大鼠表皮角化細(xì)胞分裂活性的拓?fù)鋵W(xué)特征

1、大鼠表皮角化細(xì)胞分裂活性的拓?fù)鋵W(xué)特征* 摘要為了探討大鼠軀干背部皮膚表皮角化細(xì)胞的分裂活性是否因部位而有區(qū)別，常規(guī)石蠟切片和HE染色，通過核型觀察計數(shù)分裂中期細(xì)胞。結(jié)果顯示：在所研究的范圍內(nèi)，分裂活性隨表皮的部位而異，分裂活性高低不同的角化細(xì)胞各自聚集成群，細(xì)胞群的大小約為10-3m數(shù)量級，大于已報告的變異尺度。而且在所觀察的全部動物，在距背中線約10 mm處，均可看到1條與背中線大體平行的由低分裂活性細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞帶。從比較解剖學(xué)看，這個部位相當(dāng)于膀胱經(jīng)經(jīng)過的部位。結(jié)果提示，腎上腺素能神經(jīng)末梢和縫隙連接的密集分布可能是這種表皮角化細(xì)胞分裂活性拓?fù)鋵W(xué)特征形成的原因。關(guān)鍵詞角化細(xì)胞分裂活性拓?fù)鋵W(xué)

2、大鼠細(xì)胞增殖受基因、生長因子、激素等多種因素的調(diào)控，其中很多環(huán)節(jié)仍然不清。在多細(xì)胞有機(jī)體內(nèi)，不同部位的同一種組織細(xì)胞增殖活性可能不同，決定這種差異的因素稱為位置信號(positional signals)1。對于位置信號本質(zhì)的研究不僅有助于闡明細(xì)胞增殖調(diào)控這一復(fù)雜過程，而且在組織移植和腫瘤控制等方面可能具有實際意義。表皮是研究位置信號的一個理想對象。因為：1.表皮覆蓋于整個體表，不同位置的表皮局部環(huán)境各不相同；2.表皮角化細(xì)胞(主要是其中的基底細(xì)胞)處于不斷分裂中，便于比較不同部位角化細(xì)胞增殖活性的差異；3.便于取材。迄今為止，有關(guān)表皮角化細(xì)胞增殖活性部位差異的研究仍然很不充分。Mackenz

3、ie2曾報告，角化細(xì)胞常以增殖單位形式存在，每個單位底部由10或11個基底細(xì)胞構(gòu)成，增殖活躍的角化細(xì)胞主要位于單位周圍。Lavker和Sun3報告，位于真皮乳頭上板和表皮脊處的角化細(xì)胞分裂活性有明顯差異。以上兩種表皮角化細(xì)胞增殖活性差異的空間尺度均在10-4m的數(shù)量級，其形成的原因也尚待研究。本文報告了表皮角化細(xì)胞增殖活性隨部位而變化的一種新形式，其空間尺度在10-3m數(shù)量級，并討論了這種差異形成的可能原因。材料和方法實驗所用皮膚取自雄性Wistar大鼠(重200300g)。為便于觀察，注射秋水仙素(華美公司)使細(xì)胞有絲分裂停止在分裂中期。秋水仙素于上午910點鐘注射，劑量為0.4mg/100

4、g體重。78h后，用3%戊巴比妥鈉水溶液腹腔注射麻醉動物，并仔細(xì)剪除其軀干背部體毛。取材時考慮到：1.背中線兩側(cè)的表皮在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上應(yīng)當(dāng)是對稱的；2.為便于切片，組織塊不宜過大；3.根據(jù)比較解剖學(xué)，大鼠膀胱經(jīng)線距背中線約1cm，應(yīng)將其包括在觀察范圍之內(nèi)?；谝陨细鼽c，每只動物僅取背中線一側(cè)的皮膚，究竟取左側(cè)還是右側(cè)由抽簽決定。具體做法是，由背中線開始向左(3只動物，No.13)或向右(6只動物，No.49)量取2cm，沿背中線方向在T7L5間也量取2cm，劃出面積為4cm2的區(qū)域，用手術(shù)刀片沿標(biāo)記線取下皮膚。所取大塊皮膚立即投入2%甲醛固定液中，并垂直于背中線，將其進(jìn)一部切分成3等份，在背中線

