年執(zhí)業(yè)藥師藥學專業(yè)知識藥物分析部分教材考點

1、第五章 分光光度法v 分光光度法是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)的吸光度或發(fā)光強度，進行定性、定量分析的方法。§1. 紫外-可見分光光度法紫外光區(qū) 200-400 nm;可見光區(qū) 400-760 nm。紫外-可見吸收光譜：物質(zhì)吸收紫外和可見光區(qū)的電磁波而產(chǎn)生的吸收光譜躍遷：物質(zhì)分子的價電子吸收了光的能量，由低能量的基態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣芰康募ぐl(fā)態(tài)的過程。躍遷發(fā)生的條件：光子所提供的能量與躍遷所需能量相當。不同結構的物質(zhì)分子能級差不同，(吸收的能量不同)電子躍遷不同，可產(chǎn)生不同紫外-可見吸收光譜，可進行定性分析鑒別的依據(jù)。一、 基本原理1.光的吸收定律Lambert-Beer定律

2、 吸收光譜法的基本定律一定濃度范圍內(nèi)，一定條件下，被該物質(zhì)吸收的光量(吸光度A)與該物質(zhì)溶液的濃度(C)和液層厚度(L)成正比： 藥物定量測定的依據(jù) A = -lg ( I/I0 )= - lg T = ECL物質(zhì)分子對特定波長的光的吸收程度與分子的結構、溶液濃度、液層厚度(光路長度)有關。2.吸收系數(shù)1)A = ECL公式中，E為物質(zhì)的物理(特性)常數(shù)。E越大，說明物質(zhì)對某波長的光的吸收能力越強E®定性、定量依據(jù)。2)兩種表示方法：C單位為“mol/L” 時，E為摩爾吸收系數(shù)，用e 表示;當C用“g/100ml”為單位時，E為比吸收系數(shù)或百分吸收系數(shù)，用E1%1cm表示。3)E1%

3、1cm的物理意義：吸光物質(zhì)C為1% ，L為1cm時，在一定條件下(波長、溶劑、溫度一定)測得的吸光度A。二、紫外-可見分光光度計(一)基本結構：光源 紫外：氘燈或氫燈;可見: 鎢燈或鹵鎢燈單色器 色散元件(光柵或棱鏡);狹縫吸收池 紫外: 石英; 可見: 玻璃, 石英檢測器 光電池、光電管、光電倍增管、光二極管陣列檢測器數(shù)據(jù)記錄和處理(二)儀器的校正和檢定(1) 波長的校正 汞燈或氘燈的特定譜線為參照或鈥玻璃的特定波長(2)吸光度的準確度檢定 用重鉻酸鉀的硫酸溶液(3)雜散光的檢查 一般來源于光學儀器表面的瑕疵三、 吸光度的測定要求1. 溶劑 應符合規(guī)定2. 作空白試驗校正 目的：消除溶劑和吸

4、收池的影響3. 測定波長的檢查 一般以吸光度最大的波長 max為測定波長，吸收峰的波長應在該品種規(guī)定波長的±2%以內(nèi)，否則應考慮供試品的真?zhèn)巍⒓兌燃皟x器波長正確性。影響波長檢查結果的條件有：供試品的真?zhèn)闻c純度、溶劑的種類 、儀器波長的正確性4. 供試品溶液濃度 使吸光度在0.3-0.7范圍內(nèi)5. 儀器狹縫寬度的選擇 調(diào)至供試品溶液的吸光度不再增加為止四、應用(一)鑒別 中國藥典所采用方法：1. 核對吸收光譜的特征參數(shù)：最大吸收波長lmax，吸收系數(shù)E1%1cm;吸光度 A2. 比較吸光度比值： Al1 /Al2®El1/El23. 比較吸收光譜的一致性(二)雜質(zhì)檢查：依據(jù)：

5、藥物與雜質(zhì)的結構不同，故吸收光譜也不同。1. 藥物在紫外可見光區(qū)沒有明顯吸收，所含雜質(zhì)有較強吸收¾¾少量雜質(zhì)可用光譜檢索出來。2. 藥物有較強吸收;雜質(zhì)無吸收或很弱¾E(e)¯ 或雜質(zhì)有更強吸收¾¾ E(e)規(guī)定吸光度的上下限可在一定程度上控制雜質(zhì)的量(三)含量測定：紫外分光光度法用于含量測定的方法有三種：前三種方法(1)對照品比較法： AR/AX=ECRL / ECXL =CR/ CX Þ CX=(AX/AR)CRÞ供試品溶液與對照品溶液濃度C及測定條件應一致，E、L相等(2)吸收系數(shù)法(絕對法)： A=E1%1

