植物組織培養(yǎng)33018324

1、植物組織培養(yǎng) plant tissue culture繁 殖 技 術(shù)植物組織培養(yǎng)v基礎(chǔ)知識 概念 歷史 原理v實驗技術(shù) 實驗室組成 操作程序v發(fā)展技術(shù)v指植物的離體部分（包括任何器官、組織、指植物的離體部分（包括任何器官、組織、細胞或細胞或原生質(zhì)體原生質(zhì)體），在人工控制的），在人工控制的培養(yǎng)基培養(yǎng)基及環(huán)境條件及環(huán)境條件（溫度及光照）下，得以生長（溫度及光照）下，得以生長和和分化分化成完整植株的一種無菌培養(yǎng)技術(shù)。成完整植株的一種無菌培養(yǎng)技術(shù)。又稱：植物離體培養(yǎng)又稱：植物離體培養(yǎng)一、一、植物組織培養(yǎng)的概念植物組織培養(yǎng)的概念植物克隆植物克隆基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識植物組織培養(yǎng)的概念植物組織培

2、養(yǎng)的概念植物克隆植物克隆植物組織培養(yǎng)的概念植物組織培養(yǎng)的概念優(yōu)點： 繁殖系數(shù)大 繁殖快 去病毒，節(jié)省土地v二、植物組織培養(yǎng)的由來及發(fā)展二、植物組織培養(yǎng)的由來及發(fā)展1902年，德國科學家年，德國科學家G.Harberlandt從從高等植物取下氣孔、表皮及葉肉組織放高等植物取下氣孔、表皮及葉肉組織放在人工培養(yǎng)基上，雖然遭致失敗，卻啟在人工培養(yǎng)基上，雖然遭致失敗，卻啟發(fā)了植物組織培養(yǎng)的概念。并且，由他發(fā)了植物組織培養(yǎng)的概念。并且，由他提出了高等植物的提出了高等植物的每一個活細胞都具有每一個活細胞都具有分化全能性分化全能性totipotency。v1937年，美國科學家年，美國科學家White等人改進

3、了等人改進了培養(yǎng)基培養(yǎng)基，結(jié)果培養(yǎng)的細胞開始分裂，堆積成一團菜花狀結(jié)果培養(yǎng)的細胞開始分裂，堆積成一團菜花狀瘤狀物，即瘤狀物，即愈傷組織愈傷組織，但沒能繼續(xù)分化為根、，但沒能繼續(xù)分化為根、莖、葉等器官。后來研究發(fā)現(xiàn)，只有在培養(yǎng)基莖、葉等器官。后來研究發(fā)現(xiàn)，只有在培養(yǎng)基中加入適當比例的中加入適當比例的細胞分裂素細胞分裂素和和植物生長素植物生長素，愈傷組織才能分化出芽和根。愈傷組織才能分化出芽和根。愈傷組織愈傷組織培養(yǎng)基培養(yǎng)基v。v1958年，年，Steward由胡蘿卜韌皮部組織誘出愈由胡蘿卜韌皮部組織誘出愈傷組織，再由愈傷組織分化成小苗，證明了高傷組織，再由愈傷組織分化成小苗，證明了高等植物活細胞

4、具有分化全能性。等植物活細胞具有分化全能性。v。v1962年年Marshing和和Shong發(fā)明了發(fā)明了MS培養(yǎng)基培養(yǎng)基。v1967年年Maths發(fā)現(xiàn)白楊在組織培養(yǎng)過程中，產(chǎn)發(fā)現(xiàn)白楊在組織培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生的化學物能抑制霉及細菌的生長。生的化學物能抑制霉及細菌的生長。Khanna和和Staba從懸浮或靜止培養(yǎng)基中分離植物組織，發(fā)從懸浮或靜止培養(yǎng)基中分離植物組織，發(fā)現(xiàn)其中具有抗微生物（抗菌劑活躍）活性者高現(xiàn)其中具有抗微生物（抗菌劑活躍）活性者高達百分之八十。達百分之八十。v1971年，年，Ra-jasekbar認為組織在不同情況下培認為組織在不同情況下培養(yǎng)，會產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物以影響組織的生長。養(yǎng)

5、，會產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物以影響組織的生長。.三、植物組織培養(yǎng)的原理三、植物組織培養(yǎng)的原理“細胞的全能性細胞的全能性”v植物每個植物每個體細胞體細胞具備與受精卵一樣的全套遺傳物質(zhì)，具備與受精卵一樣的全套遺傳物質(zhì)，但在完整植株植株上某一體細胞只是組織的一部分。它但在完整植株植株上某一體細胞只是組織的一部分。它受完整植株的控制，只承擔某一小部分功能，表現(xiàn)一定受完整植株的控制，只承擔某一小部分功能，表現(xiàn)一定形態(tài)。這是形態(tài)。這是某些基因受阻遏和控制某些基因受阻遏和控制，而只使極少數(shù)基因，而只使極少數(shù)基因發(fā)揮作用之故，但其發(fā)揮作用之故，但其遺傳潛在表現(xiàn)能力并未喪失遺傳潛在表現(xiàn)能力并未喪失。當植。當植物器官、

