腫瘤學(xué)的一些概念_百度文庫(kù)

1、micro RNA同義詞microRNA一般指micro RNAMicroRNA (miRNA 是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子,它們?cè)趧?dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。到目前為止,在動(dòng)植物以及病毒中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有28645 個(gè)miRNA 分子(Release 21: June 2014 。大多數(shù)miRNA 基因以單拷貝、多拷貝或基因簇(cluster 的形式存在于基因組中(Lagos2Quintanaet al , 2001 ; Lau et al , 2001 。簡(jiǎn)介MicroRNA (miRNA 是一類內(nèi)生的、長(zhǎng)度約為20-24個(gè)核苷酸的小RNA,其在細(xì)胞內(nèi)

2、具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。每個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因,而幾個(gè)miRNA也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過(guò)一個(gè)miRNA來(lái)調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá),也可以通過(guò)幾個(gè)miRNA的組合來(lái)精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。據(jù)推測(cè),miRNA調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因。最近的研究表明大約70 %的哺乳動(dòng)物miRNA 基因是位于TUs區(qū)( transcription micro RNAmicro RNA units , TUs ( Rodriguez et al ,2004 , 且其中大部分是位于內(nèi)含子區(qū)( Kim &Nam , 2006 。一些內(nèi)含子miRNA 基因的位置在不同的物種中是高度保守的

3、。miRNA 不僅在基因位置上保守, 序列上也呈現(xiàn)出高度的同源性(Pasquinelli etal , 2000 ; Ruvkun et al , 2001 ; Lee & Ambros ,2001 。miRNA 高度的保守性與其功能的重要性有著密切的關(guān)系。miRNA 與其靶基因的進(jìn)化有著密切的聯(lián)系, 研究其進(jìn)化歷史有助于進(jìn)一步了解其作用機(jī)制和功能。MicroRNAMicroRNA(miRNA是一類內(nèi)生的、長(zhǎng)度約20-24個(gè)核苷酸的小RNA,幾個(gè)miRNAs 也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因?？梢酝ㄟ^(guò)幾個(gè)miRNAs的組合來(lái)精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。據(jù)推測(cè),miRNA調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因。Mic

4、roRNA存在多種形式,最原始的是pri-miRNA,長(zhǎng)度大約為3001000個(gè)堿基; pri-miRNA經(jīng)過(guò)一次加工后,成為pre-miRNA即microRNA前體,長(zhǎng)度大約為7090個(gè)堿基;pre-miRNA再經(jīng)過(guò)Dicer酶酶切后,成為長(zhǎng)約2024nt的成熟miRNA。實(shí)際研究中,pre-miRNA應(yīng)用最早,也最廣泛,很多商業(yè)化的MicroRNA庫(kù)都是pre-miRNA形式的。近幾年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)microRNA的雙臂對(duì)成熟miRNA的形成有著十分重要的作用,所以天然的pri-miRNA形式越來(lái)越多地被研究者采用。MicroRNAs (miRNAs是一種大小約2123個(gè)堿基的單鏈小分子RN

5、A,是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成,不同于siRNA(雙鏈但是和siRNA密切相關(guān)。據(jù)推測(cè),這些非編碼小分子RNA(miRNAs參與調(diào)控基因表達(dá),但其機(jī)制區(qū)別于siRNA介導(dǎo)的mRNA降解。第一個(gè)被確認(rèn)的miRNA是在線蟲(chóng)中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4 和let-7,隨后多個(gè)研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個(gè)miRNAs。特征已經(jīng)被鑒定的miRNAs據(jù)推測(cè)大都是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu),約70個(gè)堿基大小形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成的,有5端磷酸基和3羥基,大小約2125nt 的小分子RNA片斷,定位于RNA前體

6、的3端或者5端。3個(gè)研究小組分別從線蟲(chóng)、果蠅和Hela細(xì)胞中鑒定的100個(gè)新miRNAs中,有15%跨越線蟲(chóng)、果蠅和哺乳動(dòng)物基因組具有高度的保守性(只有有12個(gè)堿基的區(qū)別。Lau 和Bartel 實(shí)驗(yàn)室的同事更加認(rèn)為:所有的miRNAs可能在其他物種中具有直向同源物(Ortholog,指那些起源于同一祖先,在不同生物體中行使同一功能的基因群就可比作為一個(gè)門類,這些類似的基因被稱為“直向同源物”。Bantam 最早被認(rèn)為是果蠅中參與細(xì)胞增殖的一個(gè)基因位點(diǎn)。已知幾個(gè)包含增強(qiáng)子micro RNA micro RNA 的轉(zhuǎn)座子插入跨越這個(gè)位點(diǎn)的一段12.3kb區(qū)域會(huì)導(dǎo)致果蠅的眼和翅重復(fù)生長(zhǎng),而由轉(zhuǎn)座子

7、介導(dǎo)的一段跨越該位點(diǎn)的23kb片斷缺失則導(dǎo)致突變果蠅個(gè)體小于野生型果蠅。Cohen和同事用一段3.85kb的片斷導(dǎo)入21kb片斷缺失的果蠅中使其恢復(fù)原來(lái)的大小。但是奇怪的是表達(dá)這個(gè)3.85kb片斷中的EST卻沒(méi)有同樣的效果。Cohen將這個(gè)片斷和瘧蚊Anopheles gambiae的同源序列進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)一段90bp的高度保守區(qū),經(jīng)過(guò)RNA folding program (mfold發(fā)現(xiàn)這個(gè)保守序列可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),使得這個(gè)區(qū)段很象是一個(gè)miRNA的前體。這個(gè)結(jié)果經(jīng)過(guò)Northern blot證實(shí)突變果蠅的幼體缺少一個(gè)21bp的bantam miRNA ,用這個(gè)90bp的mRNA前體經(jīng)過(guò)一

8、系列的“功能缺失”“功能恢復(fù)”實(shí)驗(yàn),證實(shí)bantam miRNA在細(xì)胞增殖中的作用。研究人員用計(jì)算機(jī)程序檢索在hid mRNA的3非編碼區(qū)找到了bantam的3個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)(hid是果蠅中一個(gè)誘導(dǎo)凋亡的基因,并證實(shí)bantam miRNA抑制hid 的翻譯而非轉(zhuǎn)錄。miRNAs的表達(dá)方式各不相同。部分線蟲(chóng)和果蠅的miRNA在各個(gè)發(fā)育階段的全部細(xì)胞中都有表達(dá),而其他的miRNA則依據(jù)某種更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)奈幌嗪蜁r(shí)相的表達(dá)模式(a more restricted spatial and temporal expression pattern在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA 的水平有顯著差異。功能科