5、一側(cè)的皮下組織中穿孔標(biāo)記。在2%的甲醛固定液中固定4h，然后常規(guī)石蠟包埋。每只動物隨機(jī)選取一塊皮膚進(jìn)行切片。切片方向垂直于背中線和皮膚表面，厚度89m。一些動物(6只，No.16)的皮膚每間隔約0.3mm取1張切片，另一些動物(3只，No.79)的皮膚連續(xù)切片。連續(xù)切片的動物經(jīng)抽簽確定。經(jīng)HE 染色后，在1 000倍的光鏡下由背中線起始到皮膚另一端止，計數(shù)每80 m長度表皮(在1 000倍下測微尺的長度)范圍內(nèi)處于分裂中期的細(xì)胞個數(shù)。由于切片的厚度和顯微鏡景深的限制，在一個焦面上只能看清一部分細(xì)胞。計數(shù)時，要輕輕調(diào)節(jié)顯微鏡的細(xì)調(diào)旋鈕，將切片厚度范圍內(nèi)的所有分裂中期的細(xì)胞計算在內(nèi)。所得數(shù)據(jù)用繪軟

6、件Graftool 3.03.3繪。上述動物編號僅為了便于結(jié)果的整理，并不代表動物接受實驗的時間順序。結(jié)果經(jīng)HE染色的大鼠背部皮膚切片如1所示。此處表皮一般可清楚地區(qū)分出基底層、棘細(xì)胞層、顆粒層和角質(zhì)層。有絲分裂中期的細(xì)胞顯示為體積增大，核膜消失，并可見到呈團(tuán)塊或條索狀的染色體。這些細(xì)胞多數(shù)見于基底層，少數(shù)亦可見于棘細(xì)胞層。將每只大鼠所觀察切片的數(shù)據(jù)合并，得到其在距背中線不同距離處每mm表皮中有絲分裂中期的細(xì)胞數(shù)的平均值，繪成直方(2)。由2可見，所有大鼠都有1個分裂中期細(xì)胞數(shù)最低的位置，除第9只動物外，這個位置都在距背中線912mm的地方。統(tǒng)計結(jié)果顯示，這一最低值鄰近區(qū)域的分裂中期細(xì)胞數(shù)也都

7、較低，和最低值沒有顯著性差異(P0.05)。(大鼠9分裂中期細(xì)胞數(shù)最低值位于距背中線5mm的地方，但其位于距背中線912mm處的分裂中期細(xì)胞數(shù)與最低值沒有顯著差異)。除此之外，其他位置上也零散地分布著一些與最低值沒有顯著差異的低細(xì)胞分裂區(qū)域。上述結(jié)果提示：角化細(xì)胞的有絲分裂活性隨位置而變化，變化的區(qū)域可在毫米數(shù)量級內(nèi)。所研究大鼠的共同特征是在距背中線912mm處的角化細(xì)胞的有絲分裂活性都較低，不論皮膚取自背中線的左側(cè)還是右側(cè)。為詳盡了解表皮角化細(xì)胞的分裂活性隨位置的變化，將大鼠各切片表皮分裂中期的細(xì)胞個數(shù)對距背中線的距離作，3是大鼠1間隔皮膚切片中隨機(jī)選取的10張切片分裂中期細(xì)胞個數(shù)的分布情況

8、。由可見，每張切片都呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞分裂活性區(qū)域性差異，高分裂區(qū)域與低分裂區(qū)域相互間隔。低分裂區(qū)域(白色和藍(lán)色)一般在0.51.5mm，高分裂區(qū)域(紅色和黃色)可至3mm左右。高低分裂區(qū)域之間常有分裂活性居中的過渡區(qū)域(綠色)。每張切片都有23個低分裂細(xì)胞區(qū)域，其中一個總是落于距背中線912mm的地方。引人注意。3大鼠1軀干背部皮膚隨機(jī)選取的10張切片（Y軸），第0.5mm長度表皮內(nèi)分裂中期細(xì)胞數(shù)（Z軸，用不同顏色的色標(biāo)表示在距背中線不同距離處（X軸）的分布。右側(cè)每個色標(biāo)旁的數(shù)字代表第0.5mm長度表皮內(nèi)分裂中期細(xì)胞數(shù)。4大鼠8軀干背部皮膚連續(xù)切片，第0.5mm長度表皮內(nèi)分裂中期細(xì)胞數(shù)（Z軸，用