6、組織或細胞脫離完整植株后，就不再受到完整物器官、組織或細胞脫離完整植株后，就不再受到完整植株的控制。植株的控制。離體的器官、組織或細胞在適宜培養(yǎng)基和離體的器官、組織或細胞在適宜培養(yǎng)基和無菌的培養(yǎng)條件下，由于激活了基因，從而生長、增殖，無菌的培養(yǎng)條件下，由于激活了基因，從而生長、增殖，發(fā)育分化出組織和器官，直至形成完整植株。發(fā)育分化出組織和器官，直至形成完整植株。四、植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用 v在植物在植物快速繁殖快速繁殖和和脫毒脫毒上的應(yīng)用上的應(yīng)用v在植物在植物種質(zhì)資源保存種質(zhì)資源保存上的應(yīng)用上的應(yīng)用v在植物在植物育種育種上的應(yīng)用上的應(yīng)用單倍體育種單倍體育種胚胎培養(yǎng)胚胎培養(yǎng)細胞融合細胞融合基因工程基

7、因工程培養(yǎng)細胞突變體培養(yǎng)細胞突變體v培養(yǎng)過程中代謝產(chǎn)物的利用培養(yǎng)過程中代謝產(chǎn)物的利用v在遺傳、生理、生化和病理研究上的應(yīng)用在遺傳、生理、生化和病理研究上的應(yīng)用 一、組培設(shè)備 1、準備室、準備室 儀器和設(shè)備 ； 藥品 實驗技術(shù)實驗技術(shù)1、準備室、準備室 儀器和設(shè)備 ； 藥品 實驗技術(shù)實驗技術(shù)一、組培設(shè)備 2、接種室、接種室vl 儀器和設(shè)備 超凈工作臺、酒精燈、定時鐘等vl 藥品 酒精、次氯酸鈉等上海和呈儀器制造有限公司 CO2培養(yǎng)箱3、培養(yǎng)室、培養(yǎng)室不銹鋼培養(yǎng)架（組不銹鋼培養(yǎng)架（組培專用燈）、光照培培專用燈）、光照培養(yǎng)箱養(yǎng)箱v4、練苗室AGlimpseofPlantTissueCulture獲取

8、獲取外植體外植體無菌接種無菌接種誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo)愈傷組織的形成的形成試管苗的形成試管苗的形成擴大培養(yǎng)擴大培養(yǎng)移栽移栽脫分化脫分化再分化再分化二、植物組織培養(yǎng)程序二、植物組織培養(yǎng)程序（一）、涉及的基本概念（一）、涉及的基本概念v1.外植體外植體explant : 用于植物組織培養(yǎng)的用于植物組織培養(yǎng)的離體材料離體材料稱為稱為外植體外植體 。v2.分化分化differentiation 細胞在分裂過程中發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能上的改變，從而細胞在分裂過程中發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能上的改變，從而在在發(fā)育中形成各類組織和器官，發(fā)育中形成各類組織和器官，完成整個生活周期。完成整個生活周期。3.脫分化脫分化dedifferen

9、tiation將植物的根、莖、葉等器官進行離體培養(yǎng)時、這些將植物的根、莖、葉等器官進行離體培養(yǎng)時、這些器官中已分化的有特定結(jié)構(gòu)和功能的細胞，將會逐漸器官中已分化的有特定結(jié)構(gòu)和功能的細胞，將會逐漸喪失原有分化狀態(tài)，而恢復(fù)細胞分裂機能，形成無組喪失原有分化狀態(tài)，而恢復(fù)細胞分裂機能，形成無組織結(jié)構(gòu)、無器官分化的薄壁細胞團。此時形成的薄壁織結(jié)構(gòu)、無器官分化的薄壁細胞團。此時形成的薄壁細胞團稱為細胞團稱為愈傷組織愈傷組織.愈傷組織愈傷組織形成一種相對沒有分化的形成一種相對沒有分化的活的薄壁細胞團組成的活的薄壁細胞團組成的新生組織。新生組織。 3.再分化再分化redifferentiation新形成的愈傷

