葡萄和葡萄酒中聚合色素的測(cè)定

1、葡萄和葡萄酒中聚合色素的測(cè)定作者：盛慧 彭軍 李運(yùn)   發(fā)布時(shí)間：2005-8-12 摘要：采用蛋白質(zhì)沉淀和傳統(tǒng)二氧化硫脫色分析方法測(cè)定聚合色素中單分子花色素。葡萄和葡萄酒中兩種聚合色素：小分子色素（SPP）與蛋白質(zhì)不產(chǎn)生沉淀而大分子色素(LPP)則產(chǎn)生。分析成熟期和采摘期赤霞珠、西拉葡萄漿果內(nèi)的聚合物色素成分，其果粒中含有的聚合色素比相應(yīng)的葡萄酒少。在葡萄酒中找到的多數(shù)大分子聚合色素是在葡萄酒釀造過(guò)程中產(chǎn)生的。通過(guò)對(duì)照，葡萄酒和其果粒中小分子色素含量相比較是不穩(wěn)定的、變化的，西拉中SPP降低，赤霞珠SPP增加，黑比諾SPP變化很小。蛋白質(zhì)沉淀和二氧化硫漂白分析研究得出葡萄

2、汁和葡萄酒中的單寧酸和聚合色素有相同的結(jié)論。 關(guān)鍵詞：聚合色素  花青素  單寧酸  原花青素   成熟果實(shí)   蛋白質(zhì)沉淀 Abstract：By combining protein precipitation and traditional bisulfite bleaching to determine monomeric anthocyanins from polymeric pigments. There are two classes of polymeric pigments in grapes and win

3、es , small polymeric pigments (SPP) that do not precipitate with protein and large polymeric pigments (LPP) that do. during ripening and harvest, the polymeric pigment composition of Cabernet Sauvigon and Syrah berries are very little compared to the corresponding wines. the most of the LPP found in

4、 wines is formed during winemaking. By contrast, SPP in wines compared to fruit was variable, decreasing in Syrah, increasing in Cabernet Sauvignon, with little change in Pinot noir. Using protein precipitation and bisulfite bleaching analysis obtained  the parallel determination of tannins and

5、 polymeric pigments in grapes and wines.Key words: Polymeric pigments, anthocyanin , tannin, procyanidin , fruit ripening, protein precipitation.1引言     葡萄籽和皮中的單寧酸是黃烷-3-醇聚合物，它包含兒茶酸、表?xiàng)攦翰杷?、表兒茶酸、或多?shù)連接在黃烷醇C4-C8鍵的表兒茶酸沒(méi)食子酸?？s合單寧是來(lái)自于葡萄果粒的一種豐富的酚類物質(zhì)，也是紅葡萄酒中重要的收斂性成分。而花色素葡糖苷（花青素）是來(lái)自于葡萄中的多酚物質(zhì)經(jīng)?；苫?/p>

6、色素的糖苷。葡萄皮和籽中的單寧酸在葡萄酒釀造和熟化過(guò)程中與葡萄皮中的花青素形成聚合色素。聚合色素和單分子花青素區(qū)別在于不同PH值下的基本特性成分和對(duì)二氧化硫漂白的靈敏度，當(dāng)PH值從1到5時(shí)，花青素水溶液在520nm處吸光率衰減迅速，而相同條件下聚合色素的吸光率是穩(wěn)定的；在520nm處亞硫酸鹽溶液中聚合色素顯示吸光度時(shí)，紅色單分子花青素被亞硫酸鹽離子漂白，這一特性是聚合色素區(qū)別單分子花青素的簡(jiǎn)便方法。    通過(guò)對(duì)不同酒齡酒的分析，新釀制的葡萄酒含有明顯的單分子花青素和少量的聚合色素。十六年酒齡的葡萄酒中幾乎所有的顏色都來(lái)源于聚合色素。同時(shí)也說(shuō)明花青素和單寧酸直接反

