禽流感病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

1、禽流感病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展         08-12-20 14:17:00     作者：胡曉紅，彭惠民，劉昕    編輯：studa20關(guān)鍵詞禽流感病毒；檢測(cè)技術(shù)； 禽流行性感冒病毒簡(jiǎn)稱禽流感病毒(AIV)，屬于正粘病毒科、流感病毒屬。流感病毒根據(jù)可溶性抗原不同可分為A、B、C 型，只有 A 型(AIV)易變異1，并可在禽、人、豬、馬和海洋哺乳動(dòng)物中暴發(fā)流行，出現(xiàn)輕度呼吸疾病到嚴(yán)重?cái)⊙Y等。1878 年 AIV 在意大利首次暴發(fā)，

2、其后在英、法、德等歐洲國(guó)家和美國(guó)均有流行。高致病性 AIV H5N1 于 1997 年在香港致 6 人死亡，20032004 年在亞洲致 4 人死亡，2003 年 H7N7 在荷蘭致 人死亡2。AIV 給人類健康已帶來嚴(yán)重威脅，引起全球的極大關(guān)注，AIV 檢測(cè)技術(shù)也隨之成為人們研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)就近年來 AIV檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展作一綜述。1  病原學(xué)檢測(cè)雞胚分離培養(yǎng)是檢測(cè)病禽組織中AIV的一種經(jīng)典、準(zhǔn)確、敏感的病原學(xué)診斷方法，可以作為金標(biāo)準(zhǔn)，特異性和敏感度均可以達(dá)到100%2。2  血清學(xué)檢測(cè)21  病毒中和試驗(yàn)（NT） 作為經(jīng)典方法，病毒中和實(shí)驗(yàn)操作繁瑣、耗時(shí)、費(fèi)料，

3、臨床幾乎不用。22  血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)AIV 能夠與雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集現(xiàn)象，這種紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象又可被特異性免疫血清所抑制，即紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)。血凝和血凝抑制試驗(yàn)可以鑒定病毒、檢測(cè)血清中的抗體水平。用抗不同血凝素的抗血清，由血凝抑制試驗(yàn)來確定HA亞型。23  神經(jīng)氨酸酶抑制（NI）試驗(yàn)微量神經(jīng)氨酸酶（NA）抑制劑抑制NA的活性，并以半抑制濃度IC50鑒定NA亞型。Hurt等3用5mg的抗病毒藥物zanamivir建立的熒光NI試驗(yàn)，檢測(cè)陽(yáng)性樣本H1N1、H1N2，符合率分別為N1 955%，N2 897%，平均935%（187/200）。該方法成本低，適于大

4、規(guī)模地應(yīng)用。24  瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP） 用于檢測(cè)AIV共同抗原核蛋白或基質(zhì)蛋白。由于所有的AIV 都具有型特異性共同抗原，用一種AIV的抗原或抗血清就可對(duì)所有AIV 的抗體或抗原進(jìn)行鑒定。免疫雙向擴(kuò)散及免疫電泳中以沉淀線判定可以定性，免疫單輻射擴(kuò)散試驗(yàn)可以定量。25  免疫熒光技術(shù)(IFT) 將抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，再進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。最早用于流感病毒是鑒定和定位病毒感染細(xì)胞中特異性的抗原、核蛋白(NP)或基質(zhì)蛋白(MP)抗原。用NP抗原的熒光抗體染色，主要出現(xiàn)核內(nèi)熒光；用MP抗原的熒光抗體主要出現(xiàn)胞質(zhì)熒光，核內(nèi)也可出現(xiàn)部分熒光。26  酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

5、(ELISA) 運(yùn)用ELISA原理建立的AIV檢測(cè)方法較多，如用單克隆抗體介導(dǎo)的、經(jīng)生物素一親和素系統(tǒng)放大的H5亞型禽流感病毒捕獲ELISA檢測(cè)方法，為進(jìn)一步研究檢測(cè)試劑盒提供基礎(chǔ)4。AIV抗體膠體金檢測(cè)試紙條則是膠體金免疫層析分析法，用純化病毒與膠體金顆粒偶聯(lián)，吸附在玻璃纖維上制作而成，不需要其他試劑,一步完成,反應(yīng)時(shí)間只需要幾分鐘(510min)，是一種檢測(cè)微量AIV抗體快速、簡(jiǎn)便的方法5。鄭其升等6用基因工程重組HA蛋白作為抗原建立了檢測(cè)AIV 抗體的間接ELISA方法，可以檢測(cè)H3、H5、H7、H9亞型血清，特異性高，與傳統(tǒng)HI方法比較，符合率為 971%（774/807）。基于重組H

6、A蛋白的間接ELISA方法可望用于AIV的保護(hù)性抗體水平檢測(cè)。3  單鏈構(gòu)型多態(tài)性(SSCP) 作為檢測(cè)基因變異的手段已得到廣泛應(yīng)用，其原理是單個(gè)核苷酸的置換引起DNA單鏈構(gòu)象改變,在非變性電泳中足以導(dǎo)致泳動(dòng)率變化。Quinto等7用高通量 SSCP 與限制性片段長(zhǎng)度多性（RFLP）分析法對(duì)照，檢測(cè)了近50株流感病毒的400多個(gè)基因片段，符合率為98%。4  核酸擴(kuò)增方法41  RTPCR基于MP、NP 基因的高度保守區(qū)的引物，RTPCR可以鑒定AIV810。Lee等9在此基礎(chǔ)上針對(duì)H1H15又分別設(shè)計(jì)了15對(duì)HA基因的特異性引物，同時(shí)進(jìn)行15管RTPCR，可以檢

