益氣活血方藥對老年大鼠肝臟衰老相關(guān)基因表達(dá)的影響

1、益氣活血方藥對老年大鼠肝臟衰老相關(guān)基因表達(dá)的影響 07-09-12 14:41:00 編輯：studa20 作者：黎志萍，趙偉康，徐品初，陳方敏，金國琴，姚明忠 【關(guān)鍵詞】 肝細(xì)胞 摘要目的：觀察益氣、活血方藥對老年大鼠肝臟衰老相關(guān)基因表達(dá)的影響。方法：以自然衰老大鼠為衰老模型，采用RTPCR、Western blotting法研究益氣、活血方藥對老年大鼠肝臟p16、p21、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）、cyclin D1和cyclin E mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：老年大鼠肝臟p16、p21、cyclin D1

2、mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)增加；PCNA、cyclin E mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)降低。與老年大鼠比較，益氣、活血方藥可下調(diào)老年大鼠肝臟cyclin D1 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，上調(diào)促進(jìn)增殖基因cyclin E mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，但對p16、p21和PCNA的調(diào)節(jié)作用不明顯。結(jié)論：益氣、活血方藥主要通過調(diào)控cyclin D1和cyclin E mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。關(guān)鍵詞衰老大鼠; 肝細(xì)胞; p16; p21; 增殖細(xì)胞核抗原; cyclin D1; cyclin E; 益氣方; 活血方Effects of recipes for replenishing qi and

3、 activating blood on senescence related gene expressions in the liver of aging ratsABSTRACT Objective: To observe the effects of recipes for replenishing qi and activating blood on p16, p21, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), cyclin D1 and cyclin E gene expressions in the liver of aging rats

4、. Methods: A recipe for replenishing qi and a recipe for activating blood were administered to aging rats respectively, and the effects of the above recipes on the expressions of senescence related genes (p16, p21, PCNA, cyclin D1 and cyclin E) were examined by RTPCR and Western blotting methods. Re

5、sults: The expressions of p16, p21 and cyclin D1 mRNAs and proteins in the liver of the untreated aging rats were upregulated, while the expressions of PCNA and cyclin E mRNAs and proteins decreased. As compared with the untreated aging rats, both recipes could downregulate the expressions of cyclin

6、 D1 mRNA and protein and upregulate the expressions of cyclin E mRNA and protein, but had no obvious effects on the expressions of mRNAs and proteins of p16, p21 and PCNA. Conclusion: Recipes for replenishing qi and activating blood can improve the liver cell proliferation of aging rats via downregu

7、lating the expressions of cyclin D1 mRNA and protein and upregulating the expressions of cyclin E mRNA and protein.KEY WORDS aging rats; hepatocytes; p16; p21; proliferating cell nuclear antigen; cyclin D1; cyclin E; qibenefiting recipe; bloodactivating recipe 隨著細(xì)胞及分子生物學(xué)的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些與細(xì)胞衰老密切相關(guān)的基因及轉(zhuǎn)錄因子（反

8、式作用因子）13?？v觀歷代中醫(yī)文獻(xiàn)，延緩衰老的方藥基本屬于補腎、健脾、益氣和活血范疇。近代研究顯示：上述四類方藥均有不同程度抗自由基、調(diào)節(jié)免疫功能、提高肝臟蛋白質(zhì)含量、改善肝臟超微結(jié)構(gòu)等延緩衰老的作用4。實驗研究還表明：補腎方藥能促進(jìn)老年大鼠肝臟cHras、cmyc、cfos、cjun mRNA的表達(dá)，下調(diào)p53 mRNA的表達(dá)5。本實驗從細(xì)胞增殖調(diào)控角度，根據(jù)中醫(yī)理論，從益氣活血的抗衰經(jīng)典方中分別選擇幾味有代表性的中藥組成小復(fù)方，以自然衰老大鼠為衰老模型，應(yīng)用RTPCR和Western blotting法研究益氣、活血方藥對老年大鼠肝臟衰老相關(guān)基因p16、p21、cyclin D1、增殖細(xì)胞