7、應(yīng)形成聚合色素的事實(shí)。    1995年普里斯（Price）等人闡述了使用反相高效液相色譜法測(cè)定葡萄酒和葡萄汁中聚合色素。 把薩莫斯（Somers）和埃文斯（Evans）的二氧化硫漂白法和反相高效液相色譜法相互聯(lián)系起來(lái)所得出的這種測(cè)定方法不受對(duì)位-香豆酰-葡萄糖苷花色素的干擾。    在我們的分析中發(fā)現(xiàn)葡萄皮中蛋白質(zhì)單寧酸沉淀再溶解后，在510nm處吸光值很小，這就表明收獲期的葡萄果粒中聚合色素含量低。紅葡萄酒中的單寧酸和蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀再溶解后進(jìn)行單寧酸分析，其溶液在510nm處有富足的吸光度，這表明在紅葡萄酒的蛋白單寧酸沉淀中存在聚

8、合色素。紅葡萄酒中被蛋白質(zhì)沉淀轉(zhuǎn)移的色素少于聚合色素的一半。因此，我們得出葡萄和葡萄酒中有兩種類型的聚合色素：小分子聚合色素（SPP）與蛋白質(zhì)不產(chǎn)生沉淀，大分子聚合色素（LPP）則相反。 2原料和方法：2.1   牛血清蛋白（BSA） 、十二烷基硫酸鈉（SDS）、三乙醇胺（TEA）、六水合三氯化鐵、焦亞硫酸鉀、         （+）-兒茶素（Sigma）2.2  樣品收集和果漿提取    所有漿果樣品在2000-2001年葡萄季節(jié)中收集，生長(zhǎng)八

9、年的赤霞珠葡萄漿果，六年的黑比諾漿果，五年的西拉漿果。      前期收集樣品的處理過(guò)程：三種不同的葡萄果粒，取20粒漿果為一個(gè)樣品單位，進(jìn)行稱重、去皮分離。把漿果切成兩瓣，將果皮、籽、中果皮分離，將20粒漿果樣品的皮放進(jìn)盛有20mL70%丙酮水溶液（v/v）的125mL錐形燒瓶中，錐形瓶口用橡膠蓋密封，以100轉(zhuǎn)/分輕搖萃取。      萃取液經(jīng)過(guò)充分萃取后進(jìn)行分液，在38條件下使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將丙酮蒸發(fā)去除，殘留物用去離子水定容到10mL，在-20下冷凍供分析使用。2.3  聚合色素

10、分析：    采用Hagerman和 Butler（1997）的單寧酸分析方法，按比例減少測(cè)量葡萄酒或葡萄皮提取物，經(jīng)過(guò)稀釋和體積校準(zhǔn)后測(cè)定吸光度。葡萄酒和葡萄皮提取物用含有5g/l酒石酸氫鉀的12%乙醇（v/v）溶液稀釋，用HCI調(diào)節(jié)其溶液PH值為3.3 。測(cè)量總吸光度、單寧酸沉淀和聚合物色素都是在PH值為4.9 （用NaOH調(diào)節(jié)）的含有200mM乙酸和170mM NaCI的緩沖液中進(jìn)行的。因單寧酸沉淀，緩沖液中加入BSA的最終濃度為1mg/mL。    分析葡萄酒或葡萄汁中的聚合色素和單寧酸，每個(gè)樣品需要兩個(gè)1.5mL的離心管。第

11、一個(gè)管中先加入1mL乙酸NaCI的緩沖液，然后加入500uL已稀釋的葡萄皮提取物或葡萄酒并充分混合。取1ml混合液在520nm處測(cè)量吸光度（讀為A）；繼續(xù)加入0.36M焦亞硫酸鉀80L混合均勻，穩(wěn)定10min 重新測(cè)定在520nm處的吸光度（讀為B）。    在第二個(gè)1.5mL的離心管中加入含有BSA（1mg/mL）的1mL乙酸NaCI的緩沖液，然后加入500uL已稀釋的葡萄皮提取物或葡萄酒。將混合均勻后的樣品在室溫條件下緩慢攪拌15min。穩(wěn)定后，樣品以27000r/min的轉(zhuǎn)速離心，使蛋白質(zhì)單寧酸沉淀形成顆粒狀，取1mL上清液放入透明小玻璃管中,再加入0.36

