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文檔簡介

1、口蹄疫病毒基因組的遺傳變異剖析陳豪泰,張 杰,孫德惠,馬麗娜,劉湘濤,劉永生(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部草食動(dòng)物疫病重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730046)摘要:【目的】明確口蹄疫病毒基因組的結(jié)構(gòu)特征及其變異與結(jié)構(gòu)、功能的關(guān)系以及系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系?!痉椒ā坷肈NAstar和Clustalx程序進(jìn)行184個(gè)口蹄疫病毒基因組序列的同源性分析、多重排比?!窘Y(jié)果】口蹄疫病毒基因組ORF大小有所差異,范圍為6 9637 120 nt,編碼2 3202 339 aa的多聚蛋白。核苷酸和氨基酸序列的同源性,7個(gè)不同血清型間77.6%和78.3

2、%,本研究發(fā)現(xiàn)了可能和生物學(xué)功能相關(guān)的新的保守和變異區(qū)域?!窘Y(jié)論】口蹄疫病毒RNA的變異類型豐富和多樣性程度較高,自然界存在的毒株可能大于血清學(xué)和測序發(fā)現(xiàn)的FMDV的毒株數(shù)目。關(guān)鍵詞:口蹄疫;遺傳變異Dissection on Genetic Diversiy of Foot-and-Mouth Disease Virus GenomesCHEN Hao-tai, ZHANG Jie, SUN De-hui, MA Li-na, LIU Xiang-tao, LIU Yong-sheng(Key Laboratory of Animal Virology of Ministry of Agri

3、culture/State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology/Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Grazing Animal Diseases of Ministry of Agriculture, Lanzhou 730046)Abstract: 【Objective】The purpose of this study is to clarify the structu

4、ral features of foot-and-mouth disease virus (FMDV) genomes, relationships of the sequence variations with its structure-function, and molecular phylogeny among FMDV. 【Method】The identity analysis and multiple alignment of 184 FMDV genome sequences were undertaken, respectively, by using the DNAstar

5、 and Clustalx packages. 【Result】 FMDV genome sequences showed the entire ORFs size range from 6 963 to 7 120 nt, which could encode PrPs with 2 320 to 2 339 aa. The homology of these nucleotide and amino acid sequences were greater than or equal to 77.6% and greater than or equal to 78.3% among seve

6、n distinct serotypes, respectively. The data reveal novel highly conserved genomic regions, indicating variability as well as novel viral genomic motifs with likely biological relevance. 【Conclusion】 These results suggest that more FMDV genome diversity may exist in nature than is currently indicate

7、d by serology or sequence analysis.Key words: FMDV; Genetic diversity0 引言【研究意義】口蹄疫是一種由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,F(xiàn)MDV)引起的,主要危害偶蹄獸的急性、熱性和高度接觸性人畜共患傳染病1,其病原屬小RNA病毒科口蹄疫病毒屬。交叉保護(hù)試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)確證口蹄疫病毒有7個(gè)血清型,即O、A、C(歐洲型)和Asia1(亞洲1型)以及STA1、STA2、STA3(南非型)?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】FMDV基因組和其它小RNA病毒相似,包括5'非編碼區(qū)(5' untran

8、slated region,5'UTR)、開放閱讀框(open reading frame,ORF)和3'非編碼區(qū)(3'untranslated region,3'UTR)。5'UTR由S片段(short fragment)、poly(C)區(qū)段(90%C)和L片段(long fragment)的5'末端組成;L片段由3或4個(gè)重復(fù)的假結(jié)節(jié)(pseudoknot,PK)、順式復(fù)制元件(cis-acting replication element,CRE)、內(nèi)部核糖體位點(diǎn)(internal ribosome entry site,IRES)、ORF和3