9、學(xué)家開(kāi)始認(rèn)識(shí)到這些普遍存在的小分子在真核基因表達(dá)調(diào)控中有著廣泛的作用。在線蟲(chóng),果蠅,小鼠和人等物種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的數(shù)百個(gè)miRNAs中的多數(shù)具有和其他參與調(diào)控基因表達(dá)的分子一樣的特征在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異,這種miRNAs表達(dá)模式具有分化的位相性和時(shí)序性(differential spatial and temporal expression patterns,提示miRNAs有可能作為參與調(diào)控基因表達(dá)的分子,因而具有重要意義。第一個(gè)被確認(rèn)的miRNA在線蟲(chóng)中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4和let-7,可以通過(guò)部分互補(bǔ)結(jié)合到目的mRNA靶的3非編碼區(qū)(3UTRs,以一種未知方式

10、誘發(fā)蛋白質(zhì)翻譯抑制,進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)合成,通過(guò)調(diào)控一組關(guān)鍵mRNAs的翻譯從而調(diào)控線蟲(chóng)發(fā)育進(jìn)程(reviewed in Pasquinelli 2002。bantam miRNA是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)有原癌基因作用的miRNA。除了lin-4、let-7,已知還有一些miRNAs可能參與在細(xì)胞分化和組織發(fā)育過(guò)程中起重要作用的基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,例如mir-14、mir-23 等。在植物miRNAs的研究中有兩條線索提示miRNAs可能參與植物的發(fā)育過(guò)程。一是在carpel factory (car 突變株中3個(gè)miRNAs的表達(dá)水平顯著下降。CARPEL FACTORY 是一個(gè)類似Dicer的酶,參與植物

11、的發(fā)育,其缺失突變株表現(xiàn)為胚胎和葉片發(fā)育的缺陷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示這種缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。多數(shù)的植物miRNAs在某些特定組織中高水平表達(dá)也提示他們可能參與了植物組織的發(fā)育。對(duì)一部分miRNAs的研究分析提示:miRNAs參與生命過(guò)程中一系列的重要進(jìn)程,包括早期發(fā)育(Reinhart 2000,細(xì)胞增殖,細(xì)胞凋亡,細(xì)胞死亡(Brennecke 2003,脂肪代謝(Xu 2003和細(xì)胞分化(Kawasaki 2003。此外,一個(gè)研究表明,2個(gè)miRNAs水平的下降和慢性淋巴細(xì)胞白血病之間的顯著相關(guān),提示miRNAs和癌癥之間可能有潛在的關(guān)系(Calin 2002。由于miRNAs存

12、在的廣泛性和多樣性,提示miRNAs可能有非常廣泛多樣的生物功能。盡管對(duì)miRNA的研究還處于初級(jí)階段,據(jù)推測(cè)miRNAs在高級(jí)真核生物體內(nèi)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用可能和轉(zhuǎn)錄因子一樣重要。有一種看法是:miRNAs可能代表在一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的層次上的基因表達(dá)調(diào)控方式。然而,大多數(shù)miRNAs的功能仍然是個(gè)謎。MicroRNA的過(guò)表達(dá)MicroRNA存在多種形式,最原始的是pri-miRNA ,長(zhǎng)度大約為300-1000個(gè)堿基pri-miRNA經(jīng)過(guò)一次加工后,成為pre-miRNA 即microRNA前體,長(zhǎng)度大約為70-90個(gè)堿基;pre-miRNA再經(jīng)過(guò)Dicer酶酶切后,成為長(zhǎng)約20-24nt的成熟

13、miRNA 。實(shí)際研究中,pre-miRNA應(yīng)用最早,也最廣泛,目前很多商業(yè)化的MicroRNA庫(kù)都是pre-miRNA形式的。近幾年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)microRNA的雙臂對(duì)成熟miRNA的形成有著十分重要的作用,所以天然的pri-miRNA形式越來(lái)越多地被研究者采用。MicroRNA的下調(diào)贏潤(rùn)生物可以提供化學(xué)合成的miRNA inhibitors ,用于下調(diào)目的細(xì)胞中的miRNA ,以實(shí)現(xiàn)loss-of function研究。如果您需要進(jìn)行長(zhǎng)期、穩(wěn)定的miRNA下調(diào),則可以選用贏潤(rùn)生物構(gòu)建的載體形式的miRNA inhibitor。其轉(zhuǎn)染效率高,下調(diào)效果好,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目的miRNA的長(zhǎng)期、穩(wěn)定的

14、下調(diào)。贏潤(rùn)生物載體形式的miRNA inhibitor,采用的是miRNA sponge法,這也是目前SCI文獻(xiàn)中用的較多的一種方法。作用方式microRNA-RISC對(duì)靶基因mRNA的作用一直主要取決于它與靶基因轉(zhuǎn)錄體序列互補(bǔ)的程度,有三種方式。第一種是切斷靶基因的mRNA分子miRNA與靶基因完全互補(bǔ)結(jié)合,作用方式和功能與siRNA非常相似,最后切割靶mRNA。在植物中,大部分miRNA都以這種方式,靶基因mRNA斷裂后,無(wú)poly(A的分子的3端加上多個(gè)U并很快降解,含poly(A的分子能穩(wěn)定存在一段時(shí)間(如擬南芥miR-171。在植物中目前有一個(gè)miRNA和3個(gè)潛在的目標(biāo)靶基因完全互補(bǔ)

15、(這些scarecrow 基因編碼潛在的轉(zhuǎn)錄因子,盡管還不清楚這些基因是否就是miRNA的目標(biāo)靶,這仍是第一次發(fā)現(xiàn)miRNA 和其潛在的目標(biāo)靶完全互補(bǔ),也提示miRNA可能包含和siRNA類似的作用方式。第二種是抑制靶基因的翻譯作用時(shí)與靶基因不完全互補(bǔ)結(jié)合,進(jìn)而阻遏翻譯而不影響mRNA的穩(wěn)定性,這種miRNA是目前發(fā)現(xiàn)最多的種類(如線蟲(chóng)lin-4。而在植物中極少數(shù)的miRNA通過(guò)此方式來(lái)抑制靶基因。第三種是結(jié)合抑制具有以上兩種作用模式:當(dāng)與靶基因互補(bǔ)結(jié)合時(shí),直接靶向切割mRNA;當(dāng)與靶基因不完全結(jié)合時(shí),起調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用。1識(shí)別方法多個(gè)研究小組采用生物化學(xué)結(jié)合是生物信息學(xué)的方法開(kāi)展對(duì)miRN

