動(dòng)力學(xué)機(jī)理研究

1、磷脂酶D催化合成磷脂酰絲氨酸反應(yīng)抑制動(dòng)力學(xué)的研究摘 要：磷脂酶D（PLD）催化磷脂酰膽堿（PC）磷脂?；D(zhuǎn)移合成磷脂酰絲氨酸（PS）的反應(yīng)在油-水兩相體系中進(jìn)行，此法是目前制備PS最為廣泛的一種方式，但其機(jī)理尚不明確。本文在PH 5.5，溫度28，200 rpm/min的恒溫?fù)u床中，進(jìn)行不同濃度PC在PLD催化下發(fā)生的轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)，發(fā)現(xiàn)隨著PC濃度的增加，PC的轉(zhuǎn)化率及PS的收率均呈下降趨勢(shì)。為驗(yàn)證PC轉(zhuǎn)化率及PS收率的下降是由于生成膽堿濃度的增高所影響的，繼而在不同PC濃度下分別加入3、6mM的抑制劑（膽堿）進(jìn)行轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)，探討膽堿在PLD催化下的抑制機(jī)理，建立了無(wú)膽堿抑制和有膽堿抑制

2、時(shí)的動(dòng)力學(xué)模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果很好的符合了所提假設(shè)，對(duì)PS的工業(yè)化生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。關(guān)鍵字：磷脂酰絲氨酸；磷脂酰膽堿；磷脂酶D；轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)Inhibition kinetics of conversion of phosphatidycholine to phosphatidylserine by phospholipase DAbstract: The synthetic reaction of phosphatidyserine(PS) from phosphatidylcholine(PC) catalyzed by phospholipase D(PLD) was carried in

3、oil-water two phase system. It is the most extensive widely-used way for the preparation of PS, but the reaction mechanism of transphosphatidylation and hydrolysis by PLD remains unclear. The conversion of PC to PS was carried out at a Constant temperature shaking table with the speed of 200 rpm/min

4、, pH 5.5 and 28, with an increase in the PC concentration, the conversion of the PC and the yield of the PS all decreased. The effect of the high choline concentration for the decrease was investigatedby the addition of 3、6mM depressor (choline) in the transphosphatidylation system with different co

5、ncentration of PC,respectively. The inhibitory mechanisms of choline in PLD catalytic reaction was explored, then we described two reaction models which are free inhibition intrinsic kinetic model and inhibition intrinsic kinetic model, The experimental data agreed well with the simulation results,

6、these model may serve as a predictor for the industrialized production of the PS.Key words: phosphatidylserine; transphosphatidylation; kinetic model; inhibition;磷脂酰絲氨酸（PS）是一種體內(nèi)分布廣而功能獨(dú)特的稀有磷脂，研究表明，PS能夠增強(qiáng)神經(jīng)遞質(zhì)效率，促進(jìn)腦部信息傳遞，激發(fā)大腦活化狀態(tài)，具有促進(jìn)用腦疲勞的恢復(fù)、改善記憶力、預(yù)防老年癡呆癥、治療兒童多動(dòng)癥、平衡情緒、緩解抑郁等多種療效1-4。PS已成為重要的保健品，市場(chǎng)需求不斷擴(kuò)大5

7、。然而，天然磷脂中PS含量很低，利用磷脂酶D（PLD）催化的磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)由廉價(jià)的大豆磷脂（磷脂酰膽堿，PC）合成PS是受到研究人員廣泛重視的工藝。典型PLD催化的磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)是水-有機(jī)溶媒雙液相體系。據(jù)報(bào)道，盡管在大大過(guò)量的磷脂?；荏wL-絲氨酸存在下，產(chǎn)物收率仍難于進(jìn)一步提高，這不僅增加了原料、酶的消耗，也影響了產(chǎn)品PS的純度。為了掌握磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的規(guī)律，需要研究磷脂酶D催化磷脂合成PS過(guò)程中，酶、受體和底物磷脂的動(dòng)力學(xué)行為。Ogino等人發(fā)現(xiàn)在鏈霉菌屬磷脂酶D催化的磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)過(guò)程中，受體乙醇胺存在抑制，而甘油無(wú)抑制效應(yīng)6，說(shuō)明不同受體其抑制效應(yīng)不同；而據(jù)Juneja等報(bào)道

