分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)理論考試

1、2012-2013 學(xué)年第二學(xué)期分子生物實(shí)驗(yàn)考試題庫(kù)1、PCR原理是什么答：PCR技術(shù)是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。它的特異性是由兩個(gè)人工合成的引物序列決定。引物就是與待擴(kuò)增 DNA 片段兩側(cè)互補(bǔ)的寡 核苷酸。 雙鏈 DNA 是在臨近沸點(diǎn)的溫度下加熱時(shí)便會(huì)分離成兩條單鏈DNA 分子（變性） ，兩引物分別與兩條DNA 的兩側(cè)序列特異復(fù)性，在適宜條件下， DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，利用反應(yīng)混合物中的 4種脫氧核甘三磷酸，在引物 的引導(dǎo)下，按5'-3方向復(fù)制互補(bǔ)DNA,即引物的延伸。在適宜的條件下，這種 熱變性-復(fù)性一延伸的過(guò)程不斷循環(huán)重復(fù)，前一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物DNA可作

2、為后一個(gè)循環(huán)的模板DNA參與DNA合成，使產(chǎn)物DNA的量按2M方式擴(kuò)增。2、PCR一般體系應(yīng)加入哪些試劑答：10*PCR緩沖液（含Mg+）、模板DNA、四種dNTR 一對(duì)引物、耐熱Taq聚 合酶。3、PCR防止其它DNA污染，應(yīng)注意哪些問(wèn)題答：標(biāo)本放置時(shí)密封要嚴(yán)避免溢于容器外，容器要清潔避免造成相互間交叉污染； 移液器使用要規(guī)范避免污標(biāo)本間污染;無(wú)菌工作臺(tái)操作， 避免氣體中有雜菌。4、影響PCR產(chǎn)物產(chǎn)量的因素主要有哪些答：引物、酶的種類(lèi)及濃度、dNTP的質(zhì)量（優(yōu)劣）與濃度、模板核酸的量與純化程度、Mg2+濃度、溫度與時(shí)間、循環(huán)次數(shù)。5、引物設(shè)計(jì)應(yīng)注意哪些問(wèn)題答：引物長(zhǎng)度不宜過(guò)長(zhǎng)20bp左右較佳

3、；引物擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度以 200-500為 宜；引物堿基的中G+C的含量應(yīng)在40-60%為宜，G+C太少則擴(kuò)增效果不佳， G+C過(guò)多則易出現(xiàn)非特異條帶；避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩天引物 間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)否則會(huì)形成二聚體結(jié)構(gòu)；引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PC跌敗。6、簡(jiǎn)述克隆某一原核生物基因片段一般操作步驟答：克隆某一原核生物基因片段是可用PCR技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行大量擴(kuò)增，首先準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)材料大體為：需擴(kuò)增的模板 DNA、DNA聚合酶、dNTP混合液、PCR爰 沖液、引物等、其過(guò)程大體分為 3 個(gè)步驟：第一步：

4、變形：通過(guò)加熱使DNA 模板雙螺旋鏈解離為單鏈，第二步：退火：當(dāng)溫度突然降低時(shí)。由于模板DNA 結(jié)構(gòu)復(fù)雜難再互補(bǔ)，而引物建構(gòu)簡(jiǎn)單且數(shù)量巨多易于模板DNA 互補(bǔ)雜交從而使引物結(jié)合到模板上DNA上，第三部：延生：在DNA聚合酶和四種底物及鎂離子存 在條件下 DNA 連開(kāi)始延伸。以上 3 個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，數(shù)小時(shí)后即可得到大量 擴(kuò)增的目的片段。7、什么是質(zhì)粒質(zhì)粒的基本性質(zhì)有哪些答： a 質(zhì)粒是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位， 包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的脫氧核糖核酸（DNA汾子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來(lái)專(zhuān)指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的 DNA 分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因

5、的載體。 b 具有復(fù)制起點(diǎn)。 攜帶易于篩選的選擇標(biāo)記。具有多種限制性?xún)?nèi)切酶的切割位點(diǎn)。具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量和較高的拷貝數(shù)。8、質(zhì)粒抽提實(shí)驗(yàn)中溶液I 、 II、 III 各有什么作用答：溶液I:由葡萄糖,EDTA,Tris比成.葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，減少抽提 過(guò)程中的機(jī)械剪切作用，防止破壞質(zhì)粒DNA;EDTA勺作用是絡(luò)和掉Mg2+等二價(jià)金 屬離子，防止DNA酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用；Tris Cl能使溶菌液維持溶菌作用的最 適PH范圍。溶液II:由SDSW NaOH組成.SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì) 分子結(jié)合使之變性；NaOH（pH12）勺作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性。溶液山:

6、由KAc與HAc組成，是pH值為的高鹽溶液.能中和溶液II的堿性，使染色體 DNA復(fù)性而發(fā)生纏繞并使質(zhì)粒DNA復(fù)性.K+離子會(huì)與SDSt成溶解度很低的鹽并 與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去.溶液中的染色體DNA也會(huì)與蛋白質(zhì)-SD北成相互纏繞 的大分子物質(zhì),很容易與小分子的質(zhì)粒DNA 分離 ,此外 ,高鹽溶液也有利于各種沉淀的形成。9、堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA 的基本原理是什么答：堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA 之間在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而達(dá)到分離目的。PH介于時(shí)，線性DNA變性，雙鏈打開(kāi)，而質(zhì)粒 DNA雖變性，但兩條互補(bǔ)鏈彼此纏繞，當(dāng) PH 恢復(fù)到中性時(shí)，質(zhì)粒DNA 可迅速準(zhǔn)確的完成復(fù)性，而線性D

7、NA 復(fù)性較困難，纏繞成網(wǎng)狀，通過(guò)離心可沉淀除去。10、在堿裂解法提取質(zhì)粒DNA 操作中應(yīng)注意哪些問(wèn)題答： （ 1）正確使用移液器。 （ 2）溶液 ll 必須新鮮配制。（ 3）加入酚-氯仿后必須充分混勻。（ 4 ）混勻的過(guò)程不能太過(guò)劇烈。（ 5）每次棄上清液時(shí)都應(yīng)用移液器吸去管壁上黏附的水珠。 （ 6）吸取酚-氯仿溶液時(shí)要將Tip 頭插入液體分層的下側(cè)。 【可根據(jù)第一次試驗(yàn)自己寫(xiě)的注意事項(xiàng)進(jìn)行補(bǔ)充】11、在堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA 時(shí)，酚/氯仿的作用是什么答：酚是強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)變性劑，能有效使蛋白質(zhì)變性而除去，氯仿有強(qiáng)烈的脂溶性，去除脂類(lèi)雜質(zhì)，本身酚：氯仿：異戊醇 =25： 24： 1 的主要作

8、用是抽提蛋白質(zhì)12、堿裂解法提取的質(zhì)粒DNA 分子一般有幾種構(gòu)象電泳時(shí)移動(dòng)速率有何差異答：超螺旋DNA線性DNA開(kāi)環(huán)DNA13、提取植物基因組DNA 的基本原理是什么在操作過(guò)程中應(yīng)該注意什么答： 基本原理:利用液氮對(duì)植物組織進(jìn)行研磨，從而破碎細(xì)胞。細(xì)胞提取液中含有的SDS容解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。EDTAffl制DNA 酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液經(jīng)異丙醇沉淀。注意事項(xiàng)：材料要新鮮嬌嫩，葉片研磨地越細(xì)越好；操作應(yīng)為無(wú)菌操作；操作應(yīng)溫和，不宜劇烈晃動(dòng)； 注意移液器的正確使用。14、在植物基因組提取過(guò)程中，DNA降解的可能原因答：原因：從植物中提

9、取DNA時(shí)沒(méi)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的DNA酶進(jìn)行滅活；操作過(guò)程 中被細(xì)菌污染了；口水等含酶物質(zhì)飛入樣品中；溫度、PH等變化過(guò)于劇烈。 15、在植物基因組提取過(guò)程中，提高 DNA產(chǎn)量的措施答：應(yīng)當(dāng)選取幼嫩的葉片，因?yàn)橛啄廴~片中的DNA含量高些；組織抽提前要保存在液氮中，以免DNA被破壞；純化時(shí)注意抑制核酸酶污染，使用EDTA等防止DNA降解；整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)該溫和操作，不能劇烈振蕩，混合過(guò)程要輕緩， 減少抽提，減少DNA片段被認(rèn)為降解，因?yàn)檫^(guò)度振蕩會(huì)使 DNA斷裂成小片段。 16、在使用苯酚進(jìn)行DNA提取時(shí)應(yīng)該注意什么答：酚一定要進(jìn)行堿平衡，苯酚具有高度腐蝕性，飛濺到皮膚、粘膜、眼睛會(huì) 對(duì)人體造成損傷，應(yīng)當(dāng)注意