9、'UTR組成2,5'UTR與啟動(dòng)多聚蛋白的翻譯和病毒的復(fù)制有重要作用3。3'UTR含有與負(fù)鏈RNA合成有關(guān)的順式作用元件4??谔阋卟《玖W佑啥骟w對稱的衣殼和病毒核酸組成,衣殼由60個(gè)不對稱的亞單位組成,每個(gè)亞單位都含有1分子的VP1(1D)、VP2(1B)、VP3(1C)和VP4(1A)。VP1、VP2和VP3參與組成衣殼表面,而VP4則位于病毒顆粒內(nèi)部。VP1、VP2和VP3包括口蹄疫主要的抗原表位,是細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)受體5。非結(jié)構(gòu)蛋白包括Lpro、2A、2B、2C、3A、3B、3Cpro和3Dpol6,Lpro、3Cp

10、ro和2A介導(dǎo)多聚蛋白的裂解,Lpro不僅能夠進(jìn)行自我切割釋放自己,還可以介導(dǎo)細(xì)胞翻譯起始因子eIF4G的裂解7,3Cpro是多聚蛋白成熟過程中最為重要的蛋白酶之一,除參與病毒蛋白的裂解外,還裂解宿主細(xì)胞的蛋白8。2A可在C末端自身裂解9,10。盡管FMDV 2A和2C的功能還不清楚,但其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜囊泡中,該部位是病毒基因組復(fù)制的地方11。3A是多功能膜蛋白,其激發(fā)前體3CD的裂解12。3B又稱VPg,F(xiàn)MDV 的3個(gè)VPg均由病毒3B基因編碼,其與病毒RNA合成有關(guān)13。3D基因編碼RNA依賴的RNA聚合酶,也定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜14,15?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管對小RNA病毒生物學(xué)許多方面已

11、經(jīng)研究清楚,但是關(guān)于FMDV非編碼區(qū)、衣殼蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白及其前體對毒力、宿主范圍、感染方面的功能和作用還不清楚?!緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過比較184株FMDV的基因組序列,分析口蹄疫病毒各個(gè)單元的變異特征及其與系統(tǒng)發(fā)生的關(guān)系,以期對FMDV的基因組結(jié)構(gòu)特征、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及口蹄疫在宿主間傳染關(guān)系有新的認(rèn)識,同時(shí)發(fā)現(xiàn)新的變異區(qū)和保守區(qū)及其重要的基序,為后續(xù)的口蹄疫病毒研究打好基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 口蹄疫基因組序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中,查獲至今已注冊的184個(gè)口蹄疫基因組的RNA序列。(1)A型口蹄疫病毒基因組序列有48個(gè),其GenBank接受號分別為:AY593751-593

12、794、AY593801-593803、AF136371和NC_011450;(2)C型口蹄疫病毒基因組序列有23個(gè),其GenBank接受號分別為:AF274010、DQ409183-409191、NC_002554、AM409325、AY593804-593810、AJ133357-133359和AJ007572;(3)O型口蹄疫病毒基因組序列有76個(gè),其GenBank接受號分別為:NC_004004、EF175732、DQ404158- 404180、DQ478937、DQ478936、DQ119643、DQ248888、AB079061、AJ539136-539141、AJ320488、

13、AJ633821、AY686687、AY312589、AY312587、AY333431、AY359854、AY593811-593837、AF511039、AF506822、AF377945、AF026168、AF189157和AF308157;(4)Asia1型口蹄疫病毒基因組序列有14個(gè),其GenBank接受號分別為:DQ533483、NC_004915、EF149010、EF149009、AY593795- AY593800、AY390432-687334和AY304994;(5)STA2型口蹄疫病毒基因組序列有6個(gè),其GenBank接受號分別為:NC_003992、AF540910、