12、M焦亞硫酸鉀80L，搖勻穩(wěn)定10min后，在520nm處測(cè)定吸光度（讀為C）。吸光度取決于MP、SPP、LPP。LPP分別由（A-B）、C 和（B-C）給出。2.4 聚合色素和單寧酸分析    測(cè)量蛋白質(zhì)單寧酸沉淀再溶解在510nm處吸光度，將第二管中取出的顆粒狀蛋白質(zhì)單寧酸用250uL乙酸/NaCI的緩沖液洗滌，轉(zhuǎn)移剩余的單分子花色素，樣品以13500r/min重新離心, 倒掉洗滌液，然后加入875L含有5%SDS(w/v)和5%TEA(v/v)的緩沖液，待其蛋白質(zhì)單寧沉淀后，溶解液放置于室溫下10min ， 在510nm處測(cè)定吸光度。吸光度描繪出蛋白質(zhì)沉淀物中

13、聚合物色素的數(shù)量，這和Harberton法測(cè)定單寧酸吸光度結(jié)果相同。2.5 聚合色素總量測(cè)定     取12個(gè)不同品牌的紅葡萄酒，進(jìn)行相關(guān)性比較研究。酒樣分別使用Somers和Evans方法和蛋白質(zhì)單寧酸沉淀法測(cè)定聚合物色素。這12個(gè)葡萄酒包括九個(gè)赤霞株、兩個(gè)梅鹿輒、一個(gè)黑比諾。3. 結(jié)果與討論    將所測(cè)定的12個(gè)不同品牌的紅葡萄酒的蛋白質(zhì)沉淀單寧酸吸光度分析結(jié)果和Somers和Evans方法測(cè)定聚合色素得出的吸光度值進(jìn)行比較，（圖一為使用Somers和Evans方法所得到的結(jié)果）結(jié)果顯示兩種方法之間吸光度測(cè)定值沒(méi)有相關(guān)

14、性，因此與BSA產(chǎn)生沉淀的聚合色素不是葡萄酒中所有的聚合色素。用焦亞硫酸鉀漂白單分子花色素，在蛋白質(zhì)沉淀上清液中有大量的剩余吸光度，這些便是沒(méi)有和BSA產(chǎn)生沉淀的聚合色素，由于帶有三種以上兒茶酸或表兒茶酸的原花青素能夠締合和交聯(lián)BSA蛋白，小分子聚合物色素（SPP）不與蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。由此可知，與BSA產(chǎn)生聚合物色沉淀的為大分子聚合色素（LPP）。    圖一：通過(guò)蛋白質(zhì)沉淀和二氧化硫漂白，測(cè)定出葡萄酒中一定數(shù)量的SPP和LPP。    圖二：SPP+LPP總數(shù)與用Somers和Evans法測(cè)定的總聚合色素結(jié)果相比較，得出好的相關(guān)性。

15、    葡萄籽單寧酸溶液中加入單分子花色素，與蛋白質(zhì)作用生成沉淀，在520nm處測(cè)定重新溶解的蛋白質(zhì)單寧酸沉淀的吸光度非常低，說(shuō)明LPP的吸光度不單單歸結(jié)于單分子花色素對(duì)蛋白質(zhì)沉淀的締合作用。為更進(jìn)一步的證實(shí)，我們?cè)谄咸丫浦屑尤氩煌瑪?shù)量的單寧酸得到大量的蛋白質(zhì)單寧酸沉淀，然后定量分析葡萄酒中的單寧酸的數(shù)量和LPP的數(shù)量，將兩者數(shù)值加和在一起。見(jiàn)表一，表明LPP吸光度測(cè)定結(jié)果改變非常小。   測(cè)定的葡萄酒中，LPP的吸光度和葡萄酒中的聚合色素?cái)?shù)量之間沒(méi)有找到相關(guān)性（圖一），使用Somers和Evans法測(cè)定聚合色素的結(jié)果和LPP+SPP的總和具有

16、好的相關(guān)性。在一些葡萄酒中，我們發(fā)現(xiàn)兩種不同的聚合色素其比率有相當(dāng)大的變化（見(jiàn)表二）。測(cè)定成熟期和采摘期葡萄漿果中存在的色素含量。在成熟期間，赤霞珠和西拉果皮中LPP和SPP的含量顯示于圖三。這些結(jié)果表明葡萄皮中含有的LPP數(shù)量較SPP非常少。圖五中A、B表為在PH=4.9時(shí)，采摘期的西拉漿果中的LPP、SPP和單分子花色素相互作用的色度百分?jǐn)?shù)，與其相應(yīng)的連續(xù)兩年的葡萄酒中色度的比較。圖四中顯示的果粒中相互作用的單分子花色素在總色度中的百分含量低于葡萄酒的。這是因?yàn)樵赑H值等于4.9時(shí)520nm處分析單分子花色素的吸光值很小。在圖三和圖四中的結(jié)果顯示，多數(shù)LPP是在發(fā)酵過(guò)程中形成的。在西拉成品

