生胃酮對(duì)大鼠頸動(dòng)脈損傷后新生內(nèi)膜過(guò)度增殖的影響

1、生胃酮對(duì)大鼠頸動(dòng)脈損傷后新生內(nèi)膜過(guò)度增殖的影響         10-08-11 14:25:00     編輯：studa20             作者：宋明寶，于學(xué)軍，崔馨，陳劍飛，盧來(lái)春，趙剛，于世勇，董紅梅，黃嵐【摘要】  目的：觀察生胃酮對(duì)大鼠頸動(dòng)脈損傷后新生內(nèi)膜過(guò)度增殖的影響。方法：采用組織貼塊法培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，Weste

2、rn blot檢測(cè)生胃酮對(duì)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞縫隙連接蛋白43表達(dá)的影響。采用球囊損傷建立大鼠頸動(dòng)脈損傷模型，對(duì)照組給予生理鹽水2 mL、生胃酮組給予生胃酮3 mg/kg 腹腔注射，1次/d，HE染色觀察新生內(nèi)膜形成情況，免疫熒光染色檢測(cè)新生內(nèi)膜中縫隙連接蛋白43的表達(dá)，伊文思藍(lán)DAPI雙染色以評(píng)價(jià)新生內(nèi)膜形成情況。結(jié)果：所培養(yǎng)的細(xì)胞抗SM actin免疫熒光染色陽(yáng)性。50 mol/L生胃酮處理平滑肌細(xì)胞24 h后對(duì)縫隙連接蛋白43的表達(dá)無(wú)影響(0.85±0.06 vs 0.83±0.03，n=3，P>0.05)。球囊損傷大鼠頸動(dòng)脈14 d后可見(jiàn)血管管腔狹窄、新生內(nèi)膜

3、增生明顯。免疫熒光染色顯示形成的新生內(nèi)膜中縫隙連接蛋白43表達(dá)豐富。經(jīng)生胃酮干預(yù)后新生內(nèi)膜增生明顯減輕，新生內(nèi)膜細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著低于對(duì)照組 (89±28.40 vs 236±15.04，n=5，P<0.01)。結(jié)論:縫隙連接在血管損傷后新生內(nèi)膜形成過(guò)程中扮演重要角色，而縫隙連接阻斷劑生胃酮能抑制新生內(nèi)膜過(guò)度增生。 【關(guān)鍵詞】  新生內(nèi)膜;血管;縫隙連接;生胃酮;大鼠Abstract Objective: To observe the effect of carbenoxolone on neointimal hyperplasia after rat carot

4、id balloon injury. Methods: Rat aortic SMCs (RASMCs) were cultured by explanted rat aortic wall tissue and identified with cell immunofluorescence staining for SMactin. The expression of Cx43 in RASMCs which were treated with carbenoxolone at a concentration of 50 mol/L for 24 h was detected with we

5、stern blot. The model of vascular injury was established with rat carotid balloon injury. And animals were administrated with intraperitoneal injections of carbenoxolone 3 mg/(kg·d) in the carbenoxolone group or with saline (2 mL/d) in the control group for 2 weeks after carotid balloon injury.

6、 After 2 weeks, HE staining and DAPIEvens blue double staining were applied to evaluate the neointimal formation of targeted vessels. And cell immunofluorescence staining was used to detect protein Cx43 expression on targeted vessels. Results: RASCMCs were cultured successfully with positive immunof

7、luorescence staining for SM actin. In this experiment, we found that carbenoxolone couldn±±, n=3, P>0.05). Two weeks after carotid balloon injury, carbenoxolone could significantly reduce the neointimal formation and the stenosis of blood vessel lumen. When nuclei number of neointima wa

8、s used to evaluate the neointimal formation, result suggested that nuclei number of neointima in carbenoxolone group was significantly lower than that in the control group (89±28.40 vs 236±15.04， n=5， P<0.01). The expression of Cx43 protein in neointima was abundant. Conclusions: Gap ju

9、nctions play a key role in neointimal hyperplasia, and carbenoxolone, a special blocker of gap junction, can inhibit neointimal hyperplasia after rat carotid balloon injury.Key words Neointima; Vessel; Gap junction; Carbenoxolone; Rat血管損傷后不良修復(fù)反應(yīng)是血管損傷性疾病如兒童過(guò)敏性紫癜、動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄等的主要病理生理學(xué)基礎(chǔ)，其中關(guān)鍵環(huán)節(jié)是血管平

10、滑肌細(xì)胞由血管壁中層向內(nèi)膜遷移并增殖，從而導(dǎo)致新生內(nèi)膜形成并導(dǎo)致血管狹窄。抑制新生內(nèi)膜過(guò)度增殖是血管損傷性疾病防治的重要策略。縫隙連接是相鄰細(xì)胞間的膜通道結(jié)構(gòu)，它由細(xì)胞膜上的連接子相互銜接而成。每個(gè)連接子包含六個(gè)相同啞鈴形蛋白質(zhì)亞單位縫隙連接蛋白(connexin, Cx)、連接子即Cx的六聚體所形成的跨膜蛋白通道1。該跨膜通道可允許小的信號(hào)分子和離子通過(guò)，在維持組織動(dòng)態(tài)平衡、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育及分化中具有重要作用1。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Cx在血管損傷性疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。本研究在大鼠頸動(dòng)脈損傷模型的基礎(chǔ)上探討縫隙連接特異性阻斷劑生胃酮對(duì)血管損傷后新生內(nèi)膜過(guò)度增殖的影響。1 材料與