16、As的研究工作。由于據(jù)推測(cè)都是由Dicer酶降解RNA得到的,2123個(gè)堿基大小、有5端磷酸基和3羥基的RNA片斷,有的實(shí)驗(yàn)室采用改良的定向克隆方法來(lái)篩選具有相同特征的小分子篩選一定大小的RNA分子,連接到3和5的適配子(adapters,逆轉(zhuǎn)錄并通過(guò)PCR擴(kuò)增、亞克隆并測(cè)序。miRNA前體在基因組上的定位和聚類是通過(guò)向基因組數(shù)據(jù)庫(kù)查詢進(jìn)行。這個(gè)方法有助于判斷miRNAs是否是mRNAs、tRNAs、rRNAs等分子的降解產(chǎn)物。有的實(shí)驗(yàn)室通過(guò)一種RNA folding program mfold來(lái)判斷C. elegans 和C. briggsae 之間的高度保守區(qū)域是否含有潛在的miRNA前體

17、,然后用Northern Blots的方法來(lái)確定這些miRNAs是否真的表達(dá)了。盡管有數(shù)百個(gè)miRNAs通過(guò)生化或者是生物信息學(xué)的方法被鑒別出來(lái),已經(jīng)鑒別出來(lái)的miRNAs只不過(guò)是滄海一粟,由于很多已經(jīng)鑒別出來(lái)的miRNAs是從單個(gè)克隆中鑒別出來(lái)的,所以可以假設(shè)還有很多miRNAs在分離和鑒定過(guò)程中被“漏掉”了,測(cè)序工作還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。siRNAmiRNA和siRNA之間的關(guān)系令人迷惑。從表面上說(shuō),一個(gè)是非編碼的單鏈小分子RNA,在進(jìn)化上高度保守,通過(guò)翻譯抑制調(diào)控基因表達(dá);另一個(gè)是針對(duì)編碼區(qū)的雙鏈小分子RNA,每個(gè)轉(zhuǎn)錄本都可能有很多個(gè)siRNAs,是通過(guò)降解目標(biāo)靶,在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)。由于每個(gè)m

18、RNA模版可能產(chǎn)生很多個(gè)siRNAs,要給每個(gè)siRNA定一個(gè)基因的名字就很困難。miRNA是進(jìn)化進(jìn)程中高度保守的,因此給直向同源物一個(gè)同樣的名字可能有助于了解他們的功能,而給另一個(gè)物種中一段無(wú)關(guān)的序列一個(gè)同樣的名字就容易造成混亂。然而,據(jù)推測(cè)miRNAs通常是由較大的(70­90 nt的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體經(jīng)Dicer 酶切割得到的,而Dicer同樣負(fù)責(zé)將長(zhǎng)雙鏈RNA切割為siRNA,而且二者的長(zhǎng)度也差不多,同樣有調(diào)控基因表達(dá)功能。因而這兩類小分子RNA之間的關(guān)系格外令人關(guān)注。兩個(gè)廣為人知的miRNA在線蟲(chóng)中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4 和let-7,通過(guò)一種未知方式誘發(fā)蛋白質(zhì)翻譯抑制從

19、而抑制蛋白質(zhì)合成。這種結(jié)合并不誘導(dǎo)mRNA靶的降解,就是說(shuō)作為翻譯抑制子本身不影響對(duì)應(yīng)mRNA的豐度,其原因據(jù)推測(cè)是由于miRNA和結(jié)合位點(diǎn)之間不完全互補(bǔ)。這就區(qū)別于siRNA的介導(dǎo)的mRNA的降解。但是其他一些miRNAs可能以類似siRNA的方式介導(dǎo)目的RNA的降解。實(shí)驗(yàn)表明引入和let-7目的mRNA靶完全互補(bǔ)的miRNA 會(huì)誘導(dǎo)mRNA靶的降解。還有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明一些miRNA,包括在植物中發(fā)現(xiàn)的Scarecrow miRNA,能結(jié)合完全互補(bǔ)的mRNA鏈從而降解mRNA序列,抑制蛋白合成。這提示miRNAs 可以和siRNAs一樣作用,這兩種小分子RNA作用通路可能有重疊的部分。這種重疊

20、同樣提示siRNAs可能也有和miRNAs同樣的功能。一個(gè)很有趣的實(shí)驗(yàn)證實(shí)這個(gè)觀點(diǎn):Doench和同事挑選一個(gè)已知在體內(nèi)可以有效使CXCR4基因沉默的siRNA,然后在熒光素酶報(bào)告基因的3端插入對(duì)應(yīng)的CXCR4結(jié)合位點(diǎn)其中一個(gè)拷貝是插入一個(gè)完全匹配的CXCR4結(jié)合位點(diǎn),另一個(gè)拷貝插入4個(gè)只有3和5端匹配,而中間不同的CXCR4結(jié)合位點(diǎn),這樣選定的siRNA就不能完全結(jié)合到這個(gè)結(jié)合位點(diǎn)中間形成一個(gè)突起的不匹配的環(huán)。將這兩個(gè)拷貝轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞并用siRNA誘導(dǎo)基因沉默。結(jié)果很有趣兩個(gè)實(shí)驗(yàn)都錄得熒光素酶活性下降了超過(guò)10倍,RT-PCR和Northern分析證實(shí),第一個(gè)實(shí)驗(yàn)的熒光素酶轉(zhuǎn)錄本下降了超

21、過(guò)10倍,這正是正常的siRNA 介導(dǎo)的RNAi反應(yīng),目標(biāo)靶mRNA降解導(dǎo)致表達(dá)水平的下降,而第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中熒光素酶轉(zhuǎn)錄本僅僅下降1.2倍,這種目的基因表達(dá)水平下看起來(lái)象源于miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制降,而不是siRNA介導(dǎo)的影響mRNA的穩(wěn)定性導(dǎo)致。實(shí)驗(yàn)表明:siRNA可能以miRNA的方式作用于mRNA。實(shí)驗(yàn)人員還進(jìn)行了另一個(gè)實(shí)驗(yàn):改變第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中的不匹配環(huán)的堿基序列看起來(lái)不影響抑制效果,但是siRNA和報(bào)告基因上的結(jié)合位點(diǎn)的匹配程度越高抑制效果越好,增加siRNA的量,抑制效果越好這一點(diǎn)和siRNA抑制的情況一樣唯一不同的是:完全匹配的結(jié)合位點(diǎn)(siRNA作用方式可以單獨(dú)起作用而相互不影響,

22、而增加不完全配對(duì)的結(jié)合位點(diǎn)(注意在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中用了4個(gè)CXCR4結(jié)合位點(diǎn)的個(gè)數(shù)對(duì)翻譯抑制有顯著的加乘作用。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中還沒(méi)有找到內(nèi)源的siRNA,外源的siRNA介導(dǎo)的RNAi作用正是一種抵御機(jī)制。而miRNAs則廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,從理論上推測(cè)可能參與多種調(diào)控作用。這兩種小東西的作用機(jī)制和相互關(guān)系的本質(zhì)就顯得更加撲朔迷離。如何在實(shí)驗(yàn)中正確鑒定siRNA和miRNA,甚至是其他的小分子RNA都成為一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題。待解決問(wèn)題miRNAs在多個(gè)物種中廣泛被發(fā)現(xiàn),而且在進(jìn)化上高度保守。這些“小玩意兒”留給我們一大堆謎團(tuán):miRNA的確切功能是什么?它的目標(biāo)靶是什么?作用機(jī)制是什么?也許