8、，絲氨酸無(wú)抑制效應(yīng)7；Damnjanovi J等總結(jié)了磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)過(guò)程的受體效應(yīng)，認(rèn)為無(wú)抑制效應(yīng)時(shí)，受體的濃度應(yīng)該足夠高以確保高效，并有效抑制與轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)相競(jìng)爭(zhēng)的底物水解作用8；為滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求，人們期待通過(guò)增加底物PC濃度達(dá)到高效生產(chǎn)PS的目的，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著PC濃度的增大，其轉(zhuǎn)化率反而有所下降，Juneja等認(rèn)為磷脂酶D催化反應(yīng)的副產(chǎn)物膽堿對(duì)轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)具有抑制效應(yīng)9。不同來(lái)源的磷脂酶D具有高度保守的序列結(jié)構(gòu)，所包含HKD模體構(gòu)成活性部位10-12，而 GG/GS 模體構(gòu)成結(jié)合部位13,14。反應(yīng)被認(rèn)為是兩步ping-pong機(jī)理，首先組氨酸殘基咪唑-N親核進(jìn)攻底物磷原子形成共

9、價(jià)結(jié)合的磷脂酰-酶中間物，然后中間物被水解或醇解。綜上所述，本文著眼于雙液相磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)中的受體底物大量過(guò)量事實(shí)，提出了受體底物預(yù)飽和假設(shè)，關(guān)聯(lián)副產(chǎn)物膽堿抑制效應(yīng)，建立動(dòng)力學(xué)模型，并對(duì)其中的模型參數(shù)進(jìn)行了數(shù)值計(jì)算，為優(yōu)化反應(yīng)條件并提高產(chǎn)物收率提供理論依據(jù)。1 材料與方法1.1儀器與設(shè)備電子天平（T-114，美國(guó)Denver），pH計(jì)（PB-10，德國(guó)Sartorius），掃描儀（Pro800，日本Canon），碘蒸氣染色缸（200cm×400cm，上海信誼）；恒溫?fù)u床（KYC 100B，上海?，敚?；薄層展開(kāi)缸（PQ，上海信誼）；干燥箱（DHG-9031A，上海一恒）。1.2材料與

10、試劑PLD（比活力大于8.0 U/mg，實(shí)驗(yàn)室自制，方法參見(jiàn)文獻(xiàn)15），大豆磷脂酰膽堿（PC-90，平均分子量760，上海復(fù)力），L-絲氨酸（無(wú)錫必勝），氯化膽堿（國(guó)藥集團(tuán)），薄層硅膠預(yù)制板（GF254，上海信誼）。其它化學(xué)試劑均為市購(gòu)分析純。1.3實(shí)驗(yàn)及檢測(cè)方法1.3.1 磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng) 由PC磷脂?；D(zhuǎn)移合成PS的反應(yīng)在雙液相體系中進(jìn)行，有機(jī)相為15.0 ml乙醚溶解一定濃度的大豆磷脂酰膽堿；水相由溶解1.05 g 的L-絲氨酸7.8 ml的0.2 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH 5.5）和0.2 ml磷脂酶D組成。有機(jī)相與水相在磨口錐形瓶中混合后開(kāi)始反應(yīng)，密封良好的反應(yīng)瓶于28、200