17、葡萄酒和漿果中的SPP色度百分含量幾乎相同（圖三）。    采摘期赤霞珠和黑比諾果實(shí)中LPP、SPP和單分子色素的百分含量與葡萄酒比較結(jié)果見(jiàn)圖五。赤霞珠和黑比諾在葡萄酒中的LPP百分?jǐn)?shù)含量高于采摘期果實(shí)。黑比諾在釀造過(guò)程中LPP和SPP有很小程度上增加。    形成紅葡萄酒中穩(wěn)定顏色的聚合色素，多數(shù)是由于聚合色素和少量的單分子花色素的存在。使用HPLC測(cè)定兩年酒齡的紅葡萄酒中的聚合色素?cái)?shù)量占酒中色度的50，四年酒齡為75，10年酒齡為95 。    在蛋白質(zhì)沉淀定量分析單寧酸中，510nm處紅葡萄酒的蛋白

18、質(zhì)單寧酸沉淀有相當(dāng)大的吸光率。當(dāng)醋酸鹽緩沖液的PH=4.9時(shí)，BSA的等電點(diǎn)（Pi） 是4.9 ，該條件下單寧酸的蛋白質(zhì)沉淀量最大，此時(shí)單分子花色素吸光率最小。    測(cè)定收獲期赤霞珠的汁和西拉果皮發(fā)現(xiàn)，LPP含量少于SPP。收獲期果皮中LPP和SPP的百分含量和酒中測(cè)定結(jié)果比較，得出酒中聚合色素LPP含量高于葡萄果實(shí)，LPP優(yōu)先于SPP提取似乎不太可能，我們認(rèn)為L(zhǎng)PP量比SPP多是在酒的釀造過(guò)程中形成（見(jiàn)表 1.）從許多地區(qū)的。（取不同的葡萄收獲期的同一品種的140個(gè)葡萄酒樣品測(cè)定，得出比率值的范圍為0.14-2.2 。    澳洲

19、葡萄品系中沒(méi)有色素成分沉淀和二氧化硫的漂白（SPP），這些酒是低分子量，對(duì)二氧化硫的漂白作用有抵抗力。我們認(rèn)為SPP成分內(nèi)包含兒茶酸-錦葵色素-3-葡萄糖苷加合物，和其他色素一樣，乙醛使花色素和黃烷-3-醇類聚合形成色素的二聚物、三聚物,包含花青素的LPP成分直接和葡萄皮和籽中聚合黃烷3-醇類反應(yīng)，或通過(guò)乙醛共聚增加聚合色素與BSA的沉淀量。    LPP和SPP之間的特性對(duì)于生產(chǎn)精制紅葡萄酒使用蛋白有實(shí)際意義，我們期望精制葡萄酒酒中含有高的LPP/SPP比來(lái)釋放更多的聚合色素。 表二12 個(gè)不同品牌的紅葡萄酒的LPP/SPP 比值葡萄酒LPP/SPP梅

20、鹿輒1.30梅鹿輒1.13赤霞株1.05赤霞株0.90赤霞株0.79赤霞株0.78赤霞株0.78黑比諾0.73赤霞株0.66赤霞株0.51赤霞株0.44赤霞株0.33 參考文獻(xiàn)：1葡萄酒釀造學(xué)原理及應(yīng)用美Roger B. Boulton  Vernon L. Singleton Linda F.Bisson Ralph  E. Kunkee 著 趙光鰲等譯中國(guó)輕工業(yè)出版社2葡萄酒分析化學(xué)秦含章 編著 中國(guó)輕工業(yè)出版社3葡萄酒科學(xué)與工藝法E.卑諾 著 朱寶鏞 趙光鰲 張繼民 劉吉良 譯  中國(guó)輕工業(yè)出版社4Separation of Anthocyanin Pigments in Wine by Low Pressure Column Chromatography  By Tony  V. Johnston and Justin R. Morris. JFoodSci 61(1):109-11 19965Color and Color Stability of Red Wine from Noble (Vitis rot