23、需要對(duì)植物或者線蟲(chóng)的基因組進(jìn)行miRNAs突變株的篩選,在果蠅中可以用targeted-disruption 缺失miRNA序列。對(duì)miRNA突變株伴隨的表型缺失進(jìn)行研究,有助于解釋miRNAs的功能。正如Phillip Zamore說(shuō)的:“如果miRNAs在進(jìn)化的進(jìn)程中如此高度保守而沒(méi)有任何實(shí)際功能,那真是大自然拿科研人員開(kāi)涮而且是一個(gè)殘酷的玩笑”。研究工具隨著小分子RNA日益受到研究人員的重視,很多研究小分子RNA的新方法不斷推出。分離由于小分子RNA可能參與分化、發(fā)育、組織生長(zhǎng)、脂肪代謝等生理過(guò)程,在不同的組織和發(fā)育階段的表達(dá)水平有所不同,進(jìn)一步了解小分子RNA的生物功能需要確定其在各種

24、生物樣品中的表達(dá)水平,因而需要一種精確的定量純化方法,從而得到可信的數(shù)據(jù)。現(xiàn)行的RNA純化方法包括有機(jī)溶劑抽提+乙醇沉淀,或者是采用更加方便快捷的硅膠膜離心柱的方法來(lái)純化RNA。由于硅膠膜離心柱通常只富集較大分子的RNA(200nt以上,小分子RNA往往被淘汰掉,因而不適用于小分子RNA的分離純化。有機(jī)溶劑抽提能夠較好的保留小分子RNA,但是后繼的沉淀步驟比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力。mirVana miRNA Isolation Kit是采用玻璃纖維濾膜離心柱(glass fiber filter,GFF,既能夠有效富集10mer以上的RNA分子,又能夠兼?zhèn)潆x心柱快速離心純化的優(yōu)點(diǎn),是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。對(duì)于特

25、別稀有的分子,由于需要分離大量RNA而導(dǎo)致高背景而降低靈敏度,還可以進(jìn)一步富集10mer到200bp的小分子RNA來(lái)提高靈敏度。探針制備方法其實(shí)很簡(jiǎn)單:只需要準(zhǔn)備目的基因的一小段寡核苷酸序列,3端另外增加8個(gè)和T7啟動(dòng)子互補(bǔ)的堿基,將這段寡核苷酸和T7啟動(dòng)子引物退火,用Klenow大片斷補(bǔ)齊得到雙鏈的轉(zhuǎn)錄模版,然后用T7 RNA聚合酶、rNTP和標(biāo)記物混合,體外轉(zhuǎn)錄得到標(biāo)記的小分子RNA探針。這種方法可以快速制備各種標(biāo)記(同位素、非放射性標(biāo)記均可的小于100nt 的小分子RNA探針,適用于包括RPAs,Northerns 和原位雜交等各種方法檢測(cè)小分子核仁RNA( small nuclear

26、RNA,snRNA,small interfering RNA (siRNA,micro RNA (miRNA和mRNA。非放射性標(biāo)記的探針還可以用于原位雜交研究miRNA或者mRNA在組織中的分布。檢測(cè)由于小分子RNA是一類很小的分子,部分小分子RNA表達(dá)水平可能很低,因而需要極為靈敏而定量的分析工具。由于其分子很小,用RT-PCR的方法來(lái)定量研究非常困難,多數(shù)研究人員采用Northern Blots一種技術(shù)復(fù)雜而費(fèi)力的方法來(lái)檢測(cè)小分子RNA的存在。傳統(tǒng)的Northern Blot的方法是是用探針檢測(cè)固相支持物(膜上的目標(biāo)分子,由于用探針檢測(cè)液相中的目標(biāo)分子遠(yuǎn)比檢測(cè)固相中的目標(biāo)更為靈敏,生物

27、通在這里為大家推薦一種基于核酶保護(hù)分析方法改進(jìn)的新方法將同位素標(biāo)記好的小分子RNA探針和待檢測(cè)樣品混合雜交,未雜交的RNA和多余的探針用單鏈核酸酶消化,然后使核酸酶失活,并純化雜交的RNA分子,最后通過(guò)變性膠電泳放射自顯影檢測(cè)結(jié)果。這個(gè)基于液相雜交的新方法不但操作簡(jiǎn)單而快速,而且靈敏度極高可以半定量檢測(cè)少至10ng總RNA模版中的小分子RNA,或者說(shuō),可以檢測(cè)attomole (10-18 mol級(jí)別的靶目標(biāo)!靈敏度是Northern Blot的100倍。除此之外,研究人員還可以在同一個(gè)樣品中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)小分子RNA和長(zhǎng)的RNA模版。應(yīng)該說(shuō),這個(gè)靈活巧妙的設(shè)計(jì)可以為從事小分子RNA實(shí)驗(yàn)的研究人

28、員帶來(lái)不少方便?？偠灾?無(wú)論是siRNA, miRNA, snRNA還是其他的小東西,小分子RNA研究的不斷深入將幫助我們揭示更多生命的奧秘。功能分析miRNA 的上調(diào)可用于鑒定功能獲得表型;抑制或下調(diào)可以研究功能缺失表型。MicroRNA功能分析上調(diào)與下調(diào)的結(jié)合可用于鑒定被特定miRNA 調(diào)節(jié)的基因,以及特定miRNA 參與的細(xì)胞進(jìn)程。主應(yīng)用包括:miRNA 靶定位點(diǎn)的鑒定和驗(yàn)證篩選調(diào)節(jié)某個(gè)特定基因表達(dá)的miRNAs篩選影響某個(gè)特定細(xì)胞進(jìn)程的miRNAsmiRNA展望miRNA在細(xì)胞分化,生物發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮巨大作用,越來(lái)越多的引起研究人員的關(guān)注。隨著對(duì)于miRNA作用機(jī)理的進(jìn)

29、一步的深入研究,以及利用最新的例如miRNA芯片等高通量的技術(shù)手段對(duì)于miRNA和疾病之間的關(guān)系進(jìn)行研究,將會(huì)使人們對(duì)于高等真核生物基因表達(dá)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)理解提高到一個(gè)新的水平。這也將使miRNA可能成為疾病診斷的新的生物學(xué)標(biāo)記,還可能使得這一分子成為藥靶,或是模擬這一分子進(jìn)行新藥研發(fā),這將可能會(huì)給人類疾病的治療提供一種新的手段。第二代DNA測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序技術(shù)的核心思想是邊合成邊測(cè)序(Sequencing by Synthesis,即通過(guò)捕捉新合成的末端的標(biāo)記來(lái)確定DNA的序列,現(xiàn)有的技術(shù)平臺(tái)主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和A