11、r/min的搖床中搖振進(jìn)行雙相反應(yīng)。一定時(shí)間間隔提取0.1 ml有機(jī)相樣品，并以TCL檢測(cè)磷脂組成。1.3.2 膽堿對(duì)反應(yīng)的抑制作用在1.3.1的反應(yīng)體系中，水相添加一定濃度的氯化膽堿，其它條件不變，測(cè)定膽堿存在下磷脂酶D催化反應(yīng)過(guò)程組分濃度的變化。驗(yàn)證膽堿對(duì)PC磷脂?；D(zhuǎn)移合成PS反應(yīng)的抑制作用。1.3.3磷脂濃度測(cè)定反應(yīng)樣品的磷脂濃度采用薄層層析（TLC）法測(cè)定，有機(jī)相樣品用乙醚稀釋一定倍數(shù)后點(diǎn)樣10 µL于GF254薄層硅膠預(yù)制板上，以氯仿-甲醇-水-冰醋酸（65:25:5:1，體積比）為展開(kāi)劑在展開(kāi)缸中展開(kāi)，碘蒸氣顯色。TCL板用掃描儀掃描，斑點(diǎn)用Photoshop軟件計(jì)算面

12、積及灰度值，并與標(biāo)品濃度對(duì)照得到樣品中磷脂的濃度。2結(jié)果與討論2.1磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)過(guò)程磷脂酶D催化磷脂醇解 在絲氨酸存在的雙液相體系（水-乙醚）中催化PC磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)生成PS。圖1表示有機(jī)相PC濃度為10 mmol/L、水相絲氨酸濃度為1250 mmol/L（摩爾比為1:66.67，濃度比為1:125）時(shí)，在pH 5.5、28和搖床轉(zhuǎn)速200 r/min下反應(yīng)過(guò)程的組分濃度變化情況。圖1 轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)過(guò)程各組分濃度與時(shí)間的關(guān)系在反應(yīng)初期，PC、PS、PA和Cho各物質(zhì)的量呈線性變化，即反應(yīng)速率可視為一個(gè)定值常數(shù)，此反應(yīng)過(guò)程可視為無(wú)抑制的零級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)過(guò)程。30分鐘后隨著反應(yīng)的進(jìn)行，轉(zhuǎn)化

13、率升高，反應(yīng)速率不斷減小并趨于零，產(chǎn)物組成趨于一個(gè)定值常數(shù)，分析造成這一現(xiàn)象的原因很有可能產(chǎn)物膽堿對(duì)反應(yīng)過(guò)程的抑制效應(yīng)。2.2膽堿對(duì)磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的抑制作用為了驗(yàn)證膽堿對(duì)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)是否真的存在抑制效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)向反應(yīng)體系中直接加入膽堿，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，兩組反應(yīng)除膽堿濃度外，其余反應(yīng)條件均一樣。圖2 膽堿的加入對(duì)轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)過(guò)程的影響結(jié)果表明，膽堿的加入使得PC的轉(zhuǎn)化率下降了約10%，同時(shí)PS的產(chǎn)率下降接近18%。分析可能造成這一現(xiàn)象的原因：膽堿為三甲基氨的氫氧化物，強(qiáng)有機(jī)堿；磷脂酶D催化水/醇解的活性部位為HKD保守基序，其中的天冬氨酸為酸性氨基酸，容易與膽堿結(jié)合生成結(jié)

14、晶鹽，即膽堿與PLD結(jié)合導(dǎo)致PLD與底物親和力下降，影響PC轉(zhuǎn)化率及PS產(chǎn)率。2.3 動(dòng)力學(xué)模型的導(dǎo)出2.3.1 無(wú)膽堿抑制的動(dòng)力學(xué)模型對(duì)于低濃度PC下PLD催化的轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)，由于膽堿生成量很少，對(duì)反應(yīng)過(guò)程抑制不明顯，本實(shí)驗(yàn)在采取先忽略膽堿抑制的前提下，建立反應(yīng)模型。對(duì)于酶促反應(yīng)來(lái)說(shuō)，其反應(yīng)過(guò)程總是以生成絡(luò)合物的形式來(lái)實(shí)現(xiàn)的，對(duì)于PLD催化PC所發(fā)生的轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)與水解反應(yīng)可通過(guò)以下過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)（如圖3）：基于受體底物預(yù)飽和假設(shè)，酶首先與受體絲氨酸（Ser）結(jié)合得到E-Ser；E-Ser與PC發(fā)生親核反應(yīng)生成PC-E-Ser復(fù)合物；PC-E-Ser發(fā)生轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)生成PS并釋放出膽堿，在