6、cm CL ÞC=A/(E1%1cmL)對儀器須進行嚴格的校正和檢定(波長的準確度、狹縫寬度符合要求)，否則影響準確度(3)計算分光光度法 如雙波長分光光度法、導數(shù)光普法主要用于消除樣品中干擾組分的干擾(4)比色法(屬于可見分光光度法) 顯色劑顯色后測定§2. 熒光分析法一、基本原理(一)熒光的產(chǎn)生：某些物質(zhì)受紫外光或可見光照射激發(fā)后，能發(fā)射出比激發(fā)光波長更長的熒光;除去激發(fā)光源，熒光立即熄滅。熒光的能量小于激發(fā)光的能量，波長則長于激發(fā)光。(二)熒光光譜熒光激發(fā)光譜¾¾熒光的激發(fā)光波長為橫坐標;發(fā)射光強度為縱坐標熒光發(fā)射光譜¾¾激發(fā)光

7、波長和強度不變，熒光物質(zhì)的不同熒光波長為橫坐標;發(fā)射光強度為縱坐標激發(fā)光波長、強度不變，測定用溶劑、溫度等條件一定時，熒光強度與物質(zhì)濃度成正比定量依據(jù)。第六章 色譜法l 色譜法：是一種物理或物理化學分離分析方法，將混合物中各組分分離后在線或離線分析的方法。是分析混合物的最有效的手段。l 應用范圍：定性鑒別、純度檢查、含量測定。§1. 概論一、基本原理色譜過程是物質(zhì)分子在相對運動的兩相(固定相和流動相)間分配平衡的過程，可用分配系數(shù)(K )和容量因子(k)來描述?；旌衔镏校魞山M分的 K或 k不等，則被流動相攜帶的速度不等，產(chǎn)生差速遷移，從而被分離。1. 分配系數(shù)K：組分在固定相和流動

8、相之間達到分配平衡時的濃度之比。K = Cs/CmK：與組分自身特性、固定相、流動相的性質(zhì)及溫度有關2. 容量因子k (質(zhì)量分配系數(shù))：達分配平衡后，組分在固定相和流動相中的質(zhì)量之比。k = Ws/Wmk與K的關系： k = Cs·Vs/(Cm·Vm )= K(Vs/Vm)k: 與組分、固定相、流動相的性質(zhì)及溫度有關;還與兩相體積有關。不同組分之間的 k 差異是色譜分離的先決條件3. 色譜過程方程 tR=t0(1+K·VS/Vm)=t0(1+k)二、分類：中國藥典將色譜法分為紙色譜法、薄層色譜法、柱色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、電泳法1. 按分離原理分類：吸

9、附色譜法：固定相為固體(吸附劑) 如GSC、LSC分配色譜法：固定相為液體 如GLC、LLC離子交換色譜法：固定相為離子交換樹脂，適用于離子型的有機物或無機物的分離分析分子排阻色譜法(空間排組色譜法、凝膠色譜法)：固定相為多孔性填料(凝膠)2. 按操作形式分類：柱色譜法、平面色譜法、電泳法§2. 薄層色譜法 thin layer chromatography TLC一、基本原理：分離依據(jù)：難被吸附化合物移動快，易被吸附化合物移動慢些，產(chǎn)生差速遷移®KAKB®分離二、常用固定相吸附TLC法的固定相為吸附劑，最常用硅膠，其次有硅藻土、氧化鋁、微晶纖維素、聚酰胺。1.

10、硅膠：SiO2·xH2O， 具有硅氧交聯(lián)結構、表面有許多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基是活性基團。含水量，活性?；罨?05 110加熱30 min，吸附力增強。TLC常用硅膠G、硅膠GF254、硅膠H和硅膠HF254。2. 氧化鋁：有堿性、中性和酸性三種3. 聚酰胺：表面有酰胺基，與酚、羧酸、氨基酸等形成氫鍵三、操作方法 薄層板的制備：涂布厚度0.20.3 mm。點樣與展開：點樣的樣點一般為圓點，點樣基線距底邊2.0cm，樣點直徑為24mm。一塊板可以點多個樣點，展開時，薄層板浸入展開劑的深度為距薄層底邊0.51.0cm(三)檢視熒光薄層板：熒光淬滅法普通薄層板 有色 直接檢視;無色

11、顯色檢視通用型顯色劑：碘、硫酸溶液、熒光黃溶液(四)色譜系統(tǒng)適用性試驗目的： 使斑點的檢測靈敏度、比移值(Rf)和分離效能符合規(guī)定1.檢測靈敏度2.比移值(Rf) 基本定性參數(shù) ： Rf = l / loRf 最佳范圍0.30.5;可用范圍0.20.8。3. 分離效能 分離度(R)表示 R=2d /(W1+W2)四、應用：TLC法主要用于藥品的鑒別或雜質(zhì)檢查。(一)鑒別：將同濃度的供試品溶液、對照品溶液點在同一薄層板上¾®展開顯色后¾®供試品、對照品顏色與比移值Rf均一致¾®可認為供試品與對照品是同一物質(zhì)。(1)與對照品比較Rf值 (