30、pplied Biosystems SOLID system。概述術(shù)的基本原理、操作流程等方面?；驹鞩llumina/Solexa Genome Analyzer測(cè)序的基本原理是邊合成邊測(cè)序。在Sanger等測(cè)序方法的基礎(chǔ)上,通過(guò)技術(shù)創(chuàng)新,用不同顏色的熒光標(biāo)記四種不同的dNTP,當(dāng)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí),每添加一種dNTP就會(huì)釋放出不同的熒光,根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過(guò)特定的計(jì)算機(jī)軟件處理,從而獲得待測(cè)DNA的序列信息。操作流程1測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建(Library Construction首先準(zhǔn)備基因組DNA(雖然測(cè)序公司要求樣品量要達(dá)到200ng,但是Gnome Analyzer 系統(tǒng)所需的

31、樣品量可低至100ng,能應(yīng)用在很多樣品有限的實(shí)驗(yàn)中,然后將DNA隨機(jī)片段化成幾百堿基或更短的小片段,并在兩頭加上特定的接頭(Adaptor。如果是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,則文庫(kù)的構(gòu)建要相對(duì)麻煩些,RNA片段化之后需反轉(zhuǎn)成cDNA,然后加上接頭,或者先將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA,然后再片段化并加上接頭。片段的大小(Insert size對(duì)于后面的數(shù)據(jù)分析有影響,可根據(jù)需要來(lái)選擇。對(duì)于基因組測(cè)序來(lái)說(shuō),通常會(huì)選擇幾種不同的insert size,以便在組裝(Assembly的時(shí)候獲得更多的信息。2錨定橋接(Surface Attachment and Bridge AmplificationSolexa測(cè)序的反應(yīng)

32、在叫做flow cell的玻璃管中進(jìn)行,flow cell又被細(xì)分成8個(gè)Lane,每個(gè)Lane的內(nèi)表面有無(wú)數(shù)的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA 片段變性成單鏈后與測(cè)序通道上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu),以供后續(xù)的預(yù)擴(kuò)增使用。3預(yù)擴(kuò)增(Denaturation and Complete Amplification添加未標(biāo)記的dNTP 和普通Taq 酶進(jìn)行固相橋式PCR 擴(kuò)增,單鏈橋型待測(cè)片段被擴(kuò)增成為雙鏈橋型片段。通過(guò)變性,釋放出互補(bǔ)的單鏈,錨定到附近的固相表面。通過(guò)不斷循環(huán),將會(huì)在Flow cell 的固相表面上獲得上百萬(wàn)條成簇分布的雙鏈待測(cè)片段。4單堿基延伸測(cè)序(Single B

33、ase Extension and Sequencing在測(cè)序的flow cell中加入四種熒光標(biāo)記的dNTP 、DNA聚合酶以及接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增,在每一個(gè)測(cè)序簇延伸互補(bǔ)鏈時(shí),每加入一個(gè)被熒光標(biāo)記的dNTP就能釋放出相對(duì)應(yīng)的熒光,測(cè)序儀通過(guò)捕獲熒光信號(hào),并通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為測(cè)序峰,從而獲得待測(cè)片段的序列信息。從熒光信號(hào)獲取待測(cè)片段的序列信息的過(guò)程叫做Base Calling,Illumina公司Base Calling所用的軟件是Illuminas Genome Analyzer Sequencing Control Software and Pipeline Analysis So

34、ftware。讀長(zhǎng)會(huì)受到多個(gè)引起信號(hào)衰減的因素所影響,如熒光標(biāo)記的不完全切割。隨著讀長(zhǎng)的增加,錯(cuò)誤率也會(huì)隨之上升。5數(shù)據(jù)分析(Data Analyzing這一步嚴(yán)格來(lái)講不能算作測(cè)序操作流程的一部分,但是只有通過(guò)這一步前面的工作才顯得有意義。測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)是長(zhǎng)度只有幾十個(gè)堿基的序列,要通過(guò)生物信息學(xué)工具將這些短的序列組裝成長(zhǎng)的Contigs甚至是整個(gè)基因組的框架,或者把這些序列比對(duì)到已有的基因組或者相近物種基因組序列上,并進(jìn)一步分析得到有生物學(xué)意義的結(jié)果。正義鏈DNA上有編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列相反鏈核苷酸序列與正義鏈互補(bǔ)存在于:DNA或RNA結(jié)構(gòu)1、DNA上攜帶有編碼蛋白質(zhì)氨基酸信息的核苷酸序

35、列的鏈稱為正義鏈,又稱編碼鏈。另一條鏈核苷酸序列與正義鏈互補(bǔ),稱為反義鏈。反義基因是指與細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA序列相互補(bǔ)形成雜交體而阻斷或減弱其轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程的DNA或RNA片段。2、(二作用機(jī)制:兩條互補(bǔ)的DNA鏈其中一條攜帶編碼蛋白質(zhì)信息,稱為正義鏈,另一條與之互補(bǔ)的稱為反義鏈。3、1.反義核酸技術(shù):DNA或RNA結(jié)構(gòu)中含編碼序列的鏈被稱為正義鏈,與之相配對(duì)的鏈則叫做反義鏈。反義核酸(RNA和DNA是和它們的靶基因相互補(bǔ)的。4、siRNA雙鏈中和信使RNA(mRNA的靶向序列相同的鏈稱為正義鏈,與之互補(bǔ)的另一條鏈為反義鏈。siRNA包括5-磷酸末端、19nt的雙鏈區(qū)、3-羥基末端和2個(gè)不配對(duì)

36、的3端核苷酸突起,可指導(dǎo)mRNA的裂解。反義鏈基因的DNA雙鏈中,轉(zhuǎn)錄時(shí)作為mRNA合成模板的那條單鏈叫做模板鏈或反義鏈(template or antisense strand。概念反義鏈和有義鏈(sense strand在以前的概念和現(xiàn)今的使用之間存在有一些混亂,從概念上說(shuō)在基因的DNA雙鏈中,轉(zhuǎn)錄時(shí)作為mRNA合成模板的那條單鏈叫做模板鏈或反義鏈(template or antisense strand,而轉(zhuǎn)錄時(shí)不能作為mRNA合成模板的那條單鏈叫有義鏈,但為了使用上的方便,現(xiàn)今通常將mRNA看作是有義分子(sense molecule而將與mRNA 序列一致的DNA單鏈(假定DNA中的

37、T替代mRNA的U標(biāo)為有義鏈,在文獻(xiàn)中,這條與mRNA序列一致的DNA單鏈序列被用作基因序列。該序列的5端稱之為上游(upstream 3端稱之為下游(downstream。發(fā)現(xiàn)過(guò)程1961年,韋斯(Weiss等發(fā)現(xiàn)立體系統(tǒng)的雙鏈的DNA都可以作為模板,合成不同的RNA分子。馬默(Marmur在侵染枯草桿菌的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),DNA分子兩條鏈中只有一條具有轉(zhuǎn)錄功能,這條具有轉(zhuǎn)錄功能的鏈叫做模板鏈或反義鏈,另一條無(wú)轉(zhuǎn)錄功能的鏈叫做編碼鏈或有義鏈。應(yīng)該指出的是:在一條包含有若干基因的DNA分子中,各個(gè)基因的有義鏈,并不一定都在同一鏈上,也就是說(shuō),他們各自具有自己的有義鏈,即有的基因的有義鏈?zhǔn)?'