10、組織，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，新形成的愈傷組織，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，會產(chǎn)生一些分生細胞團，隨后由它再分化為具會產(chǎn)生一些分生細胞團，隨后由它再分化為具有特定結(jié)構(gòu)和功能的組織或器官，如根和不定有特定結(jié)構(gòu)和功能的組織或器官，如根和不定芽。芽。4.胚狀體胚狀體embroid對應(yīng)于對應(yīng)于胚胚embryo，在離體培養(yǎng)過程中產(chǎn)生一，在離體培養(yǎng)過程中產(chǎn)生一種形似胚（具有明顯的根端和芽端），功能與種形似胚（具有明顯的根端和芽端），功能與胚相同的結(jié)構(gòu)。胚相同的結(jié)構(gòu)。 5.培養(yǎng)基培養(yǎng)基medium人工配制的適合植物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)人工配制的適合植物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)，其中含有所必需的物的營養(yǎng)基質(zhì)，其中

11、含有所必需的能源能源、碳源碳源、氮源、礦質(zhì)元素、水和生長因素，但不同營養(yǎng)氮源、礦質(zhì)元素、水和生長因素，但不同營養(yǎng)類型、不同種類的植物對營養(yǎng)元素的要求又有類型、不同種類的植物對營養(yǎng)元素的要求又有較大差異。較大差異。6.繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)subculture愈傷組織在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時期之后，便愈傷組織在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時期之后，便因養(yǎng)分缺乏或本身分泌一種植物毒素，使它不因養(yǎng)分缺乏或本身分泌一種植物毒素，使它不能再生長，因此必須移入新的培養(yǎng)基。能再生長，因此必須移入新的培養(yǎng)基。二、植物組織培養(yǎng)程序二、植物組織培養(yǎng)程序1 1、配制半固體培養(yǎng)基、配制半固體培養(yǎng)基2 2、獲取外植體、獲取外植體3 3、 接

12、接 種種4 4、光、光 照照 培培 養(yǎng)養(yǎng)5 5、 移移 栽栽通過調(diào)節(jié)通過調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)和植物生營養(yǎng)物質(zhì)和植物生長調(diào)節(jié)劑長調(diào)節(jié)劑的適當配比的適當配比離體、消毒離體、消毒的植物器官、的植物器官、組織或細胞組織或細胞植物體植物體根、芽根、芽脫分化脫分化再分化再分化植物組織培養(yǎng)生理過程植物組織培養(yǎng)生理過程愈傷愈傷組織組織脫分化脫分化胚胚狀狀體體再分化再分化（二）具體流程簡介（二）具體流程簡介v實驗開始啦實驗開始啦v配制培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基v無機營養(yǎng)物質(zhì)：無機營養(yǎng)物質(zhì)：植物所必需的大量元素及微量元素植物所必需的大量元素及微量元素v有機營養(yǎng)物質(zhì)有機營養(yǎng)物質(zhì) 含含N N物質(zhì)

13、：包括維生素和氨基酸物質(zhì)：包括維生素和氨基酸 碳源：碳源：2%5%2%5%的蔗糖的蔗糖 瓊脂：起凝固支持作用瓊脂：起凝固支持作用植物生長調(diào)節(jié)劑植物生長調(diào)節(jié)劑：（：（生長素，細胞分裂素）生長素，細胞分裂素）PHPH值：值：5.05.06.06.0 5.植物激素 生長素auxins ：IAA，IBA NAA，2,4-D 細胞分裂素cytokinin ： BA, KT，ZT(一)母液配制 Preparation Room(二)培養(yǎng)基配制Media Mixing母液、糖水混合 定溶加熱調(diào)節(jié)pH值放冷放冷滅滅菌菌分裝分裝器皿及其他準備器皿及其他準備加熱預(yù)溶瓊脂+水凝固凝固接接種種v2、外植體選取與滅菌、

14、外植體選取與滅菌v選材考慮因素：選材考慮因素：取哪部分器官或組織最合適取哪部分器官或組織最合適部分器官或組織的生理狀態(tài)，發(fā)育年齡部分器官或組織的生理狀態(tài)，發(fā)育年齡取材季節(jié)取材季節(jié)材料大小材料大小外植體的兩種類型：外植體的兩種類型：A.帶芽的外植體如莖尖和側(cè)芽帶芽的外植體如莖尖和側(cè)芽B.分化的組織：莖段，葉，根，花瓣等分化的組織：莖段，葉，根，花瓣等v無菌操作間無菌操作間 超凈工作臺 v3、接種蘭花嫩莖蘭花莖尖外植體的消毒外植體的消毒選取嫩莖選取嫩莖 selection of the burgeonsv外植體表面滅菌外植體表面滅菌v從室外帶回來的材料除去一些不必要的部從室外帶回來的材料除去一些不