14、AY593847- 593849和AJ251473;(6)STA1型口蹄疫病毒基因組序列有10個(gè),其GenBank接受號分別為:AY593843 -593846、AY593838-593842和NC_011451;(7)STA3型口蹄疫病毒基因組序列有5個(gè),其GenBank接受號分別為:NC_011452和AY593850-593853。其中以中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所克隆的口蹄疫病毒基因組序列Asia1(EF149009)和YNBS/58(AY390432)為參考對照。1.2 口蹄疫基因組序列比較 口蹄疫基因組的同源性分析 利用DNAsrar軟件比較口蹄疫病毒基因組核苷酸和氨基酸差異性和相

15、似性,并分段進(jìn)行的保守性分析。 口蹄疫病毒基因組序列的多重排比和進(jìn)化關(guān)系分析 利用Clustalx 程序進(jìn)行口蹄疫病毒基因組序列的多重排比16。 1.2.3 口蹄疫病毒基因組非編碼區(qū)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用RNADRAW軟件對S片段、PK、CRE和IRES以及3'UTR進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。2 結(jié)果與分析2.1 口蹄疫病毒基因組結(jié)構(gòu)與各組分的大小FMDV的全長為8 0468 215個(gè)核苷酸(nt),由5'UTR(1 300 nt)、ORF(6 9637 120 nt)、3'UTR(90 nt)和Poly(A)尾組成。ORF由L基因、P1結(jié)構(gòu)蛋白基因、P2和P3非結(jié)構(gòu)蛋白基因以及起

16、始密碼子和終止密碼子組成,共同編碼2 3202 339個(gè)氨基酸(aa)的多聚蛋白,該多聚蛋白隨后被逐級降解為病毒復(fù)制所需要的各個(gè)組分:Lab/Lb(201-219 aa)、P11A(85 aa)、1B(217-219 aa)、1C(219-222 aa)和1D(213-221 aa)、P22A(18 aa)、2B(154-183 aa)和2C(285-318 aa)、P33A(143-153 aa)、3B1(23 aa)、3B2(24 aa)、3B3(24 aa)、3C(213 aa)和3D(469 aa)。此外,S片段和IRES分別為322380 nt和500557 nt (圖1)。2.2

17、口蹄疫病毒基因組的變異性和保守性 非編碼區(qū) 口蹄疫病毒5'UTR和3'UTR同源性分別為%和65%99%,而S片段和IRES的同源性高達(dá)85%以上。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)S片段可折疊形成長莖環(huán)結(jié)構(gòu),Poly(C)后面是長約700 nt的RNA片段,也能夠形成高度保守的結(jié)構(gòu),該二級結(jié)構(gòu)包括假結(jié)節(jié)、CRE和IRSE,此外,3'UTR也可以形成保守的二級結(jié)構(gòu)(圖2)。2.2.2 5'UTR Poly(C)區(qū)段前12 nt和S片段末端圖1 口蹄疫病毒基因組結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of FMDV genomesA:S片段;B:假結(jié)節(jié);C:順式復(fù)制元件;D:核糖體進(jìn)

18、入位點(diǎn);E:3'非編碼區(qū)A: S fragment; B: PK; C: CRE; D: IRES; E: 3'UTR圖2 二級結(jié)構(gòu)Fig. 2 Secondary structures序列高度保守,分別位于S片段92和302的2個(gè)AUG也非常保守,同時(shí)發(fā)現(xiàn)5'末端前27 nt在所有口蹄疫病毒RNA中高度保守,其后為15 nt的高變區(qū),高突變位點(diǎn)有513、558、615、684、696和1 144。SAT發(fā)生13個(gè)核苷酸的插入或缺失,其主要發(fā)生的區(qū)域?yàn)?20160和200300;位點(diǎn)有38、39、67、95、250、350、366和375。而A、O和C型則為15個(gè)堿基的

19、插入或缺失(但是毒株C Waldman strain 149、A Canefa 1/61和A25 Argentina/59缺了區(qū)域153228的76個(gè)核苷酸),主要分布在位點(diǎn)86、123、124、144、145、155157、174、181191、197219、240、256、277、292294、300、306和324。毒株SAT1/7 Isrl 4/62和SAT2-3 Kenya 11/60有一個(gè)相對完整的S片段,沒有SAT和A、O和C型FMDV的特異性缺失,插入或缺失只限于位點(diǎn)142、143、239、290、291和307,這是其它毒株所沒有的。雖然各毒株S片段的突變效率低,但是STA和

