免疫細胞功能檢測技術教學課件

1、免疫細胞功能檢測技術免疫細胞功能檢測技術一一 淋巴細胞的功能檢測淋巴細胞的功能檢測 淋巴細胞功能測定可分為體內實驗和體外淋巴細胞功能測定可分為體內實驗和體外實驗。體內實驗主要是間接了解淋巴細胞對實驗。體內實驗主要是間接了解淋巴細胞對抗原、半抗原或有絲分裂原的應答反應；體抗原、半抗原或有絲分裂原的應答反應；體外實驗主要包括淋巴細胞對抗原或有絲分裂外實驗主要包括淋巴細胞對抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應、細胞毒性試驗及淋巴原刺激后的增殖反應、細胞毒性試驗及淋巴細胞分泌產物的測定細胞分泌產物的測定 淋巴細胞淋巴細胞T T細胞（負責細胞免疫功能）細胞（負責細胞免疫功能）B B細胞（執(zhí)行體液免疫功能）細

2、胞（執(zhí)行體液免疫功能）NKNK細胞（非特異性免疫作用）細胞（非特異性免疫作用） 一、一、T細胞功能的檢測細胞功能的檢測T T細胞增殖試驗細胞增殖試驗T T細胞分泌功能測定細胞分泌功能測定T T細胞介導的細胞毒試驗細胞介導的細胞毒試驗體內試驗體內試驗（一）（一）T T淋巴細胞增殖試驗淋巴細胞增殖試驗1. 1. 原理：原理：淋巴細胞淋巴細胞DNADNA合成合成分化分化母細胞母細胞刺激物刺激物細胞變大細胞變大細胞漿擴大細胞漿擴大空泡空泡核仁明顯核仁明顯核染色質疏松核染色質疏松 未轉化和轉化淋巴細胞的形態(tài)特征未轉化和轉化淋巴細胞的形態(tài)特征轉化的淋巴細胞轉化的淋巴細胞未轉化的淋巴細未轉化的淋巴細胞胞淋巴

3、母細胞淋巴母細胞 過渡型過渡型細胞大小細胞大小( (直徑直徑m)m)12122020121216166 68 8核大小、染色質核大小、染色質增大、疏松增大、疏松增大、疏松增大、疏松不增大、密集不增大、密集核仁核仁清晰、清晰、1 14 4個個有或無有或無無無有絲分裂有絲分裂有或無有或無無無無無胞質、著色胞質、著色增多、嗜堿增多、嗜堿增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色極少、天青色漿內空泡漿內空泡有或無有或無有或無有或無無無2. 2. 淋巴細胞轉化的刺激物淋巴細胞轉化的刺激物非特異性刺激物：非特異性刺激物： PHA -TPHA -T細胞細胞 ConA -TConA -T細胞細胞 PWM -TPWM -

4、T、 B B細胞細胞 LPS -BLPS -B細胞細胞特異性刺激物：特異性刺激物： 異種抗原異種抗原 同種組織抗原同種組織抗原 3. 3. 檢測方法檢測方法 形態(tài)法：刺激物形態(tài)法：刺激物 淋巴細胞（淋巴細胞（4-64-6天）天） 母細胞化母細胞化 同位素法：同位素法：PHA PHA 淋巴細胞（淋巴細胞（54h54h） DNADNA合成期合成期 + + 3 3HTdRHTdR摻入摻入 收集細胞收集細胞 檢測檢測射線射線 測定細胞內的測定細胞內的3H3HTdRTdR（1 1）形態(tài)學檢查法）形態(tài)學檢查法%100胞數(shù)轉化和未轉化的淋巴細轉化的淋巴細胞數(shù)轉化率方法學評價：方法學評價：優(yōu)點：形態(tài)學方法簡便

