豬傳染性胃腸炎病毒抗體-IgM(TGEV-IgM)酶聯(lián)免疫分析

1、豬傳染性胃腸炎病毒抗體-IgM (TGEV-IgM)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用產(chǎn)品編號：CSB-E12716p最低檢測限：1 ng/ml特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的豬TGEV (IgM)，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應。有效期：6個月預期應用：ELISA法半定量測定豬血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中TGEV (IgM)含量。說明 1試劑盒保存：-20（較長時間不用時）；2-8（頻繁使用時）。2濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。 3中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。4剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正常

2、現(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。實驗原理用TGEV抗原包被酶標板，制成固相載體。向微孔中先加入待測樣品進行反應，然后再加入辣根過氧化物酶標記抗豬IgM進行反應，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TGEV (IgM)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品中抗體的效價（抗血清最終能顯色的最高稀釋倍數(shù)記為效價）。 試劑盒組成及試劑配制 1. 酶聯(lián)板(Assay plate )：一塊（96孔）。 2. 樣品稀釋液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。3. 辣根過

3、氧化物酶標記抗豬IgM稀釋液 （HRP-anti-porcine IgM Diluent）：1×10ml/瓶。4. 辣根過氧化物酶標記抗豬IgM（HRP-anti-porcine IgM）：1×120l/瓶（1：100）。5. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 6. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 7. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。需要而未提供的試劑和器材1. 標準規(guī)格酶標儀2. 高速離心機3. 電熱恒溫培養(yǎng)

4、箱4. 干凈的試管和Eppendof管5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，最好用多通道移液器6.蒸餾水，容量瓶等標本的采集及保存 1. 血清：全血標本請于室溫放置2小時或室溫過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20或-80保存，但應避免反復凍融。2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)吮痉庞?20或-80保存，但應避免反復凍融。3. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20或-80保存，但應避免反復凍融。注：

5、標本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。標本的稀釋原則：首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當?shù)南♂尡稊?shù)。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄。最后計算抗體效價時，稀釋了“N”倍，標本中抗體的效價為“N”。辣根過氧化物酶標記抗豬IgM的稀釋原則：臨用前以辣根過氧化物酶標記抗豬IgM稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100l），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10l辣根過氧化物酶標記抗豬IgM加990l辣根過氧化物酶標記抗豬IgM稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。操作步驟實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品?/p>

6、釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。1. 加樣：分別設空白孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00l，余孔加待測樣品100l，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37反應120分鐘。2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加辣根過氧化物酶標記抗豬IgM工作液 100l（取1l生物素標記抗體加99l生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37，60分鐘。3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350l/每孔，甩干。4

7、. 依序每孔加底物溶液90l，37避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見孔內(nèi)有明顯藍色，即可終止）。5. 依序每孔加終止溶液50l，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。6. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。注：1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。 3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板

8、放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜。4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8保存。辣根過氧化物酶標記抗豬IgM工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的辣根過氧化物酶標記抗豬IgM工作液。5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。計算為檢測樣品中TGEV (IgM)效價，客戶可以采取樣品2倍倍比稀釋樣品計算抗體效價，一般采取以1:40為起始稀釋倍數(shù)（使用樣品稀釋液進行稀釋）。最大稀釋倍數(shù)根據(jù)客戶自身試驗要求而定，最終顯色與陰性對照孔進行比較，有明顯差異的最大稀釋度定為抗體的最終效價。注意事項1. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。3. 一次加