12、2)與結構相似的物質(zhì)比較Rf值(二) 雜質(zhì)檢查1. 雜質(zhì)對照品法： 雜質(zhì)斑點顏色與雜質(zhì)對照品斑點比較，不得更深¾®可認為未超過規(guī)定的雜質(zhì)最高限量。2.自身稀釋對照法(高低濃度對比法) 適用于得不到雜質(zhì)對照品的情況供試品溶液按限度規(guī)定稀釋成另一低濃度溶液或系列溶液，為對照溶液。供試品雜質(zhì)斑點與相應的自身稀釋對照液所顯主斑點比較，顏色不得更深§3. 高效液相色譜法(HPLC)high performance liquid chromatography HPLC一、基本原理樣品中各組分在固定相與流動相之間分配，由于各組分的分配系數(shù)不等，他們按分配系數(shù)大小的順序依次被流動

13、相帶出色譜柱。K小的組分先流出，K大的組分后流出。(一) 基本概念1.色譜圖和色譜峰色譜圖或流出曲線：色譜響應信號隨時間的變化曲線色譜峰：流出曲線上的突起部分。正常：正態(tài)分布曲線;不正常：拖尾峰和前延峰。色譜峰正常與否用拖尾因子衡量。每個組分的色譜峰可用三項參數(shù)說明峰高或峰面積：用于定量。 峰寬W：用于衡量柱效峰位：用保留值tR表示，用于定性。2. 基線在色譜分離過程中，沒有組分流出時的流出曲線。反映色譜系統(tǒng)(主要是檢測器)的噪音水平3. 保留值保留時間( tR )、死時間( t0 )、 調(diào)整保留時間(tR ´): tR ´= tR - t0相對保留值(r)：即選擇性因子，

14、 r2,1= tR2´/ tR1´= k2/k14. 色譜峰區(qū)域?qū)挾?越小，流出組分越集中，有利于分離標準差( )、半高峰寬( Wh/2)、峰寬(W)(二) 塔板理論色譜柱踏板數(shù)大于103時，流出曲線趨于正態(tài)分布。理論踏板高(H)可由柱長(L)和理論踏板數(shù) n 計算：H = L /n n = 5.54 (tR/Wh/2)2記錄紙速(mm/min)：轉(zhuǎn)換分子、分母單位相同的參數(shù)。聯(lián)系時間單位與長度單位。H 和 n 都是柱效指標，可用于評價柱效高低。 塔板數(shù)越多，塔板高度越小，柱效越高例：用HPLC法測得某組分的保留時間tR為1.5 min，半峰寬Wh/2為0.2 cm;記錄紙

15、速為2.0 cm/min，則柱效為：A. 1246B. 2492C. 623D. 1800E. 311n=5.54(tR/ Wh/2)2 =5.54(1.5×2.0/0.2)2 =1246(三) 速率理論 Van Deemter方程，范氏方程：H = A + B/u + CuA為渦流擴散項，B為縱向擴散系數(shù)，C為傳質(zhì)阻抗項HPLC中范式方程簡化為： H = A + Cu二、高效液相色譜儀(一)儀器的基本結構高壓輸液泵、色譜柱、進樣閥、檢測器(二)檢測器的類型和適用范圍1. 選擇性檢測器：也稱濃度型檢測器，包括紫外檢測器、光二極管陣列檢測器DAD、熒光檢測器、電化學檢測器和質(zhì)譜檢測器。

16、(1)紫外檢測器：最常用。適于有共軛結構的化合物如芳香化合物、核酸及甾體激素等。(2)光二極管陣列檢測器 diode-array detector, DAD(3)熒光檢測器：僅適用于在流動相條件下具有熒光或經(jīng)衍生轉(zhuǎn)化為具有熒光的化合物(4)電化學檢測器： 僅適用于在流動相條件下可發(fā)生氧化-還原反應的化合物的檢測。(5)質(zhì)譜檢測器：主要應用于大分子物質(zhì)的檢測，如蛋白質(zhì)、多肽等，以及色譜峰的純度或原料藥中的雜質(zhì)檢查。2. 通用型檢測器：也稱質(zhì)量型檢測器，包括示差折光檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)。ELSD 僅適用于UV檢測困難的物質(zhì)的分析，如糖類和脂質(zhì)等，以及藥物雜質(zhì)的確認。三、液固吸附色譜