5、易行，普通光優(yōu)點：形態(tài)學方法簡便易行，普通光學顯微鏡便能觀察結果，適于基層實驗學顯微鏡便能觀察結果，適于基層實驗室應用。室應用。缺點：是依靠肉眼觀察形態(tài)學變化，缺點：是依靠肉眼觀察形態(tài)學變化，判斷結果易受主觀因素影響，重復性和判斷結果易受主觀因素影響，重復性和準確性較差。準確性較差。 9、 人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2022-2-262022-2-26Saturday, February 26, 202210、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2022-2-262022-2-262022-2-262/26/2022 8:25:27 PM11、人總是珍惜為得到。2022-2-262022-2

6、-262022-2-26Feb-2226-Feb-2212、人亂于心，不寬余請。2022-2-262022-2-262022-2-26Saturday, February 26, 202213、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。2022-2-262022-2-262022-2-262022-2-262/26/202214、抱最大的希望，作最大的努力。2022年2月26日星期六2022-2-262022-2-262022-2-2615、一個人炫耀什么，說明他內心缺少什么。2022年2月2022-2-262022-2-262022-2-262/26/202216、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2022

7、-2-262022-2-26February 26, 202217、一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。2022-2-262022-2-262022-2-262022-2-26培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細胞全血分層液離心過濾測量放射性（2 2）3H-TdR3H-TdR摻入法摻入法優(yōu)點：優(yōu)點：3H-TdR3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性摻入法敏感性高，客觀性強，重復性好。強，重復性好。缺點：但需一定設備條件，同時還存在缺點：但需一定設備條件，同時還存在放射性核素污染問題。放射性核素污染問題。均值對照孔A均值試驗孔A570nm570nmSI 培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細胞全血分層液離心過濾

8、測量放射性MTT測吸光度(3) MTT (3) MTT 比色法比色法( (二二) T) T細胞分泌功能測定細胞分泌功能測定 體外培養(yǎng)的體外培養(yǎng)的T T細胞經各種絲裂原或抗原刺細胞經各種絲裂原或抗原刺激后激后, ,分泌各種細胞因子分泌各種細胞因子, ,可借助免疫學、細胞可借助免疫學、細胞生物學及分子生物學技術分別檢測細胞因子含生物學及分子生物學技術分別檢測細胞因子含量、生物學活性或基因表達水平，以反映量、生物學活性或基因表達水平，以反映T T細細胞功能。胞功能。 （三）（三）T T細胞介導的細胞毒試驗細胞介導的細胞毒試驗1.1.原理：原理：靶細胞抗原靶細胞抗原T T細胞細胞觀察殺傷活力觀察殺傷活

9、力致敏致敏CTLCTL靶細胞靶細胞形態(tài)學方法：淋巴細胞形態(tài)學方法：淋巴細胞+ +腫瘤細胞腫瘤細胞 計數(shù)計數(shù)殘留腫瘤細胞殘留腫瘤細胞2.2.方法方法意義：意義： 腫瘤患者腫瘤患者CTLCTL殺傷腫瘤細胞的能力殺傷腫瘤細胞的能力 圖圖15-2 T15-2 T細胞細胞毒試驗示意圖細胞細胞毒試驗示意圖靶細胞51Cr洗滌去除游離的51Cr效應細胞測量上清液中釋放的51Cr混合培養(yǎng)4-6小時5151CrCr釋放法釋放法( (四四) ) 體內試驗體內試驗特異性抗原皮膚試驗特異性抗原皮膚試驗PHAPHA皮膚試驗皮膚試驗 二、二、B細胞功能檢測細胞功能檢測B B細胞增殖能力的試驗細胞增殖能力的試驗溶血空斑試驗溶