20、歐洲株S片段的核苷酸同源性只有50%,而C和A型口蹄疫病毒的S片段的同源性卻高達(dá)98%。在毒株A5 Westerwald/51的poly(C)區(qū)下游28 nt處發(fā)現(xiàn)了18 nt殘基的插入。假結(jié)節(jié)區(qū)403600比較保守。保守區(qū)和基序定位于假結(jié)節(jié)區(qū)和IRES,包括AGAAWYGGGACGU(位于617629)、GCRCACGWAACGCGC(632646)和ACAAAC(668673)。IRES的區(qū)域6401151的同源性為70%100%,47%的核苷酸不變;有許多保守基序,包括區(qū)域2的基序UUUC和GGUCUWGAG以及區(qū)域3的保守基序GYRA(相當(dāng)于小RNA病毒的基序GNRA)和CRAAA(O

21、1Argentina/65和OAkesu/58除外)。多數(shù)FMDV存在區(qū)域3的莖環(huán)D基序ACCC,但是莖環(huán)3C基序ACAC不保守。區(qū)域3也發(fā)現(xiàn)一些新的保守基序,例如基序UCGUMGCGGAGCA(位于823835)和GRUACUGGUA或GRGACUGGUA(965974)分別特異性地存在于STA和歐洲型毒株中,基序CUGGWGRCAGGCUAAGGAUGCCCU(位于9831 006)形成莖環(huán)的突起。區(qū)域4非常保守,其中的2個(gè)新基序GAUCUGAG(1 0391 046)和UUAAAAG(1 0801 087可能形成莖環(huán)突起的二級結(jié)構(gòu)。區(qū)域5的21個(gè)核苷酸的19個(gè)保守??傊?,F(xiàn)MDV 5&#

22、39;UTR比較保守,特別是IRES更加保守。2.2.3 3'UTR 3'非編碼區(qū)的高變區(qū)為85101。Poly(A)上游的20個(gè)核苷酸具有75%的同源性,變異主要位于基因組的3'端中部。2.2.4 多聚蛋白區(qū) 所有口蹄疫病毒ORF比較發(fā)現(xiàn)至少為46%的核苷酸(52%的氨基酸)沒有變化,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)核苷酸變異程度明顯大于氨基酸的變異程度,毒株間的核苷酸同源性為73%??谔阋卟《疽職さ鞍缀徒Y(jié)構(gòu)蛋白之間的切割位點(diǎn)比較保守,L/1A、1A/1B、B/1C、1C/1D、1D/2A、2A/2B、2B/2C和2C/3A的酶切位點(diǎn)分別為K/R|G、A|D、E/Q|G、Q/E|T、Q|L

23、/T/M、G|P、Q|L和Q|I,而3A/3B1、3B1/3B2、3B2/3B3、3B3/3C和3C/3D則都是E|G,歐洲型毒株的蛋白切割位點(diǎn)保守程度高于SAT型,尤其1A/1B、2A/2B、2B/2C、2C/3A、3B/3C 的切割位點(diǎn)非常保守。2.2.5 結(jié)構(gòu)蛋白 核苷酸和氨基酸的分段對比分析可見(表2),結(jié)構(gòu)蛋白的變異順序?yàn)閂P1VP2VP3VP4,1A是最保守的的結(jié)構(gòu)蛋白,約81%的氨基酸不變,包括N-末端十四烷基化位點(diǎn)和豬牛T-細(xì)胞表位2035,與歐洲毒株相比較,Q73在所有的SAT型毒株中都比較保守。另外,I76 保守于SAT2 和SAT3中,而V80 僅存在于SAT1中。表1