9、核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和cyclin E表達(dá)的影響。1材料與方法1.1實驗中藥 益氣方選用黨參、黃芪、炙甘草（取自時氏醫(yī)道保元湯），活血方選用川芎、當(dāng)歸、赤芍（取自經(jīng)方四物湯）。中藥制劑采用水提醇沉法制備后，分裝于消毒好的塑料瓶中，于20 保存。1.2實驗動物 SD雄性大鼠（上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供）24只，分成青年對照組（5月齡）、老年對照組（22月齡）、老年益氣組（22月齡）和老年活血組（22月齡）。老年益氣組和活血組的用藥劑量為臨床成人劑量的20倍（按每千克體質(zhì)量的用藥量進(jìn)行換算），采用飲料方式給藥，每周服藥5 d

10、，停藥2 d，自1822月齡連續(xù)給藥4個月。1.3RTPCR 肝組織細(xì)胞總的RNA按Trizol一步法提取，具體步驟按試劑說明書操作。actin PCR引物6：5CCAGCCATGTACGTTGCTATCCAG 3，5GGAACCGCTCATTGCCAATGGTGA 3，擴(kuò)增片段為378 bp；p16 PCR引物：5ATGGAGTCCTCTGCAGATAG 3，5TTAG CGCTGCTTTGGGGGTT 3，擴(kuò)增片段為480 bp；p21PCR引物：5ATGTCCGATCCTGGTGATGT3，5GGGCTTTCTCTTGCAGAAGA 3，擴(kuò)增片段為495 bp；cyclin D1 PCR

11、引物：5ATGGAACACCAGCTCCTGTG 3，5TGGTGTTCCATGTCGGTGG 3，擴(kuò)增片段為888 bp；PCNA PCR引物：5ATGTTTGAGGCACGCCTGAT3，5AGATCCTTCTTCATCTTCGA 3，擴(kuò)增片段為786 bp；cyclin E PCR引物：5AAAGAAGAAGGTGGTTCCGA 3，5TCATTCTGTCTCCT GCTCAC 3，擴(kuò)增片段為1 191 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為50 l。擴(kuò)增程序為：95 （30 s） 變性94 （30 s）退火55 (30 s)延伸72 (30 s)30個循環(huán)72 （7 min）4 貯存。根據(jù)目的片

12、段的長短及引物的Tm值設(shè)置退火溫度及延伸時間。PCR產(chǎn)物鑒定電泳，紫外燈下觀察，圖像分析系統(tǒng)掃描。1.4Western Blotting 采用放射免疫沉淀測定法(radioimmunoprecipitation assay, RIPA)7。取肝臟組織100 mg加入單去污細(xì)胞裂解液900 l，冰浴中勻漿。勻漿后立即加入100 l蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟液(phenylmethylsulphonyl fluoride, PMSF)和40 l混合蛋白酶抑制complete液(complete EDTAfree protease inhibitor cocktail tablet, 1片加1 ml水

13、），4 10 000 r/min離心10 min，取上清液于70 冷凍保存。24 h后10 000 r/min離心10 min，取上清液分裝，70 冷凍保存。Lowry (FolinCiocalteau)法8測定蛋白含量。各組蛋白各取30 g，采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis, SDSPAGE)和免疫印跡反應(yīng)，用Supersignal ECL發(fā)光劑熒光顯色X光膠片曝光，觀察蛋白條帶。1.5圖像處理及統(tǒng)計分析 RTPCR、Westernblotting實驗結(jié)果分別采用Leica Q

14、500IW和上海復(fù)日Smartview 2001生物電泳圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 9.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，統(tǒng)計學(xué)方法采用方差分析及q檢驗。2結(jié)果2.1益氣、活血方藥對大鼠肝臟衰老相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響與青年組比較，老年大鼠肝臟p16、p21、cyclin D1基因mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)（P0.01），PCNA和cyclin E mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)（P0.01）。與老年組比較，益氣、活血方藥組cyclin D1基因mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)（P0.01），而cyclin E mRNA的表達(dá)則明顯上調(diào)。益氣、活血方藥對p16、p21和PCNA mRNA的表達(dá)有改

15、善作用，但無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1、圖2、表1。2.2益氣、活血方藥對大鼠肝臟衰老相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響與青年組比較，老年大鼠肝臟p16、p21、cyclin D1基因蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P0.01），PCNA和cyclin E蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P0.01）。與老年組比較，益氣、活血方藥組cyclin D1基因蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P0.01），而cyclin E蛋白表達(dá)明顯升高（P0.01）。見表2、圖3。圖1 p16和p21瓊脂糖凝膠電泳（略）Fig 1 Agarose gel electrophoresis of p16 and p21M: Marker; 1:Young control group; 2: Untreated group; 3: Qibenefiting recipetreated group; 4: Bloodactivating recipe tre