9、不同顏色的煞費苦心標(biāo)表示）在距背中線不同距離（X軸）處分布的三維重建。Y軸表示切片數(shù)。右側(cè)每個色標(biāo)旁的數(shù)字代表每0.5mm長度表皮內(nèi)分裂中期細(xì)胞數(shù)。Fig.3In the direction perpendicular to the dorsal middle line (showed on X-axis, unit:mm), the destribution of mitotoic activity (showed on Z-axis by different coloru, unit: figure of keratinocytes in metaphase/0.5mm of epider

10、mis) observed in 10 different sections (show on Y-axis ) taking randomly from the trunk back skin of rat number 1.Fig.4In the direction perpendicular to the dorsal middle line (showed on X-axis, unit: mm), the 3-dimentional reconstruction of the distribution of mitotic ctivity (showed on Z-axis by d

11、ifferent coloru,unit: figrue of keratinocytes in metaphase/0.5mm of epidermis ) observed in 31 sections in series( showed on Y-axis) taking from the trunk back skin of rat number 8.在上述隨機(jī)切片上所看到的經(jīng)常出現(xiàn)于距背中線912mm處的低分裂活性區(qū)是否會在表皮中形成一條連續(xù)的細(xì)胞帶?這一問題只能通過對連續(xù)切片的觀察結(jié)果構(gòu)筑三維重建來解決。4是大鼠8的連續(xù)切片分裂中期細(xì)胞個數(shù)在空間的分布情況。我們看到在分散切片中顯現(xiàn)

12、的各分裂區(qū)域在相鄰的連續(xù)切片中相互連接，形成一種鑲嵌結(jié)構(gòu)。其中，低分裂區(qū)域(白色或藍(lán)色)形狀不一，大小在0.010.04mm2之間，無規(guī)則的散落在高分裂區(qū)域(黃色、紅色和紫色)之間。只有在距背中線912mm的地方，相鄰切片的低分裂活性區(qū)彼此相連，形成一條與背中線大體平行的低分裂細(xì)胞帶。這種現(xiàn)象在作了連續(xù)切片的3只動物(No.79)上均可見到。 29只大鼠在垂直于背中線方向角化細(xì)胞分裂活性分布的直方?？v坐標(biāo)表示1只大鼠所觀察的全部切片中有絲分裂中期細(xì)胞數(shù)的平均值(有絲分裂中期細(xì)胞數(shù)/mm表皮)，橫坐標(biāo)表示與背中線的距離(mm)。雙箭頭表示分裂中期細(xì)胞數(shù)最低值的位置；單箭頭表示與分裂中期細(xì)胞數(shù)最低

13、值沒有顯著性差異(P0.05)的區(qū)域。每個右上角的數(shù)字代表動物編號，每只動物觀察的切片數(shù)依次為：10、10、15、12、12、20、27、31和39Fig.2 Histograms illustrating the distribution of mitotic activity of keratinocytes in the direction perpendicular to the dorsal middle line. Ordinate represents the mean value of keratinocytes in metaphase observed in all the

14、 sections examined in an animal (unit: figure of keratinocytes in metaphase per millimeter of epidermis). Abscissa, the distances to the dorsal middle line (unit: mm). Double arrowhead represents the lowest value of mitotic activity, while single arrowhead indicates the values which are not signific

15、antly different from the lowest one (P0.05). The figure at the upper right corner of each histogram shows the numerical order of the aniaml. The numbers of sectons examined in each animal are 10,10,15,12,12,20,27,31, and 39, successively.討論構(gòu)成表皮的主要細(xì)胞成分角化細(xì)胞處于不斷增殖過程中。分裂的角化細(xì)胞主要位于其基底層，少數(shù)位于棘細(xì)胞層。隨著向表層的推移，細(xì)