10、防護(hù)；它是出去蛋白質(zhì)的，要充分振蕩使蛋白質(zhì)變 性，但不能太劇烈而打斷DNA;離心后應(yīng)該避免再次吸入有機(jī)相的苯酚 一氯仿, 盡量只取上清，不應(yīng)該讓苯酚最后仍有殘留，需抽提干凈。17、在提取植物基因組DNA過(guò)程中，使用苯酚與氯仿的作用是什么答：用苯酚和氯仿抽取，去除多余的蛋白，保證提取的基因組較純凈。18、在植物基因組提取過(guò)程中，該如何檢測(cè)和保證基因組DNA的質(zhì)量答：檢測(cè)：瓊脂糖凝膠電泳；保證 DNA活性:用EDTA卬制DNA酶活性，從而保 證DNA不被破壞。19、什么是限制性?xún)?nèi)切酶答：限制性?xún)?nèi)切酶是一類(lèi)能夠識(shí)別雙鏈 DNA分子中的某種特定核甘酸序列，并 由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶，有三種

11、類(lèi)型，I類(lèi)，II類(lèi)，田類(lèi)，他們都有甲基化修飾功能和限制酶功能，H類(lèi)常用于分子克隆20、常見(jiàn)的II型限制性?xún)?nèi)切酶切割雙鏈 DNA后會(huì)產(chǎn)生 末端或 末端。答：粘性，平21、下列有關(guān)限制性?xún)?nèi)切酶的描述，錯(cuò)誤的是：（C）A. 一種限制性?xún)?nèi)切酶只能識(shí)別一種特定的脫氧核甘酸序列B.限制性?xún)?nèi)切酶的活性受溫度的影響C.限制性?xún)?nèi)切酶能識(shí)別和切割 RNAD.限制性?xún)?nèi)切酶可以從原核中提取22、現(xiàn)有一長(zhǎng)度為l 000 bp的DNA分子，用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI酶切后得到的 DNA分子仍是l 000 bp,用Kpn I單獨(dú)酶切得到400 bp和600 bp 2種長(zhǎng)度的DNA分 子.用EcoRI, Kpn l同時(shí)酶切

12、后得到200 b濟(jì)口600 bp 2種長(zhǎng)度的DNA分子。請(qǐng)畫(huà) 出該DNA可能的酶切圖譜。答：這是個(gè)大小為1000bp勺環(huán)形的DNA#子，在1bP處和400bp處分別有一個(gè)Kpn I位點(diǎn)，在200bPt有一個(gè)EcoR I位點(diǎn)。23、一個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)是5 JGJ GATC。3；在質(zhì)粒上有該酶的一個(gè)切點(diǎn)，請(qǐng)畫(huà)出質(zhì)粒被該限制性?xún)?nèi)切酶切割后所形成的黏性末端。答：-GGATCC毋在上面，下面為-CCTAG G-該酶為限制性?xún)?nèi)切酶I24、基因工程中，切割目的基因和載體所用的限制酶及切口必備的特點(diǎn)是(A)A.可用不同的限制性?xún)?nèi)切酶，露出的黏性末端必須相同B.必須用相同的限制性?xún)?nèi)切酶，露出的

13、黏性末端可不相同C.必須用相同的限制性?xún)?nèi)切酶，露出的黏性末端必須相同D.可用不同的限制性?xún)?nèi)切酶，露出不同的黏性末端25、在遺傳工程技術(shù)中，限制性?xún)?nèi)切酶主要用于( D)A. 目的基因的提取和導(dǎo)入B. 目的基因的導(dǎo)入和檢測(cè)C. 目的基因與運(yùn)載體結(jié)合和導(dǎo)入D. 目的基因的提取和與運(yùn)載體結(jié)合26、在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，常使用微量移液器，請(qǐng)說(shuō)明在使用微量移液器時(shí)需要注意什么答：確定合適的量程，不可超過(guò)量程取液。取液時(shí)按到第一檔，Tip頭垂直進(jìn)入液面3-5 毫米取液。移液器注意不能接觸溶液。 打出液體時(shí)貼壁并有一定角度，要按到第二檔將液體全部壓出。 使用完畢后，打下tip 頭，放好移液器。27、現(xiàn)有量程為

14、此1-10區(qū)1 H 10-200 u 1100-1000 曲移液器各一支，請(qǐng) 問(wèn)，當(dāng)吸取 聞 聞5%115%1100 750區(qū)液體時(shí)，各需要選取那種最佳 量程范圍的移液器答：分別是， 1-10，10-200，100-1000。28、本學(xué)期我們學(xué)習(xí)了CaC2l 法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和熱休克法轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA,你還知道哪些方法可以制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的方法答：氯化銣法，甘油聚乙二醇法，一步法29、在質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)化大腸桿菌時(shí)，是如何進(jìn)行篩選的答：因?yàn)橘|(zhì)粒pETBlue-2帶有青霉素抗性基因，所以轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌細(xì)胞能在含羧芐青霉素的瓊脂糖平板上生長(zhǎng)形成菌落.所以用含羧芐青霉素的瓊脂糖平