24、口蹄疫病毒衣殼蛋白及其基因序列同源性Table 1 Homology of capsid protein and its gene of FMDV 同源性 Homology (%)異源性 Heterology (%)ntaantaa1A779978991231221B659766983352341C619660974393401D539555975473451B的N末端變化小,而C末端易變。T細(xì)胞表位1B4868、1B114132和1B179187比較保守,歐洲型毒株的保守基序是DKKTEETTLLEDRILTT RNGHT(T/I)STTQSSVG,而SAT型毒株的保守基序?yàn)镈KKTEETT

25、(L/H)LEDRI(L/M/V)TT(S/R)H(G/N)TTTSTTQSSVG。1C氨基酸替換集中在1C5588、1C130140、1C176186和1C196208,插入或缺失發(fā)現(xiàn)于前2個(gè)區(qū)域,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)歐洲毒株的1B/1C的切割位點(diǎn)不變,而SAT則不保守。1D的插入或缺失發(fā)生于1D140150和1D166170,26%的殘基不變。大多數(shù)FMDV有保守RGD三肽基序,但是毒株C Waldman strain 149和C4 Tierra del Fuego/66為GGDC;Asia1/2 Isrl 3/63和 A21 Kenya/64為RGE;A25 Argentina/59和A Cane

26、fa 1/61為RDD;Asia1 Pak/1/54和O/Syria/1/87是RGN;O PAK/1/94 和O/IRQ/26/2000是KGD;其它的毒株還包括C5 Argentina/69(TGD)、Asia1/3 Kimrom(HGD)、A27 Colombia/67(PGD)、A A/IND/110/99(RSG)、O KEN/5/95(RGE)、O Akesu/58(SGD)、O3/Venezuela/51(IGD)。其它重要的保守位點(diǎn)和基序包括1B的H145、P144和L83;1C的G39、F41和 A50,其包含在保守基序LDVAEACPT(4553)之中;與1AB切割相關(guān)的位

27、點(diǎn)有1D的P204,其包含在于基序RMKRAE(T/L)YCPR(195205);1B的V32(SAT2為I)、T33和Y36,其包含于TTSTTQSSVG(V/I)T(Y/F)GY(2236)。1B3647在同一血清型內(nèi)比較保守,分別為YSTXEDHXXGPN(A)、YXTXEDFVXGPN(O)、YATXEDXXGPN(C)、YXVXEDAVSGPN(Asia1)、YAXXDXFLPGPN(SAT1)、YADXDSFR XGPN(SAT2)和YXSADRFLPGPN(SAT3),而基序GPNT(S/N)GLEXRVxQAER(F/Y)(F/Y)K(4563)在所有的FMDV中都保守。1B的

28、 H21(相當(dāng)于SAT的位點(diǎn)19)、H145、H157和H174很保守,突變H87P和H168Y分別存在于歐洲型毒株中,另外,1C包括5個(gè)保守的H殘基,分別位于86(相當(dāng)于SAT的84位)、109、146、149和198(相當(dāng)于SAT的196)。2.2.6 非結(jié)構(gòu)蛋白 口蹄疫病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白比較保守(表2),大多數(shù)保守區(qū)位于2B和3C的編碼區(qū),其核苷酸的保守性分別平均達(dá)到61%和59%,氨基酸的保守性為76%。相對而言,Lpro、3A和3B呈現(xiàn)較高的變異,重要的保守位點(diǎn)包括L19、L20、L22、L23、L82 、1D45、1D48、1D142、1D143、1D144、1D146、3A44、3

29、A132、3A135、3A136、3A144,位點(diǎn)4和11(3B1)以及17、18和19(3B2)也比較保守。表2 口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白及其基因序列同源性Table 2 Homology of nonstructural protein and its gene of FMDV同源性 Homology (%)異源性 Heterology (%)ntaantaaL749675994261252A90989499210162B869788984132122C849782973163183A859688974253223B849985991261253C879887982232233D8899899