16、胞的分化程度逐漸增加，并喪失分裂活性。本研究觀察到的結(jié)果與此相符。人們已經(jīng)注意到，角化細(xì)胞的增殖活性因部位而異。例如，手足掌的角化細(xì)胞的增殖活性明顯高于身體其他部位4,5。這種部位差異的空間尺度在10-2m數(shù)量級。角化細(xì)胞增殖活性的部位差異也存在于較小的范圍內(nèi)。有人曾報告，位于表皮增殖單位周圍和中心的角化細(xì)胞以及位于真皮乳頭上板和表皮脊的角化細(xì)胞的增殖活性均不相同2,3，這類部位差異的空間尺度在10-4m數(shù)量級。本文報告了角化細(xì)胞增殖活性隨部位變化的一種新類型：在解剖部位大體相同(如本研究的大鼠背部)的表皮中，增殖活性高低不同的角化細(xì)胞各自聚集成群，并彼此分隔，形成一種復(fù)雜的鑲嵌結(jié)構(gòu)。每一個增

17、殖活性類似的細(xì)胞群的大小都在10-3m數(shù)量級，其空間尺度在前兩種類型之間。角化細(xì)胞增殖活性隨部位變化的這種類型是否存在于身體其他部位或其他物種還不清楚。這種增殖活性的分布特點與干細(xì)胞分布的關(guān)系也尚待研究。角化細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)理一直受到關(guān)注。體內(nèi)外實驗都證明，腎上腺素類物質(zhì)在適當(dāng)濃度下可抑制角化細(xì)胞的有絲分裂6,7。另一方面，在多種細(xì)胞已證明，細(xì)胞連接通訊對細(xì)胞增殖具有調(diào)控功能8，9。因而有研究認(rèn)為，表皮增殖單位中心與周圍的角化細(xì)胞以及表皮脊與真皮乳頭上板的角化細(xì)胞在增殖活性上的差異，可能是由于這些部位角化細(xì)胞連接通訊能力的差異造成的10，11。本文報告的由增殖活性不同的角化細(xì)胞群構(gòu)成的鑲嵌結(jié)構(gòu)

18、的形成原因仍然不清。值得注意的是，距背中線10 mm附近區(qū)域的角化細(xì)胞，在所觀察的9只動物中，8只角化細(xì)胞增殖活性的最低值都出現(xiàn)于這個區(qū)域，第9只動物在該區(qū)的角化細(xì)胞的增殖活性也較低，雖然其最低值出現(xiàn)于距背中線5mm處，提示可能有個別動物偏離上述規(guī)律，這些異常動物在群體中的比例尚待研究。在進(jìn)行連續(xù)切片觀察的3只動物，距背中線10mm附近的低分裂活性角化細(xì)胞均構(gòu)成一條連續(xù)的細(xì)胞帶，從比較解剖學(xué)看，這條細(xì)胞帶的位置相當(dāng)于膀胱經(jīng)循行的路線，因而它的解剖學(xué)特點在經(jīng)絡(luò)研究中倍受重視。從已有的資料看，這個部位的皮膚在形態(tài)學(xué)上至少有2個特點，這就是，其真皮中有比周圍更為豐富的腎上腺素能神經(jīng)末梢12，而其表皮

19、中則有密集的縫隙連接13。結(jié)合前面的討論，也許正是這兩個特點決定了該處的角化細(xì)胞形成了一條連續(xù)的低分裂活性的細(xì)胞帶。如果這一假設(shè)是正確的，那么，在其他經(jīng)脈循行線的表皮中也應(yīng)當(dāng)能夠看到由低分裂活性的角化細(xì)胞所構(gòu)成的連續(xù)細(xì)胞帶。這需要進(jìn)一步的實驗加以證實。本工作中的石蠟切片由北京師范大學(xué)生物系劉里遠(yuǎn)博士協(xié)助完成，實驗工作進(jìn)行與論文完成過程中，本校生物遺傳教研室柳家英教授、組織胚胎學(xué)系孫品偉教授、病理學(xué)系鄒萬忠教授都曾給予有益的建議，謹(jǐn)此一并致謝。收稿 1997-07修回 1998-05本文3見插第2頁 1大鼠軀干背部皮膚石蠟切片經(jīng)HE染色后的照片。箭頭所指為典型分裂中期細(xì)胞Fig.1 Photog

20、raph of paraffin section of skin taking from rat trunk back after HE staining.Arrowheads indicate typical cells in metaphase.Bar=20m參考文獻(xiàn)1Alberts B, Bray D, Lewis J, et al. Molecular Biology of the Cell.2nd ed. New York and London: Garland Publishing, Inc, 1989:7602Mackenzie IC. Relationship between

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