17、法 LSCl 分離原理：按被分離組分的分子(溶質(zhì)分子)與流動相分子(溶劑分子)爭奪吸附劑表面活性中心的吸附能力的差別而分離。l 硅膠為吸附色譜法最常用的固定相。四、液液分配色譜法 LLC(一)正相分配色譜法：流動相極性<固定相極性。主要用于分離溶于有機溶劑的極性及中等極性的分子型物質(zhì)。反相分配色譜法：流動相極性>固定相極性。主要用于分離非極性至中等極性物質(zhì)。(二)LLC的固定相 最常用的固定相是化學健合相。(1)非極性健合相：十八烷基硅烷健合硅膠(ODS，C18)、辛基硅烷健合硅膠(C8)，在反相HPLC中最為常用。(2)極性健合相：常用氨基和氰基硅烷鍵合相，即可用于正相色譜法，也

18、可用于反相色譜法。多用于正相HPLC。五、色譜系統(tǒng)適用性試驗目的：檢查色譜系統(tǒng)在實驗條件影響下是否符合要求在各品種項下規(guī)定的色譜條件下，除固定相種類、流動相組成、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、色譜柱長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組成的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變。以適應具體的色譜系統(tǒng)并達到色譜系統(tǒng)適用性試驗的要求。一、系統(tǒng)適用性試驗色譜系統(tǒng)適用性試驗通常包括：理論踏板數(shù)、分離度、重復性和拖尾因子等四個指標。(1)色譜柱的理論踏板數(shù)(n) n=5.54 (tR /Wh/2)2 tR， Wh/2統(tǒng)一單位如測得n低于規(guī)定，應改變柱長或載體性能、重

19、填色譜柱等以求達到。(2)分離度 (R) R=2(tR2-tR1)/(W1+W2) 定量分析時R ³ 1.5記錄紙速：轉(zhuǎn)換分子、分母單位相同的參數(shù)。考題 A型題：測得兩色譜峰的保留時間tR1=6.5min，tR2=8.3min，峰寬W1=1.0min，W2=1.4min，則兩峰分離度R為A、0.22B、1.2C、2.5D、0.75ÖE、1.5(3)重復性：對照品溶液連續(xù)進樣5次，其峰面積測量值的 RSD 2.0%配制相當于80%、100%和120%的對照品溶液，加規(guī)定量的內(nèi)標溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別至少進樣2次，計算平均校正因子，其RSD 2.0%(4)拖尾因子(

20、T)： T = W0.05h/2d1 T應在0.95 1.05之間六、應用(一)鑒別 供試液主峰的保留時間與對照液一致(二)雜質(zhì)檢查 中國藥典用HPLC雜質(zhì)檢查方法有5種1)內(nèi)標法加校正因子校正因子( f ) =(As /Cs) / (AR/CR) 含量 (Cx) = f · Ax / (AS /CS )2)外標法 含量 (Cx) = CR · (Ax / AR)3)加校正因子的主成分自身對照法：對照溶液為供試品溶液的稀釋溶液4)不加校正因子的主成分自身對照法 無雜質(zhì)對照品5)面積歸一化法(三)含量測定 內(nèi)標法加校正因子法、外標法§4. 氣相色譜法 gas chr

21、omatography， GC一、基本原理采用氣體流動相;不適于難揮發(fā)和熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)的分析;各組分按K大小順序依次被載氣帶出色譜柱產(chǎn)生分離二、氣相色譜儀(一)載氣源 FID多用氮氣或氦氣為載氣，氫氣為燃氣，空氣為助燃氣。TCD多用氦氣或氫氣為載氣;ECD多用氮氣或氬氣為載氣。(二)進樣方式 可分為溶液直接進樣、頂空進樣(三)色譜柱 填充柱或毛細管柱(四)柱溫箱 控溫精度在±1(五)檢測器：1.火焰離子化檢測器(FID)氫氣為燃氣，空氣為助燃氣。檢測器溫度應高于柱溫，并不低于150®¾防水氣凝結，(否則倒流)，通常為 250 - 350 2. 氮磷檢測器NPD

22、適于含氮、磷元素的藥物3. 火焰光度檢測器FPD 適于含氮、硫元素的藥物4. 電子捕獲檢測器ECD 主要用于含鹵素藥物5. 質(zhì)譜檢測器MS 能給出相應的結構信息6. 熱導檢測器 TCD 檢測組分的濃度變化濃度型：TCD、電子捕獲檢測器ECD(六)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)三、常用固定液與載體1. 常用的固定液：常用的鯊魚烷是標準非極性固定液硅氧烷類 ：SE-30、SE-54、OV-17、OV-25等醇類：聚乙二醇(PEG)是最常用的固定液之一2. 載體(擔體) 作用：承載固定液為化學惰性的多孔性微粒，常用硅藻土型載體：紅色載體和白色載體。3. 毛細管色譜柱：開管型毛細管柱和填充型毛細管柱四、色譜系統(tǒng)適用性試驗在各品種項下規(guī)定色譜條件下，除檢測器種類、固定液品