7、測(cè)H1H15的HA亞型，該法所測(cè)80株病毒樣品，與血清學(xué)方法符合率為100%。但單管單測(cè)，操作繁瑣。Phipps等11建立了相對(duì)簡(jiǎn)便的RTPCR的AIV檢測(cè)法，僅用一對(duì)引物擴(kuò)增出H1H15的HA2基因，產(chǎn)物由雙脫氧核酸鏈中止法測(cè)序分析，盲測(cè)12株標(biāo)準(zhǔn)病毒和30株樣品病毒，并與HI對(duì)照，完全相符。為提高擴(kuò)增的靈敏度和特異性，也可采用巢式或半巢式RTPCR8。42  多重RTPCR(mRTPCR)mRTRCR是在RTPCR基礎(chǔ)之上實(shí)現(xiàn)單管多檢的相對(duì)快速和經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法。 Malik等12建立的mRTPCR方法，檢測(cè)3種不同的鳥類呼吸道病毒，與單管單檢RTPCR方法結(jié)果完全相符。Yamad

8、a等13 建立了包括5對(duì)引物的mRTPCR體系，可鑒別5種亞型AIV。BellauPujol等14運(yùn)用多重半巢式RTPCR可以檢測(cè)包括AIV的12種呼吸道RNA病毒，使檢測(cè)范圍進(jìn)一步擴(kuò)展，其203個(gè)樣本與培養(yǎng)方法及直接免疫熒光法對(duì)照，綜合敏感度為98%。43  Realtime RTPCR(RRTPCR)運(yùn)用特異性的熒光水解探針的RRTPCR方法可使檢測(cè)時(shí)間縮短為4 h 10，15。Lee等10建立的檢測(cè)H5、H7亞型AIV的RRTPCR方法，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法比較，并以EID50（50%雞胚致病指數(shù)）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，呈正相關(guān)（r  = 0972），T 檢驗(yàn)無顯著差別（P >

9、;021）。其重復(fù)性試驗(yàn)呈正相關(guān)（r = 0902），靈敏度H5為1 fg或 10 RNA拷貝，H7為10-1 fg或10 RNA拷貝，所測(cè)病毒濃度均低于1010 EID50，該靈敏度高于培養(yǎng)方法。44  依賴核酸序列的擴(kuò)增（NASBA）NASBA是一種快速、等溫的RNA 擴(kuò)增技術(shù)，整個(gè)反應(yīng)有賴于AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、T7 RNA 多聚酶和核酸酶H(RNase H)共同協(xié)作而完成，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)，是以轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)，單鏈核苷酸的連續(xù)擴(kuò)增，其反應(yīng)產(chǎn)物是單鏈RNA。擴(kuò)增產(chǎn)物與磁珠上的捕捉探針及釕標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光寡核苷酸探針雜交后，形成復(fù)合物，經(jīng)NucliSens閱讀器直接檢測(cè)電化學(xué)發(fā)光

10、強(qiáng)度1617。Collins等16檢測(cè)了亞歐地區(qū)H5亞型AIV，同時(shí)還鑒別出高致病及低致病H5亞型。Lau 等17建立的NASBA技術(shù)可以檢測(cè)H1H15亞型的AIV，并能區(qū)分出H5及H7亞型，整個(gè)過程從核酸分離、擴(kuò)增、檢測(cè)在6 h 以內(nèi)，靈敏度與雞胚培養(yǎng)相當(dāng)。45  環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（loopmediated isothermal amplification, LAMP）    Poon等18介紹了一種新的更加簡(jiǎn)便的擴(kuò)增方法，即環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增,特異性地針對(duì)6個(gè)獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物擴(kuò)增，以看家基因或外源性RNA分子作為陽(yáng)性對(duì)照。由于反應(yīng)中產(chǎn)生大量焦

11、磷酸鎂，可以肉眼判斷結(jié)果，無需凝膠電泳。作者用該方法檢測(cè)了SARS病毒后，又檢測(cè)了H1H3的AIV，與常規(guī)方法比較符合率為100%。5  基因芯片將RTPCR獲得的cDNA固化于芯片，利用核酸探針技術(shù)構(gòu)建的檢測(cè)流感病毒A、B及其亞型的芯片平臺(tái)， Cy3、Cy5標(biāo)記的核酸探針與靶DNA雜交，可以進(jìn)一步鑒別混合體系中擴(kuò)增產(chǎn)物。Li等19用cDNA芯片及mRTPCR對(duì)流感病毒進(jìn)行檢測(cè)及分型，結(jié)果顯示cDNA芯片為基于PCR的診斷技術(shù)提供了補(bǔ)充，因?yàn)榛赑CR的方法，直接從DNA擴(kuò)增片段大小不足以證明是目的產(chǎn)物。王秀榮等20依據(jù)M蛋白進(jìn)行基因型別鑒定和HA基因亞型鑒定，用Cy5熒光標(biāo)記，在基因芯片平臺(tái)上構(gòu)建檢測(cè)H5、H7、H9亞型禽流感病毒(AIV)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)模型，檢測(cè)AIV的cDNA，雜交達(dá)到預(yù)期結(jié)果。Kessler等