15、發(fā)生此反應(yīng)的同時(shí)，PC-E-Ser還會(huì)發(fā)生水解反應(yīng)最終生成PA并釋放膽堿。 圖3：無(wú)膽堿抑制時(shí)，酶催化PC分別發(fā)生轉(zhuǎn)酯與水解反應(yīng)的機(jī)理由于PC水溶性很差，而絲氨酸又只溶解在水相中，因此假設(shè)轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)只發(fā)生在兩相接觸面上，在攪拌狀況下各相中各物質(zhì)濃度均勻一致，不考慮擴(kuò)散引起的傳質(zhì)效應(yīng)。以PS和PA的生成步為控速步驟，其他反應(yīng)過(guò)程可以迅速達(dá)到平衡，其中E表示反應(yīng)體系中的游離酶：K1=，K3= (1) RPC= (2)RPA= （3） RPS= （4）2.3.2 有膽堿抑制的動(dòng)力學(xué)模型 (a) (b)圖4：PC濃度對(duì)生成PS相對(duì)含量的影響。（a）,PS(2mM PC)；,PS(4mM PC)；,

16、PS(6mM PC)；,PS(8mM PC)；,PS(10mM PC)；(b),PC(2mM)；,PC(4mM)；,PC(6mM)；,PC(8mM)；,PC(10mM)由圖4可知，隨著PC濃度的增大，PS的相對(duì)生成含量不斷下降，PC轉(zhuǎn)化率也明顯降低，此時(shí)無(wú)抑制動(dòng)力學(xué)模型已經(jīng)無(wú)法良好地預(yù)測(cè)反應(yīng)過(guò)程。為探究產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因，膽堿抑制機(jī)理被廣泛接受9。通過(guò)向酶促反應(yīng)中加入定量膽堿，證實(shí)膽堿抑制機(jī)理。同時(shí)圖3中無(wú)抑制動(dòng)力學(xué)模型也應(yīng)得到修改，結(jié)果如圖5所示。圖5：有膽堿抑制時(shí)，酶催化PC分別發(fā)生轉(zhuǎn)酯與水解反應(yīng)的機(jī)理相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程如下：K5= （5）RPA= （6）RPS = （7）2.4 模型參數(shù)2

17、.4.1 無(wú)膽堿抑制的動(dòng)力學(xué)參數(shù)采用MATLAB工具對(duì)方程（1）（4）進(jìn)行處理。用龍格-庫(kù)塔算法實(shí)現(xiàn)對(duì)速率微分方程的求解，結(jié)合最小二乘的方法擬合方程中的四個(gè)參數(shù)（平衡常數(shù)：K1、K3；反應(yīng)速率常數(shù)：k+2、k+4），擬合過(guò)程基于下式： （8）其中，PCreal,i、PSreal,i、PAreal,i、Choreal,i分別為PC、PS、PA、Cho實(shí)驗(yàn)測(cè)定值；PCsimul,i、PS simul,i、PA simul,i、Cho simul,i分別為PC、PS、PA、Cho在對(duì)應(yīng)時(shí)刻，相同條件下，軟件的擬合值，所得參數(shù)值如表1所示。2.4.2 有膽堿抑制的動(dòng)力學(xué)參數(shù)方法同無(wú)膽堿抑制時(shí)相同，對(duì)方