15、板可以篩選出轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌。30、藍(lán)白班篩選的原理是什么答：見(jiàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) 92 面的實(shí)驗(yàn)原理的后半部分31、在質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，如果將用來(lái)浸泡玻璃棒的酒精引燃起火該如何處理答：用水打濕的毛巾，著火時(shí)用毛巾蓋上就行了32、衛(wèi)星菌落出現(xiàn)的原因是什么該如何避免答：衛(wèi)星菌落是氨節(jié)降解后生長(zhǎng)的雜菌。可能是感受態(tài)細(xì)胞的問(wèn)題也可能是轉(zhuǎn)化過(guò)程出現(xiàn)操作失誤例如未在冰中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，感受態(tài)在常溫下放置過(guò)久失活，轉(zhuǎn)化后搖菌時(shí)間過(guò)短，或者搖床速度過(guò)慢，沒(méi)有把菌搖起來(lái)，如果不是轉(zhuǎn)化過(guò)程出現(xiàn)的問(wèn)題就要進(jìn)一步考慮連接是否正確，連接時(shí)間1216h,體系一般6ul-10ul,目的片段：載體一般1:31:10

16、。可以將培養(yǎng)時(shí)間控制在12h-16h之 間 ，或者更換抗生素為羧芐青霉素。33、影響所制備感受態(tài)效率的因素有哪些答： 影響因素有（ 1） 大腸桿菌生長(zhǎng)狀態(tài)（2） 氯化鈣濃度（3） 冰上放置時(shí)間 （4）保存溫度34、轉(zhuǎn)化后為什么要溫育1 小時(shí)為什么加入的是無(wú)抗培養(yǎng)基答：第一問(wèn)：溫育就是讓感受態(tài)恢復(fù)一下?tīng)顟B(tài)，以及一些相關(guān)抗性基因的表達(dá)。畢竟從-70環(huán)境中取出，需一段時(shí)間適應(yīng)才可轉(zhuǎn)化。第二問(wèn)：因?yàn)榧?xì)胞比較脆弱，加無(wú)抗培養(yǎng)基是為了讓細(xì)胞生長(zhǎng)，促使在轉(zhuǎn)化過(guò)程中獲得的新表型得到表達(dá)。35、如果實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組本不該長(zhǎng)出菌落的平板上長(zhǎng)出了一些菌落，你將如何解釋這種現(xiàn)象答：（ 1）操作過(guò)程儀器、器皿等不是無(wú)菌的，

17、出現(xiàn)了一些雜菌和雜DNA 的污染（ 2）細(xì)菌在感受態(tài)時(shí)發(fā)生了一些自然變異，對(duì)所加的抗生素有一定的抗性，所以長(zhǎng)出一些菌落 （ 3）所加的抑菌抗生素濃度不夠，不能夠抑制住細(xì)菌的生長(zhǎng) （ 4）一些實(shí)驗(yàn)誤差，錯(cuò)將菌液放錯(cuò)36、在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照平皿應(yīng)有什么樣的結(jié)果如何解釋這個(gè)結(jié)果答：實(shí)驗(yàn)組中長(zhǎng)出菌落 而對(duì)照組中無(wú)任何菌落生長(zhǎng)。37、在學(xué)習(xí)制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，為什么要保證細(xì)胞密度<108/ ml 甘油的作用是什么答：細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為宜，密度過(guò)高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率，一次要保證細(xì)胞密度<10八8/ ml。甘油的目的是為了防止水在凍結(jié)過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)大的冰晶損傷細(xì)胞，抑制大

18、腸桿菌生長(zhǎng)，以便保存。38、通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，你認(rèn)為自己掌握了哪些實(shí)驗(yàn)技能你對(duì)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)有哪些建議與意見(jiàn)答：此為主觀題，可結(jié)合所學(xué)知識(shí)發(fā)揮，言之有理即可。（比如凝膠電泳， PCR 擴(kuò)增等。）這門(mén)課程將分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作的理論與實(shí)踐相結(jié)合，不僅使我在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技能方面得到系統(tǒng)的訓(xùn)練，而且讓我對(duì)具體實(shí)驗(yàn)操作的原理有了清晰地認(rèn)識(shí)。作為一門(mén)實(shí)驗(yàn)課，它還鍛煉了我運(yùn)用已學(xué)到的理論知識(shí)和已掌 握的實(shí)驗(yàn)技能綜合解決科學(xué)問(wèn)題的能力。39、用瓊脂糖凝膠分離DNA的理論依據(jù)是什么答：DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以相同的速率向正極方向移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決