38、5'單鏈,有的基因的有義鏈則是5'3'單鏈。所以也可以說(shuō)DNA分子雙鏈中的一條鏈對(duì)某些基因來(lái)說(shuō)是有義鏈,而對(duì)另一些基因來(lái)說(shuō)則是反義鏈。siRNAsiRNA (Small interfering RNA,是一種小RNA分子(21-25核苷酸,由Dicer(RNAase 家族中對(duì)雙鏈RNA具有特異性的酶加工而成。SiRNA是siRISC的主要成員,激發(fā)與之互補(bǔ)的目標(biāo)mRNA的沉默。發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象是1990年由約根森(Jorgensen研究小組在研究查爾酮合成酶對(duì)花青素合成速度的影響時(shí)所發(fā)現(xiàn),為得到顏色更深的矮牽?；ǘ^(guò)量表達(dá)查爾酮合成酶,結(jié)果意外得到了白色和白紫雜色的矮

39、牽?；?并且過(guò)量表達(dá)查爾酮合成酶的矮牽?；ㄖ胁闋柾铣擅傅臐舛缺日０珷颗；ㄖ械臐舛鹊?0倍。約根森推測(cè)外源轉(zhuǎn)入的編碼查爾酮合成酶的基因同時(shí)抑制了花中內(nèi)源查爾酮合成酶基因的表達(dá)。1992年,羅馬諾(Romano和Macino也在粗糙鏈孢霉中發(fā)現(xiàn)了外源導(dǎo)入基因可以抑制具有同源序列的內(nèi)源基因的表達(dá)。1995年,Guo和Kemphues在線蟲(chóng)中也發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象。1998年,安德魯·法厄(Andrew Z. Fire等在秀麗隱桿線蟲(chóng)(C.elegans中進(jìn)行反義RNA抑制實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn),作為對(duì)照加入的雙鏈RNA相比正義或反義RNA顯示出了更強(qiáng)的抑制效果。從與靶mRNA的分子量比考慮,加入的

40、雙鏈RNA的抑制效果要強(qiáng)于理論上1:1配對(duì)時(shí)的抑制效果,因此推測(cè)在雙鏈RNA引導(dǎo)的抑制過(guò)程中存在某種擴(kuò)增效應(yīng)并且有某種酶活性參與其中。并且將這種現(xiàn)象命名為RNA干擾。2006年,安德魯·法厄與克雷格·梅洛(Craig C. Mello由于在RNAi機(jī)制研究中的貢獻(xiàn)獲得諾貝爾生理及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。原理RNA干涉(RNAi在實(shí)驗(yàn)室中是一種強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)工具,利用具有同源性的雙鏈RNA (dsRNA誘導(dǎo)序列特異的目標(biāo)基因的沉寂,迅速阻斷基因活性。siRNA在RNA沉默通路中起中心作用,是對(duì)特定信使RNA(mRNA進(jìn)行降解的指導(dǎo)要素。siRNA是RNAi途徑中的中間產(chǎn)物,是RNAi發(fā)揮效應(yīng)所必

41、需的因子。siRNA的形成主要由Dicer和Rde-1調(diào)控完成。由于RNA 病毒入侵、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄、基因組中反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄等原因,細(xì)胞中出現(xiàn)了dsRNA,Rde-1(RNAi缺陷基因-1編碼的蛋白質(zhì)識(shí)別外源dsRNA,當(dāng)dsRNA達(dá)到一定量的時(shí)候,Rde-1引導(dǎo)dsRNA與Rde-1編碼的Dicer(Dicer是一種RNaseIII 活性核酸內(nèi)切酶,具有四個(gè)結(jié)構(gòu)域:Argonaute家族的PAZ結(jié)構(gòu)域,III型RNA酶活性區(qū)域,dsRNA結(jié)合區(qū)域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性區(qū)結(jié)合,形成酶-dsRNA復(fù)合體。Dicer 切割后形成siRNA,然后,在A TP的參與下,細(xì)胞中存在的一種R

42、NA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體RNA-induced silencing complex RNAi干涉的關(guān)鍵步驟是組裝RISC和合成介導(dǎo)特異性反應(yīng)的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中,然后與靶標(biāo)基因編碼區(qū)或UTR區(qū)完全配對(duì),降解靶標(biāo)基因,因此說(shuō)siRNA只降解與其序列互補(bǔ)配對(duì)的mRNA。其調(diào)控的機(jī)制是通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)而沉默相應(yīng)靶位基因的表達(dá),所以是一種典型的負(fù)調(diào)控機(jī)制。siRNA識(shí)別靶序列是有高度特異性的,因?yàn)榻到馐紫仍谙鄬?duì)于siRNA來(lái)說(shuō)的中央位置發(fā)生,所以這些中央的堿基位點(diǎn)就顯得極為重要,一旦發(fā)生錯(cuò)配就會(huì)嚴(yán)重抑制RNAi的效應(yīng)。特點(diǎn)siRNA有如下特點(diǎn):1. 長(zhǎng)度約在22nt左右。2. 依賴Dic

43、er酶的加工,是Dicer的產(chǎn)物,所以具有Dicer產(chǎn)物的特點(diǎn)。3. 生成需要Argonaute家族蛋白存在。4. 是RISC組分。5. siRNA合成是由雙鏈的RNA或RNA前體形成的。6. siRNA一般是人工體外合成的,通過(guò)轉(zhuǎn)染進(jìn)入人體內(nèi),是RNA干涉的中間產(chǎn)物;植物體內(nèi)也存在內(nèi)源的siRNA。7. 結(jié)構(gòu)上,siRNA是雙鏈RNA。8. 在Dicer酶的加工過(guò)程中,siRNA對(duì)稱地來(lái)源于雙鏈RNA的前體的兩側(cè)臂。9. 在作用位置上,siRNA可作用于mRNA的任何部位,并與mRNA完全互補(bǔ)。10. 在作用方式上,siRNA只能導(dǎo)致靶標(biāo)基因的降解,即為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控。11. siRNA不參

