腦缺血海馬透析自由基活性研究

1、    腦缺血海馬透析自由基活性研究        摘要目的研究腦反復(fù)缺血再灌流羥自由基活性動(dòng)態(tài)變化，探討腦缺血損傷的病理生理機(jī)制。方法采用Pulsinelli和Brierley4 血管關(guān)閉方法，5min×3次缺血，用微透析針植入右側(cè)海馬CA1區(qū)，用水楊酸鹽捕獲生成穩(wěn)定的加合物2，3和2，5二氧苯甲酸(2，3和2，5 DHBA)。用高壓液相(HPLC)電化學(xué)檢測(cè)。結(jié)果腹腔內(nèi)注射水楊酸鹽和微管透析針內(nèi)注射水楊酸鹽，2，3和2，5 DHBA出現(xiàn)相似變化。缺血期2，3和2

2、，5 DHBA稍降低，灌流20min顯著增高，灌流1h升高至頂峰，持續(xù)3h。證明腦反復(fù)缺血后再灌流羥自由基顯著增高，并且不是一個(gè)暫時(shí)的現(xiàn)象。結(jié)論自由基在腦缺血損害中起重要作用。關(guān)鍵詞腦缺血自由基透析海馬 Dynamic study on free radical activity in rat brain after ischemia and reperfusionJia Jianmin,Jia Jianping,Shen Yu,et al.Department of Neurology,First Municipal Hospital of Handan,Handan 056002Abstr

3、actObjectiveTo obtain direct evidence of oxygen radical activity,study on pathogenisis of cerebral ischemia. MethodsWe used chemical tripping of hydroxy1 radical in the form of the stable adducts 2,3- and 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA) following salicylate administration. Wistar rats were subjecte

4、d to 5min×3 of global forebrain ischemia by 4VO,salicylate was administered either systemically (200mg/kg,i.p.)or by continous infusion(5mM) through a microdialysis probe implanted in the hippocompus. DHBA were assayed by HPLC with electrochemical detection. ResultsFollowing systemic administra

5、tion of salicylate,stable baseline levels of HDBA were obeserved before ischemia a slightly reduction in mean levels of both DHBA was ducumented during ischemia. During recirculation,DHBA levels increased. It was peak for 1h. The increase in DHBA levels persisted for 3h. ConclusionThese results prov

6、ide evidence that hydroxyl radical levels are increased during postichomic recirculation.Key wordsCerebral ischemiaHydroxyl radicalMicrodialysisHippocampus腦缺血后神經(jīng)元損害有多種機(jī)理，興奮性氨基酸神經(jīng)毒性、單胺遞質(zhì)神經(jīng)毒性、離子通道改變、鈣超載、自由基反應(yīng)等作用機(jī)制介導(dǎo)神經(jīng)元死亡1，其中自由基介導(dǎo)神經(jīng)元死亡是一個(gè)最關(guān)鍵的作用2。缺血和隨之而來(lái)的再灌流為羥自由基生成提供了充足的條件。Siesjo提出自由基能夠攻擊膜脂質(zhì)、各種酶類和DNA，并產(chǎn)

7、生一系列有害的作用。Watanabe觀察到應(yīng)用各種自由基清除劑能有效保護(hù)腦細(xì)胞免受缺血死亡3。Kinouchi應(yīng)用基因轉(zhuǎn)換鼠，觀察到其局部腦缺血期間，能過(guò)度表達(dá)超氧化物歧化酶，進(jìn)而減輕腦水腫，縮小梗塞范圍。這些研究都提供了自由基損害的證據(jù)。在本實(shí)驗(yàn)中，用水楊酸鹽捕捉、腦內(nèi)微管透析的方法測(cè)定缺血和再灌流期間羥自由基。 應(yīng)用這個(gè)方法的原理是水楊酸鹽和羥自由基生成穩(wěn)定的加合物2，3和2，5二氧苯甲酸(2,3和2，5 DHBA)。海馬既是一個(gè)重要的記憶結(jié)構(gòu)，又是一個(gè)對(duì)缺血損傷極為敏感的腦區(qū)。采用海馬活體內(nèi)微管透析，高壓液相測(cè)定，動(dòng)態(tài)觀察缺血和再灌流期間自由基變化。1材料和方法412PO4，30mmol

8、枸櫞酸鈉，10mmol diethylamine-HCL(pH3.1),476mg辛烷磺酸鈉，CH3CN(30ml)和四氫呋喃15ml。流速1ml/min。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本文測(cè)定數(shù)值采用±s來(lái)表示，用t檢驗(yàn)和方差分析進(jìn)行顯著性測(cè)定。2結(jié)果2.1腹腔注射水楊酸鹽自由基測(cè)定結(jié)果2，3 DHBA基礎(chǔ)值已測(cè)定。缺血期為20.86±0.50pmol/ml，較基線稍低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。再灌流20min、30min、1h、2h、3h,2,3 DHBA增高，分別為基礎(chǔ)值的2倍、3倍、2.5倍、2倍、1.5倍，和缺血前相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，和假手

