(shù)處理轉(zhuǎn)化為線性差異。在表1 和表2 中，估計(jì)誤差在從CT 到CT 的計(jì)算中未見有增加，這是因?yàn)槲覀儼褏⒄栈蚝蜋z測基因的誤差都顯示出來了。我們把CT，cb 當(dāng)作一個(gè)人為設(shè)定的常數(shù)來減去，得到CT 。這樣得到的結(jié)果就與圖 2 所顯示的在求平均之前對不同重復(fù)樣本分別通過各自的CT 值求實(shí)  所得結(jié)果 相當(dāng)。另一種方法是將參照基因當(dāng)作沒有任何誤差的1倍的量，在這種情況下，平均CT,c

14、b 的誤差值被引入到每一樣本的CT中。在表1中，腎臟中CT 變成- 2.50±0.20 而經(jīng)過校正的c-myc 量是5.6 倍，范圍從4.9 到 5.6 。而在大腦中的結(jié)果是沒有誤差的1倍。表2 給出了目標(biāo)基因（c- myc）和內(nèi)標(biāo)基因（GAPDH）在同一管中擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。2. 2Cf方法2.1. 2Cf方法的推導(dǎo)通過內(nèi)標(biāo)RNA 可以對加入 RNA 的量的差異進(jìn)行校正。2CT方法的數(shù)據(jù)分析的一個(gè)特點(diǎn)就是能夠利用實(shí)時(shí)PCR 實(shí)驗(yàn)的一部分?jǐn)?shù)據(jù)來完成這種校正。在其它的方法不能定量初始 RNA 量的時(shí)候：例如，在能得到的 RNA 量非常有限的時(shí)候或者需要處理高通量的樣品的時(shí)候，這一方法的優(yōu)

15、勢就格外明顯。當(dāng)然我們也可以利用PCR 實(shí)驗(yàn)以外的方法來完成這種校正。最常用的一種方法就是用紫外吸收來確定用于cDNA 合成的RNA 量，然後將相同的RNA 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA 用于PCR 定量反應(yīng)。這種外標(biāo)法校正的一個(gè)應(yīng)用例子就是研究某種實(shí)驗(yàn)處理是否影響內(nèi)標(biāo)基因的表達(dá)。在這里，目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)合二為一。在這個(gè)例子中，公式2 不被公式3 除，公式5 變成：整理得：任一樣品X0,q 除以參照品X0,cb 得：在這里 C'T=CT,q-CT,cb 。CT與前面計(jì)算中用的CT（用目標(biāo)基因CT值減去參照基因CT值）相互區(qū)別。就象在1.1部分所描述的，如果條件優(yōu)化較好，效率接近于1，內(nèi)標(biāo)相對于參

16、照因子為：2.2. 2Cf方法的應(yīng)用2CT'方法的一個(gè)應(yīng)用就是確定實(shí)驗(yàn)處理對某一候選內(nèi)標(biāo)基因的影響。為了顯示這一過程，我們做了血清饑餓/ 誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)（7） 。血清饑餓/ 誘導(dǎo)是研究某些 mRNA 降解的常用方法（8）。然而，血清可能影響一些基因的表達(dá)包括標(biāo)準(zhǔn)的看家基因的表達(dá)。在24-h 血清饑餓培養(yǎng)之後，在NIH 3T3 細(xì)胞中加入15% 血清誘導(dǎo)基因表達(dá)。從細(xì)胞中提取Poly(A)+ RNA ，并將之反轉(zhuǎn)錄成cDNA 。利用SYBR Green 通過實(shí)時(shí)定量PCR 檢測GAPDH ， 2 -microglobulin cDNA 的量。GAPDH 和2 -microglobulin 各自

17、的相對量通過2CT'公式求得。細(xì)胞處理對于GAPDH 的基因表達(dá)有明顯影響，但對2 -microglobulin 沒有什么影響。因此2 -microglobulin 很適合做血清刺激定量實(shí)驗(yàn)的內(nèi)標(biāo)，而GAPDH并不適合。這一例子向大家展示了在只研究一個(gè)基因的時(shí)候怎么用2CT'的方法分析基因相3. 實(shí)時(shí)PCR 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)時(shí)PCR 最終分析的是閾值循環(huán)或CT。CT值通過 PCR 信號的對數(shù)值和循環(huán)數(shù)來確定。因此CT值是一個(gè)指數(shù)而非線性概念。因此，在任何統(tǒng)計(jì)分析中都不要用原始的CT值來表示結(jié)果。正如我們在前文中所描述的一樣，PCR 相對量通常和內(nèi)標(biāo)和參照樣本一起計(jì)算而很少直接

18、用CT值來表示，除非我們想檢驗(yàn)重復(fù)樣本之間的差別。為了向大家顯示這一點(diǎn)，我們用SYBR Green 通過real-time PCR 來檢測相同cDNA 的96 個(gè)重復(fù)反應(yīng)。所有反應(yīng)組分在同一管中混好後分裝到 96 個(gè)管中，做實(shí)時(shí) PCR 分析，得到了每一個(gè)樣本的 C T 值。為了比較樣品間變化，計(jì)算了96 個(gè)樣本的平均±SD，如果通過原始CT值計(jì)算，平均 ±SD 是20.00±0.193，CV 為0.971% 。但是如果把原始CT 值用2 -CT 轉(zhuǎn)化成線性形式，平均±SD是9.08 × 10-7 ±1.33 × 10-7，CV 為13.5 %。從這個(gè)簡單的例子我們可以看出，通過原始CT值來反映變化是錯(cuò)誤的，應(yīng)該避免。用2CT 將單個(gè)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成線性形式來說明重復(fù)樣本之間的變化和差異更準(zhǔn)確可靠。4. 結(jié)論實(shí)時(shí)定量PCR 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析可以采用相對定量和絕對定量兩種方法，研究人員在設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR 實(shí)驗(yàn)分析基