18、程（1）、（2）、（5）（7）進(jìn)行求解，加入不同濃度膽堿時(shí)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表1所示。表1 外加不同濃度膽堿時(shí)的動(dòng)力學(xué)參數(shù) 參數(shù) 外加膽堿(mM)K1k+2K3k+4K500.47231.2220.23331.1842/30.48231.3540.26311.18260.36560.48291.3590.26171.18220.365化學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)及平衡常數(shù)都是溫度的函數(shù)，與濃度無(wú)關(guān)；本實(shí)驗(yàn)中各反應(yīng)溫度等條件均一致，只改變膽堿的濃度，故所求參數(shù)應(yīng)保持不變，與表1結(jié)果相符，說(shuō)明機(jī)理穩(wěn)定。由K5可看出確實(shí)存在膽堿抑制效應(yīng)，表明膽堿的加入會(huì)直接影響酶與底物的親和力，造成酶和底物結(jié)合能力變?nèi)?，屬于?jìng)爭(zhēng)性

19、抑制。2.5 模型評(píng)價(jià)(a) (b) (c)圖6 對(duì)所提機(jī)理的驗(yàn)證（a，b）不同初始膽堿含量下，PC向PS轉(zhuǎn)化：() 0mM；() 6mM；（c）不同初始膽堿含量下，PC濃度對(duì)PS初始生成速率的影響：() 0mM；() 6mM圖（a）、（b）分別為反應(yīng)體系中PC、PS含量隨時(shí)間的變化情況，其中曲線是根據(jù)上文建立的模型，利用matlab軟件進(jìn)行數(shù)值計(jì)算得到的擬合曲線，點(diǎn)表示實(shí)驗(yàn)過(guò)程的測(cè)定值。如圖所示，PC的轉(zhuǎn)化速率及PS的生成速率都隨初始膽堿含量的增加而減小，PC的轉(zhuǎn)化率也有所降低，兩者的擬合數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)吻合良好，驗(yàn)證了膽堿抑制假設(shè)；為了進(jìn)一步驗(yàn)證機(jī)理的合理性，根據(jù)上述所求動(dòng)力學(xué)參數(shù)表達(dá)出PS

20、的生成速率方程，在不同初始膽堿含量下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別測(cè)定不同PC濃度對(duì)PS初始生成速率的影響，理論值與實(shí)驗(yàn)值如圖（c）所示，在固定初始膽堿含量的情況下，PS初始生成速率隨PC濃度的增加而增加，而在相同PC濃度時(shí)，增大膽堿初始含量，PS初始生成速率明顯降低，計(jì)算結(jié)果和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)吻合良好，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了假設(shè)模型的合理性。3、結(jié)論 采用PLD催化磷脂酰膽堿進(jìn)行酯交換反應(yīng)是合成PS最有效的方法。本文通過(guò)在反應(yīng)體系中加入膽堿與不加膽堿時(shí)對(duì)PS與PA生成速率的影響，建立了PLD催化磷脂酰膽堿發(fā)生轉(zhuǎn)?；磻?yīng)的動(dòng)力學(xué)方程。本實(shí)驗(yàn)中絲氨酸與磷脂酰膽堿（PC）加入的物質(zhì)的量之比為100:1，反應(yīng)條件為PH 5.5，

21、溫度28oC，200 rpm/min的恒溫?fù)u床。由動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著底物PC濃度的增大，生成膽堿的含量也在增多，膽堿與PLD結(jié)合造成PLD與PC親和力變?nèi)?，?dǎo)致PS的生成速率與PC的轉(zhuǎn)化率降低。從動(dòng)力學(xué)角度可知，若在反應(yīng)過(guò)程中移除膽堿，則可以大大提高PS的生成量。參考文獻(xiàn)1Suzuki S, Yamatoya H, Sakai M, et al. Oral administration of soybean lecithin transphosphatidylated phosphatidylserine improves memory impairment in aged rats.J.

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