10、血空斑試驗B B細胞抗體形成功能的檢測細胞抗體形成功能的檢測體內試驗體內試驗( (一一)B)B細胞增殖能力的試驗細胞增殖能力的試驗抗抗IgMIgM細菌脂多糖細菌脂多糖SACSAC的的SPASPAB B細胞增殖細胞增殖形態(tài)學形態(tài)學3 3H HTdRTdR摻入法摻入法( (二二) ) 溶血空斑試驗溶血空斑試驗1. 1. 原理：原理：2. 2. 方法學：方法學：經典溶血空斑形成試驗經典溶血空斑形成試驗被動溶血空斑試驗被動溶血空斑試驗 3 3臨床應用與評價臨床應用與評價溶血空斑試驗主要用于測定藥物和溶血空斑試驗主要用于測定藥物和手術等因素對體液免疫功能的影響手術等因素對體液免疫功能的影響評價免疫治療或

11、免疫重建后機體產評價免疫治療或免疫重建后機體產生抗體的能力。生抗體的能力。 ( (三三) ) B B細胞抗體形成功能的檢測細胞抗體形成功能的檢測 酶聯(lián)免疫斑點法酶聯(lián)免疫斑點法ELISPOTELISPOT1.原理：原理：2 2應用與方法學評價：應用與方法學評價：該方法既可檢測抗體分泌細胞，又可檢該方法既可檢測抗體分泌細胞，又可檢測抗體分泌量。測抗體分泌量。優(yōu)點：優(yōu)點：穩(wěn)定、特異、抗原用量少；穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時檢測不同抗原誘導的不同抗體分泌，并可定可同時檢測不同抗原誘導的不同抗體分泌，并可定量；可檢測組織切片中分泌抗體的單個細胞。量；可檢測組織切片中分泌抗體的單個細胞。( (四四) )

12、體內試驗體內試驗體內抗體產生的特異性抗原有白喉類毒素、體內抗體產生的特異性抗原有白喉類毒素、破傷風類毒素、多價肺炎鏈球菌菌苗等。破傷風類毒素、多價肺炎鏈球菌菌苗等。將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后前及免疫后1 1周、周、2 2周、周、3 3周分別采血，分離血周分別采血，分離血清，測定受檢者免疫前后相應抗體的效價，判清，測定受檢者免疫前后相應抗體的效價，判斷受檢者體內斷受檢者體內B B細胞的功能。細胞的功能。染色計數(shù)染色計數(shù)離心取上清離心取上清測測LDHLDH或或AKPAKP離心取沉淀離心取沉淀測活細胞熒光測活細胞熒光測發(fā)光強度測發(fā)光強度測測

13、CPMCPM值值形態(tài)法形態(tài)法酶釋法酶釋法熒光法熒光法同位素法同位素法化學發(fā)光法化學發(fā)光法三、三、NK細胞活性測定細胞活性測定靶靶細細胞胞溶溶解解常用靶細胞常用靶細胞: : K562細胞株二二 吞噬細胞功能檢測技術吞噬細胞功能檢測技術 按其形態(tài)大小分為兩類：按其形態(tài)大小分為兩類：大吞噬細胞大吞噬細胞單核單核- -吞噬細胞系統(tǒng)吞噬細胞系統(tǒng)小吞噬細胞小吞噬細胞中性粒細胞中性粒細胞一、中性粒細胞功能的檢測一、中性粒細胞功能的檢測 細胞趨化功能的檢測細胞趨化功能的檢測 吞噬和殺菌功能的檢測吞噬和殺菌功能的檢測( (一一) ) 細胞運動功能細胞運動功能趨化功能檢測趨化功能檢測1.1.原理：原理：2. 2.