9、術(shù)組及單純對(duì)照組相比均顯著增高(P<0.01)。2，5 DHBA基礎(chǔ)值為60.12±0.65pmol/ml。缺血期為61.25±0.70pmol/ml，和基線相比,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。再灌流10min為80.70±0.66,比缺血前增高(P<0.05)。再灌流20min、30min、1h、2h、3h,2,5 DHBA顯著增高，分別為基礎(chǔ)值的2.3倍、3.3倍、4倍、2倍、1.6倍，和缺血前相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，和假手術(shù)組及單純對(duì)照組相比均顯著增高(P<0.01)。2.2經(jīng)過(guò)微透析針注入水楊酸鹽自由基測(cè)定結(jié)果2，3 DHBA基礎(chǔ)值為

10、30.16±0.15pmol/ml，缺血期為32.66±0.20pmol/ml,較基線稍高,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。再灌流10min時(shí)為40.10±0.65pmol/ml，和基礎(chǔ)值相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。再灌流20min、30min、1h、2h、3h,2,3 DHBA分別為基線的2倍、3倍、2.7倍、2.3倍和2倍。和缺血前相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),和假手術(shù)組及單純對(duì)照組相比均顯著增加(P<0.01)。2，5 DHBA基礎(chǔ)值為20.66±0.20pmol/ml，缺血前為22.36±0.

11、20pmol/ml，較基礎(chǔ)值稍增高，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。再灌流10min時(shí)為25.36±0.20pmol/ml，和基線相比無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。再灌流20min、30min、1h、2h、3h,2,5 DHBA增高，分別為基礎(chǔ)值的1.8倍、3倍、2.5倍、2倍和1.5倍。和缺血前相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),和假手術(shù)組及單純對(duì)照組相比均顯著增加(P<0.01)。3討論自由基又稱游離基，就是未配對(duì)電子的原子或原子團(tuán)。羥自由基即羥氧自由基(hydroxyl radical,OH.)，可以看作氧分子(O2）三電子還原的產(chǎn)物。羥自由基在其

12、氧原子上含有一個(gè)未配對(duì)的電子，故其奪取電子的能力很強(qiáng),是一個(gè)很強(qiáng)的氧化劑，可以發(fā)生電子轉(zhuǎn)移。OH.可以從獲得電子而變成OH-，并使變?yōu)镺2。OH.可以從多不飽和脂肪酸中奪取氫原子，形成多不飽和脂肪酸自由基，從而引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、羥基化等。羥自由基壽命很短，不易用ESR檢測(cè)，可以用化學(xué)捕捉方法。Hall等用Gerbil鼠腦反復(fù)缺血再灌流，檢測(cè)羥自由基增加，但他們僅僅測(cè)定2，5 DHBA含量的變化，由于2，5 DHBA也可反應(yīng)細(xì)胞色素P-450的活性，而2，3 DHBA含量的變化對(duì)羥自由基有高度的特異性，故本實(shí)驗(yàn)用腹腔注射水楊酸鹽和經(jīng)過(guò)微透析針注入水楊酸鹽，同時(shí)測(cè)定2，3和2，5 DHBA加合物

13、的含量，使結(jié)果更為可靠，結(jié)果表明2，3和2，5 DHBA兩種加合物出現(xiàn)相似的變化,且羥自由基的生成不是一個(gè)瞬間的現(xiàn)象，而是在缺血后要持續(xù)3h。這些結(jié)果和使用順磁向旋捕捉方法相一致5。在腦缺血神經(jīng)元損傷機(jī)制中，自由基和興奮性氨基酸可能形成惡性循環(huán)鏈。腦缺血期間，海馬細(xì)胞外液谷氨酸大量釋放，再灌流期細(xì)胞外液谷氨酸可迅速恢復(fù)正常。自由基在缺血期生成減少，而在再灌流期占統(tǒng)治地位。這些結(jié)果提示在腦缺血損害時(shí)，興奮性氨基酸和自由基相互作用?？赡苁枪劝彼岽罅酷尫牛せ罟劝彼崾荏w和發(fā)揮谷氨酸興奮性神經(jīng)毒作用，觸發(fā)了再灌流期自由基的生成。總之，實(shí)驗(yàn)證明全腦反復(fù)缺血后，羥自由基大量形成。說(shuō)明腦反復(fù)缺血后自由基損傷

14、起重要作用。本文為河北省科委重點(diǎn)資助項(xiàng)目(No 94216101D)作者單位：賈健民申玉賈琳056002邯鄲市第一醫(yī)院賈健平M.PollockOtago大學(xué)醫(yī)學(xué)院參考文獻(xiàn)1 Siesjo BK,Agardh CD,Bengtsson F. Free radicals and brain damage.Cerebrovasc Brain Metab Rev,1989,1:165.2 Abe K,Yuki S,Kogure K.Strong attenuation of ischemic and postischemic brain edema in rats by a novel free radical scavenger. Stroke,1988,19:480.3 Watson BD,Busto R,Golaberg WJ,et al. Lipid peroxidation in vivo induced by reversible global ischemia in rat brain. J Neuochem,1984,42:268.4 Dulsinelli W,Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the u