44、與生物生長(zhǎng),是RNAi的產(chǎn)物,原始作用是抑制轉(zhuǎn)座子活性和病毒感染。設(shè)計(jì)問(wèn)題關(guān)于設(shè)計(jì)siRNA以及siRNA設(shè)計(jì)對(duì)siRNA功能的影響,還沒(méi)有可靠的規(guī)律。雖然可以通過(guò)對(duì)mRNA實(shí)驗(yàn)分析準(zhǔn)確的找到一段基因的全部siRNA最佳作用位置,但這個(gè)過(guò)程十分耗時(shí)且昂貴,不推薦常規(guī)實(shí)驗(yàn)使用。一種做法是每個(gè)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)3-4對(duì)siRNAs,實(shí)驗(yàn)選擇較有效的siRNA。siRNA設(shè)計(jì)大都根據(jù)Tuschl的實(shí)驗(yàn),要點(diǎn)如下:1.目標(biāo)基因開(kāi)放閱讀框起始密碼下游75至100堿基位置開(kāi)始,尋找“AA”二連序列后的19個(gè)堿基序列。(用非“AA”的“XY”序列后的19個(gè)堿基序列同樣可以得到很好效果的siRNA。設(shè)計(jì)siRNA時(shí)

45、不要針對(duì)5和3端的非編碼區(qū)。2.分析獲得的序列,選擇GC比在40-55%之間的靶基因序列作為優(yōu)選。3.將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(人,或者小鼠,大鼠等等進(jìn)行比較,排除和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST等。4.如果選擇shRNA,有報(bào)道顯示9個(gè)寡核苷酸的環(huán)是最有效的。下面是另一個(gè)設(shè)計(jì)的版本,大致相同:1. 從轉(zhuǎn)錄本(mRNA的AUG起始密碼開(kāi)始,尋找“AA”二連序列,并記下其3端的19個(gè)堿基序列,作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示GC含量在30%50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為效。Tuschl等建議在設(shè)計(jì)siRNA時(shí)不要針對(duì)5和3端的非編碼區(qū)(un

46、translated regions,UTRs,原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域,而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA 從而影響siRNA的效果。2. 將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(人,或者小鼠,大鼠等等進(jìn)行比較,排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST3. 選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA,以找到最有效的siRNA序列。負(fù)對(duì)照一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有負(fù)對(duì)照,作為負(fù)對(duì)照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成,但是和mRNA沒(méi)有明顯的同源性。通常的做法是將選中的

47、siRNA序列打亂,同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒(méi)有同源性。如果計(jì)劃合成siRNA,那么可以直接提供以AA打頭的21個(gè)堿基序列,廠家會(huì)合成一對(duì)互補(bǔ)的序列。注意的是通常合成的siRNA 是以3dTdT結(jié)尾,如果要UU結(jié)尾的話通常要特別說(shuō)明。有結(jié)果顯示,UU結(jié)尾和dTdT 結(jié)尾的siRNA在效果上沒(méi)有區(qū)別。因?yàn)檫@個(gè)突出端無(wú)需和靶序列互補(bǔ)。現(xiàn)在Qiagen公司的網(wǎng)站上有完整的siRNA 的設(shè)計(jì)方法,可以自動(dòng)設(shè)計(jì)并生成多個(gè)備選序列,并且可以自動(dòng)連接到基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索比對(duì)。制備體外制備1.化學(xué)合成許多國(guó)外公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點(diǎn)包括價(jià)格高,定制周期長(zhǎng),特別

48、是有特殊需求的。由于價(jià)格比其他方法高,為一個(gè)基因合成34對(duì)siRNAs 的成本就更高了,比較常見(jiàn)的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成。最適用于:已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下,需要大量siRNA進(jìn)行研究不適用于:篩選siRNA等長(zhǎng)時(shí)間的研究,主要原因是價(jià)格因素2.體外轉(zhuǎn)錄以DNA Oligo為模版,通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAs,成本相對(duì)化學(xué)合成法而言比較低,而且能夠比化學(xué)合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實(shí)驗(yàn)的規(guī)模受到限制,雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs,但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學(xué)合成相比,還是需要占用研究人員相當(dāng)?shù)臅r(shí)間。值得

49、一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs毒性小,穩(wěn)定性好,效率高,只需要化學(xué)合成的siRNA量的1/10就可以達(dá)到化學(xué)合成siRNA所能達(dá)到的效果,從而使轉(zhuǎn)染效率更高。最適用于:篩選siRNAs,特別是需要制備多種siRNAs,化學(xué)合成的價(jià)格成為障礙時(shí)。不適用于:實(shí)驗(yàn)需要大量的,一個(gè)特定的siRNA。長(zhǎng)期研究。3.用RNase III 消化長(zhǎng)片斷雙鏈RNA制備siRNA其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設(shè)計(jì)和檢驗(yàn)多個(gè)siRNA序列以便找到一個(gè)有效的siRNA。而用這種方法制備一份混合有各種siRNAs “混合雞尾酒”就可以避免這個(gè)缺陷。選擇通常是2001000堿基的靶mRNA模版,用體外轉(zhuǎn)錄的方法

50、制備長(zhǎng)片斷雙鏈dsRNA ,然后用RNase III (or Dicer 在體外消化,得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒(méi)有被消化的dsRNA后,這個(gè)siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞,方法和單一的siRNA 轉(zhuǎn)染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs,通常能夠保證目的基因被有效地抑制。dsRNA消化法的主要優(yōu)點(diǎn)在于可以跳過(guò)檢測(cè)和篩選有效siRNA序列的步驟,為研究人員節(jié)省時(shí)間和金錢(注意:通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜。不過(guò)這種方法的缺點(diǎn)也很明顯,就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默,特別是同源或者是密切相關(guān)的基因?，F(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況通常不會(huì)造成影響

51、。最適用于:快速而經(jīng)濟(jì)地研究某個(gè)基因功能缺失的表型不適用于:長(zhǎng)時(shí)間的研究項(xiàng)目,或者是需要一個(gè)特定的siRNA進(jìn)行研究,特別是基因治療體內(nèi)表達(dá)前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs,并且需要專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑將siRNAs 轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)。而采用siRNA表達(dá)載體和基于PCR的表達(dá)框架則屬于:從轉(zhuǎn)染到細(xì)胞的DNA 模版中在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到siRNAs。這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要直接操作RNA。4. siRNA表達(dá)載體多數(shù)的siRNA表達(dá)載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動(dòng)子(pol III中的一種,操縱一段小的發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。這三

52、類啟動(dòng)子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動(dòng)子和人H1啟動(dòng)子。之所以采用RNA pol III啟動(dòng)子是由于它可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子RNA,而且它是通過(guò)添加一串(3到6個(gè)U來(lái)終止轉(zhuǎn)錄的。要使用這類載體,需要訂購(gòu)2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈,退火,克隆到相應(yīng)載體的pol III 啟動(dòng)子下游。由于涉及到克隆,這個(gè)過(guò)程需要幾周甚至數(shù)月的時(shí)間,同時(shí)也需要經(jīng)過(guò)測(cè)序以保證克隆的序列是正確的。siRNA表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)行較長(zhǎng)期研究帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá),持續(xù)數(shù)星期甚至更久。病毒載體也可用于siRNA表達(dá),其優(yōu)勢(shì)在于可以直接高效率感染細(xì)胞進(jìn)行基因沉默的研