14、 方法：方法： 瓊脂糖平板法瓊脂糖平板法 濾膜滲透法（濾膜滲透法（Boyden小室法）小室法）( (二二) )吞噬和殺菌功能測定吞噬和殺菌功能測定 1 1顯微鏡檢查法：顯微鏡檢查法：100(%)計數(shù)的白細胞數(shù)吞噬細菌的白細胞數(shù)吞噬率100(%)計數(shù)的白細胞數(shù)數(shù)胞內含著染菌體的細胞殺菌率2. 2. 溶菌法溶菌法100min0min9060301(%)）菌落數(shù)菌落數(shù)或、作用（殺菌率NBTNBT還原試驗還原試驗 原理：原理：N-N-C + H+N=N-R-N-NH2C N=NH四氮唑基（淡黃色）四氮唑基（淡黃色）甲臜（紫黑色）甲臜（紫黑色）3 3NBTNBT還原試驗還原試驗 中性粒細胞中性粒細胞NB

15、TNBT甲臜顆粒沉積于胞質中甲臜顆粒沉積于胞質中二、巨噬細胞功能檢測二、巨噬細胞功能檢測( (一一) )炭粒廓清試驗炭粒廓清試驗 正常小鼠肝中枯否細胞可吞噬清除正常小鼠肝中枯否細胞可吞噬清除90%90%炭粒，脾巨噬細胞約吞噬清除炭粒，脾巨噬細胞約吞噬清除10%10%炭粒。據炭粒。據此給小鼠定量靜脈注射印度墨汁此給小鼠定量靜脈注射印度墨汁( (炭粒懸液炭粒懸液) )，間隔一定時間反復取靜脈血，測定血中炭粒間隔一定時間反復取靜脈血，測定血中炭粒的濃度，根據血流中炭粒被廓清的速度，判的濃度，根據血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細胞的功能。斷巨噬細胞的功能。( (二二) )吞噬功能檢測吞噬功能檢測 巨

16、噬細胞對顆粒性抗原物質具有很強的巨噬細胞對顆粒性抗原物質具有很強的吞噬功能，常用雞紅細胞吞噬功能，常用雞紅細胞(CRBC)(CRBC)、白色念珠、白色念珠菌、酵母細胞等作為吞噬顆粒，用斑蟊敷貼菌、酵母細胞等作為吞噬顆粒，用斑蟊敷貼法收集人巨噬細胞或從腹腔滲出液獲得鼠巨法收集人巨噬細胞或從腹腔滲出液獲得鼠巨噬細胞。噬細胞。 ( (三三) )巨噬細胞溶酶體酶的測定巨噬細胞溶酶體酶的測定1 1酸性磷酸酶的測定酸性磷酸酶的測定 硝酸鉛法硝酸鉛法 偶氮法偶氮法2 2非特異性酯酶的測定非特異性酯酶的測定 常用常用-萘醋酸法萘醋酸法( (四四) ) 細胞毒作用測定細胞毒作用測定 用用IFN-IFN-激活小鼠

17、巨噬細胞，觀察其激活小鼠巨噬細胞，觀察其對對125125I-UdRI-UdR標記的標記的DBA/2DBA/2小鼠肥大細胞瘤小鼠肥大細胞瘤P815P815的殺傷活性。的殺傷活性。( (五五) ) 巨噬細胞促凝血活性測定巨噬細胞促凝血活性測定 激活的巨噬細胞可產生一種與膜結合激活的巨噬細胞可產生一種與膜結合的凝血活性因子，加速正常血漿的凝固，的凝血活性因子，加速正常血漿的凝固，為此取已經為此取已經3737預溫的正常兔血漿和預溫的正常兔血漿和CaClCaCl2 2混合液，加入經粘附有單層巨噬細胞的試混合液，加入經粘附有單層巨噬細胞的試管中，移置管中，移置3737，即時記錄血漿凝固時間。，即時記錄血漿

18、凝固時間。Thanks！9、 人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。22.2.2622.2.26Saturday, February 26, 202210、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。*2/26/2022 8:25:28 PM11、人總是珍惜為得到。22.2.26*Feb-2226-Feb-2212、人亂于心，不寬余請。*Saturday, February 26, 202213、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。22.2.2622.2.26*February 26, 202214、抱最大的希望，作最大的努力。2022年2月26日星期六*22.2.2615、一個人炫耀什么，說明他內心缺少什么。2022年2月*22.2.26*February 26, 202216、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。*2/26/2