11、方法1.1 材料1.1.1 試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)及DAPI購(gòu)于美國(guó)Gibco BRL公司;生胃酮及兔抗鼠平滑肌肌動(dòng)蛋白(SM actin)單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;羊抗縫隙連接蛋白43多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司; FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體購(gòu)于北京中杉公司。1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SpragueDawley大鼠，體重150180 g/只，購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(軍)2002029。1.2 方法1.2.1 大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 用頸椎脫臼法處死動(dòng)物

12、，在無(wú)菌條件下取大鼠胸腹主動(dòng)脈，仔細(xì)清除血管外膜及脂肪組織，將血管縱向剖開(kāi)，用0.01 PBS漂洗干凈，用眼科鑷刮去血管內(nèi)膜，放入50 mL培養(yǎng)瓶中，在瓶口用眼科剪剪成約1.5 mm×1.5 mm大小的組織塊，用吸管將組織塊隨機(jī)鋪于瓶底，放入37 、5%CO2的培養(yǎng)箱中貼壁4 h后加入含20% FBS及雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。以后每3 d更換培養(yǎng)液1次。采用抗SM actin免疫熒光染色鑒定血管平滑肌細(xì)胞。1.2.2 生胃酮對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞Cx43表達(dá)的影響 將培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)3 d后加入生胃酮使其終濃度為50 mol/L，置37 、5%CO2條件下繼

13、續(xù)培養(yǎng)24 h。未加18 GA 預(yù)處理的細(xì)胞作為對(duì)照。收集細(xì)胞后經(jīng)裂解液裂解，離心后取上清液，用Lowry法進(jìn)行蛋白定量，十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDSPAGE)(11%分離膠、4%濃縮膠)電泳，400 V，上樣量70 L。2 h后硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)印2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，羊抗大鼠Cx43多克隆抗體(11 000)孵育過(guò)夜，再與15 000 的HRP 標(biāo)記的兔抗羊抗體結(jié)合(水平振蕩搖床1 h)。ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯影，X線片感光洗片，用凝膠成像分析儀進(jìn)行蛋白相對(duì)定量分析。1.2.3 大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型的建立 參照韓雅玲等2的方法復(fù)制大鼠頸動(dòng)脈損傷模型。簡(jiǎn)述如下：SD大鼠，用2%

14、戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔麻醉。取頸部正中切口，頸外靜脈注射肝素鈉100 U/kg。無(wú)菌條件下游離出頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，暫時(shí)阻斷頸總動(dòng)脈近心端及頸外動(dòng)脈血流，結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，用眼科剪在結(jié)扎點(diǎn)旁距頸內(nèi)動(dòng)脈分叉點(diǎn)約3 mm處剪開(kāi)動(dòng)脈，將1.5 F的Fogarty球囊導(dǎo)管從切口處插入頸總動(dòng)脈約1.5 cm，1.5大氣壓充盈球囊，使球囊剛好能在血管中拉動(dòng)，在遠(yuǎn)心端緩慢回拉球囊至頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分叉處，重復(fù)拉動(dòng)3次，每次間隔2 min，間隔期球囊處于充盈狀態(tài)，以使損傷區(qū)缺血缺氧。結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處，常規(guī)縫合皮下組織和皮膚。14 d后處死動(dòng)物，取出病變血管及對(duì)側(cè)正常血管，OCT包埋后行冰

15、凍切片，經(jīng)冷丙酮固定5 min后進(jìn)行HE染色以觀察新生內(nèi)膜形成情況。1.2.4 血管損傷后形成的新生內(nèi)膜中Cx43表達(dá)的檢測(cè) 14 d后處死動(dòng)物。步驟簡(jiǎn)述如下：(1) PBS漂洗1次;(2)0.3%TritonX100室溫下孵育10 min;(3) PBS洗滌5 min×3次;(4) 10%正常兔封閉血清37 孵育20 min;(5) 吸棄封閉血清，滴加羊抗Cx43多克隆抗體(1100)稀釋，陰性對(duì)照組用PBS替代一抗，置于濕盒中4 冰箱過(guò)夜;(6)PBS洗滌5 min×3次;(7)滴加FITC標(biāo)記兔抗羊IgG(用0.3%伊文思藍(lán)按1200稀釋)，37 孵育60 min;(

16、8)PBS洗滌5 min×3次;(9)熒光倒置顯微鏡觀察照相。1.2.5 生胃酮對(duì)血管損傷后新生內(nèi)膜過(guò)度增殖的影響 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組及生胃酮組。對(duì)照組在球囊損傷后給予生理鹽水2 mL 腹腔注射，1次/d。生胃酮組在球囊損傷后給予生胃酮3 mg/kg3腹腔注射，1次/d。14 d后處死動(dòng)物，取出病變血管段，OCT包埋后行冰凍切片，經(jīng)冷丙酮固定5 min后行伊文思藍(lán)DAPI雙染色以評(píng)價(jià)新生內(nèi)膜形成情況。步驟簡(jiǎn)述如下：(1) PBS洗滌2 min×3次;(2) 滴加DAPI工作液于切片上，避光室溫下孵育2 min;(3) PBS洗滌2 min×3次;(4) 滴加0.3%伊文思藍(lán)于切片上，避光室溫孵育5 min;(5) PBS洗滌2 min×3次;(6) 熒光倒置顯微鏡觀察，分別用綠色熒光和藍(lán)色熒光對(duì)同一視野攝像，通過(guò)計(jì)算機(jī)圖像分析軟件Ima