53、究,避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來(lái)的種種不便,而且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定。最適用于:已知一個(gè)有效的siRNA序列,需要維持較長(zhǎng)時(shí)間的基因沉默。不適用于:篩選siRNA序列(其實(shí)主要是指需要多個(gè)克隆和測(cè)序等較為費(fèi)時(shí)、繁瑣的工作。5. siRNA表達(dá)框架siRNA表達(dá)框架(siRNA expression cassettes,SECs是一種由PCR得到的siRNA表達(dá)模版,包括一個(gè)RNA pol III啟動(dòng)子,一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA,一個(gè)RNA pol III終止位點(diǎn),能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無(wú)需事前克隆到載體中。和siRNA表達(dá)載體不同的是,SECs不需要載體克隆、測(cè)序等頗為費(fèi)時(shí)的步驟,可以直接由PC

54、R得到,不用一天的時(shí)間。因此,SECs 成為篩選siRNA的最有效工具,甚至可以用來(lái)篩選在特定的研究體系中啟動(dòng)子和siRNA的最適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點(diǎn),那么通過(guò)SECs篩選出的最有效的siRNA后,可以直接克隆到載體中構(gòu)建siRNA表達(dá)載體。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達(dá)siRNA和長(zhǎng)效抑制的研究。這個(gè)方法的主要缺點(diǎn)是PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中(晶賽公司的Protocol可以解決這一問(wèn)題不能進(jìn)行序列測(cè)定,PCR和DNA合成時(shí)可能差生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致結(jié)果不理想。最適用于:篩選siRNA序列,在克隆到載體前篩選最佳啟動(dòng)子不適用于:長(zhǎng)期抑制研究。(如果克隆到載體后就可以了轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄

55、因子(Transcription factors ,TFs。真核生物轉(zhuǎn)錄起始十分復(fù)雜,往往需要多種蛋白因子的協(xié)助,轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體,共同參與轉(zhuǎn)錄起始的過(guò)程。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子的作用特點(diǎn)可分為二類;第一類為普遍轉(zhuǎn)錄因子,它們與RNA聚合酶共同組成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體時(shí),轉(zhuǎn)錄才能在正確的位置開(kāi)始。除TFD以外,還發(fā)現(xiàn)TFA,TFF,TFE,TFH等,它們?cè)谵D(zhuǎn)錄起始復(fù)合體組裝的不同階段起作用。第二類轉(zhuǎn)錄因子為組織細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子,這些TF是在特異的組織細(xì)胞或是受到一些類固醇激素生長(zhǎng)因子或其它刺激后,開(kāi)始表達(dá)某些特異蛋白質(zhì)分子時(shí),才需要的一類轉(zhuǎn)錄因子。簡(jiǎn)介RNA的轉(zhuǎn)錄合成從化學(xué)角度來(lái)講類

56、似于DNA的復(fù)制,多核苷酸鏈的合成都是以53的方向,在3-OH末端與加入的核苷酸磷酸二酯鍵,但是,由于復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的目的不同,轉(zhuǎn)錄又具有其特點(diǎn):(1對(duì)于一個(gè)基因組來(lái)說(shuō),轉(zhuǎn)錄只發(fā)生在一部分基因,而且每個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄都受到相對(duì)獨(dú)立的控制(圖17-2;(2轉(zhuǎn)錄是不對(duì)稱的。(3轉(zhuǎn)錄時(shí)不需要引物,而且RNA鏈的合成是連續(xù)的。RNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程定義轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor是一群能與基因5端上游特定序列專一性結(jié)合,從而保證目的基因以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。人類金屬硫基因調(diào)節(jié)區(qū)人類金屬硫基因調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)(transcription factor bi

57、nding site,TFBS是轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因表達(dá)時(shí),與基因模板鏈結(jié)合的區(qū)域。按照常識(shí),轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF的結(jié)合位點(diǎn)一般應(yīng)該分布在基因的前端,但是,新的研究發(fā)現(xiàn),人21和22號(hào)染色體上,只有22%的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分布在蛋白編碼基因的5'端。分類真核生物在轉(zhuǎn)錄時(shí)往往需要多種蛋白質(zhì)因子的協(xié)助。一種蛋白質(zhì)是不是轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)的一部分往往是通過(guò)體外系統(tǒng)看它是否是轉(zhuǎn)錄起始所必須的。一般可將這些轉(zhuǎn)錄所需的蛋白質(zhì)分為三大類:亞基RNA聚合酶的亞基,它們是轉(zhuǎn)錄必須的,但并不對(duì)某一啟動(dòng)子有特異性。復(fù)合物某些轉(zhuǎn)錄因子能與RNA聚合酶結(jié)合形成起始復(fù)合物,但不組成游離聚合酶

58、的成分。這些因子可能是所有啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄所必須的,但亦可能僅是譬如說(shuō)轉(zhuǎn)錄終止所必須的。但是,在這一類因子中,要嚴(yán)格區(qū)分開(kāi)哪些是RNA聚合酶的亞基,哪些僅是輔助因子,是很困難的。特異順序某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動(dòng)子中的特異順序結(jié)合。如果這些順序存在于啟動(dòng)子中,則這些順序因子是一般轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)的一部分。如果這些順序僅存在于某些種類的啟動(dòng)子中,則識(shí)別這些順序的因子也只是在這些特異啟動(dòng)子上起始轉(zhuǎn)錄必須的。黑腹果蠅的RNA聚合酶需要至少兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子方能在體外起始轉(zhuǎn)錄。其中一個(gè)是B因子,它與含TATA盒的部位結(jié)合。人的因子TFD亦和類似的部位結(jié)合。同樣,CTF(CAA T 結(jié)合因子則與腺病毒的主要晚期啟動(dòng)子中與CAA T盒同源的部位相結(jié)合。結(jié)合在上游區(qū)的另一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是USF(亦稱MLTF,則可以識(shí)別腺病毒晚期啟動(dòng)子中靠近-55的順序。轉(zhuǎn)錄因子Sp1則能和GC盒相結(jié)合。在SC40啟動(dòng)子中有多個(gè)GC盒,位于-70到-110之間。它們均能和Sp1相結(jié)合。然而含有GC盒的不同的DNA順序與Sp1的親和力卻各不相同?？梢?jiàn)GC盒兩側(cè)的順序?qū)p1-GC盒的結(jié)合究竟如何能影響轉(zhuǎn)錄。有時(shí)候需要幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子才能起始