15、必要的部分洗去泥土然后用皂液或洗衣粉及消洗靈分洗去泥土然后用皂液或洗衣粉及消洗靈浸泡，沖洗，必要時可用軟刷刷洗材料，然后浸泡，沖洗，必要時可用軟刷刷洗材料，然后剪成適宜的大小，再行深滅菌。通過表面滅菌剪成適宜的大小，再行深滅菌。通過表面滅菌可清除許多雜菌，如在馬蹄蓮根莖的離體培養(yǎng)可清除許多雜菌，如在馬蹄蓮根莖的離體培養(yǎng)中，通過清洗根莖外植體的泥土，剝?nèi)ネ饷鎺字?，通過清洗根莖外植體的泥土，剝?nèi)ネ饷鎺讓影游?，流水沖洗層包庇物，流水沖洗1小時，可把雜菌清洗掉小時，可把雜菌清洗掉60左右（左右（MerelLG,1998）。）。v外植體的深滅菌外植體的深滅菌通過外植體表面滅菌后，仍有一部分雜菌存通過外

16、植體表面滅菌后，仍有一部分雜菌存在于材料表面或內(nèi)部，必須經(jīng)過更深層次的的在于材料表面或內(nèi)部，必須經(jīng)過更深層次的的滅菌處理如加消毒藥劑、抗生素、水浴、灼燒滅菌處理如加消毒藥劑、抗生素、水浴、灼燒等措施才能獲得不帶菌的外植體。下面是幾種等措施才能獲得不帶菌的外植體。下面是幾種典型外植體的深滅菌處理程序。典型外植體的深滅菌處理程序。v外植體滅菌：外植體滅菌：要去除材料上的微生物，又不能傷及材料。要去除材料上的微生物，又不能傷及材料。v常用滅菌劑：常用滅菌劑：乙醇乙醇（70%75%）、）、次氯酸鈉溶液次氯酸鈉溶液（0.5%10%）、）、升汞升汞（0.1%1%）、抗生素類殺）、抗生素類殺菌劑等。菌劑等。

17、v一般可將材料沖洗干凈后，放入一般可將材料沖洗干凈后，放入70%酒精中數(shù)酒精中數(shù)秒，用無菌水沖洗后再放入升汞（秒，用無菌水沖洗后再放入升汞（110min）或次氯）或次氯酸鈉中（酸鈉中（530min）消毒。再用無菌水反復(fù)沖洗四、）消毒。再用無菌水反復(fù)沖洗四、五遍，可達到滅菌目的。五遍，可達到滅菌目的。不同植物不同部位都有各自不同植物不同部位都有各自的特點，即使同樣的植物組織，由于栽培條件或季節(jié)的特點，即使同樣的植物組織，由于栽培條件或季節(jié)不同，污染情況也不同。滅菌方式也有所差異。不同，污染情況也不同。滅菌方式也有所差異?？蓞⒖蓞⒄障嗨浦参锏臏缇蚴峭ㄟ^實驗得到最適滅菌方式。照相似植物的滅菌或是通

18、過實驗得到最適滅菌方式。3、接種、接種有點外科醫(yī)生的感覺有點外科醫(yī)生的感覺取材、滅菌后接種取材、滅菌后接種修剪外植體修剪外植體 接種接種Inoculation 5、光照培養(yǎng)、光照培養(yǎng)(組培室組培室)4 4、增殖、增殖培養(yǎng)培養(yǎng)初代培養(yǎng)初代培養(yǎng) 外植體外植體初代培養(yǎng)初代培養(yǎng) 繼代增繼代增 殖殖生根苗馴化生根苗馴化 誘導(dǎo)生根誘導(dǎo)生根繼繼代代循循環(huán)環(huán) 返返回回蝴蝶蘭Phalaenopsis生根苗卡特蘭Cattleya生根苗石斛蘭Dendrobium生根苗石斛蘭(Dendrobium)瓶苗我們的小苗長大了我們的小苗長大了分化完全的百合小苗分化完全的百合小苗5、移栽、移栽植物細胞培養(yǎng)主要幾種技術(shù)：植物細胞培養(yǎng)主要幾種技術(shù)：1 1、組織培養(yǎng)、組織培養(yǎng)2 2、懸浮細胞培養(yǎng)、懸浮細胞培養(yǎng)3 3、原生質(zhì)體培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)4 4、單倍體培養(yǎng)、單倍體培養(yǎng) 通過調(diào)節(jié)通過調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)劑營養(yǎng)物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)劑的適當配比，誘導(dǎo)愈的適當配比，誘導(dǎo)愈傷組織傷組織分化出芽和根的分生組織分化出芽和根的分生