30、9112111絕大多數(shù)毒株Lpro沒有出現(xiàn)插入或缺失,但是歐洲株的L22和L23除外。起始密碼子高度保守,同時(shí)發(fā)現(xiàn)2個(gè)密碼子間只有1個(gè)氨基酸殘基C6沒有變化;Lb僅44%殘基未變,氨基酸替換主要集中于Lpro末端;Lpro的C52、H149、D165、E77、H110和H139保守,但是H110D(SAT)、E77Q(O6 Pirbright/65)和E77K(A Phillipines/75)除外。2A氨基酸同源性約89%,14個(gè)殘基沒有變化,其中包括基序DVEXNPG;2B的117個(gè)殘基沒有變化,變化僅局限于12個(gè)殘基的替換,尤其跨膜區(qū)120140更加保守;2C也比較保守,72%核苷酸沒有

31、變化,包括2C110116、2C160163和2C243246,而SAT型毒株的特異性替換位點(diǎn)是28和92位;3A插入或缺失經(jīng)常發(fā)生于3A70110和3A130150,氨基酸比較證實(shí)3A是FMDV易變的蛋白之一,只有37%殘基沒有變化;3B1、3B2、3B3都比較保守,變異主要發(fā)生于C末端。相比較而言,3B1和3B2更容易變異;3Dpol比較保守(變異率為26%),尤其基序VKGQDMLSDAALMVLH、跨膜區(qū)7691和2744更加保守,其它的保守位點(diǎn)還有D245、G295、N307 、G337、D338、D339以及保守基序KDELR、PSG、YGGD、FLKR和抗原表位112、6476和

32、143153。3 討論FMDV的全長為8 0468 215 nt,與已報(bào)道資料的結(jié)論一致17,18。雖然各毒株S片段的突變效率低,導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)相似,都是單個(gè)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)19,20,但是A22 Turkey/65、A24 Argentina 65和Asia 1 Leb 83可能不同,有待進(jìn)一步研究。IRES和第一個(gè)AUG之間的22 nt易變,導(dǎo)致FMDV優(yōu)先使用第二個(gè)起始密碼子21,22,但其保守性可能對口蹄疫病毒的轉(zhuǎn)錄與翻譯非常重要。3'UTR的功能比較重要,其主要包括含有與負(fù)鏈RNA合成有關(guān)的順式作用元件4、poly(A)缺失或替換會(huì)降低或消除FMDV的感染性23、3'UTR可

33、能影響病毒基因組的環(huán)化和翻譯24,25,本研究表明3'UTR的變異主要位于基因組的3'端中部,其可能是病毒的復(fù)制和毒力相關(guān)的重要區(qū)域。4種結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸同源性比較表明,在口蹄疫的7個(gè)血清型之間,甚至同一型的亞型之間的抗原也不完全相同,VP1的氨基酸序列是一個(gè)高度可變區(qū),而VP4幾乎不發(fā)生變異。因此,結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸取代、插入或缺失,尤其是口蹄疫病毒抗原表位的氨基酸差異可能造成口蹄疫病毒的抗原變異。Lpro編碼2種蛋白,第一個(gè)AUG的翻譯產(chǎn)物為Lab,而第二個(gè)起始密碼子編碼Lb,二個(gè)密碼子間的間隔區(qū)可能形成穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)而參與IRES的活 化22,26。Lab和Lb的蛋白酶活性

34、和特異性相同,Lpro是FMDV的毒力相關(guān)因子,可能參與宿主的干擾調(diào) 節(jié)27??谔阋卟《厩皩?dǎo)蛋白酶的氨基酸同源性比較表明,絕大多數(shù)毒株Lpro沒有出現(xiàn)插入或缺失,并且起始密碼子高度保守,這可能決定Lab和Lb在FMDV生物學(xué)方面有重要作用,同時(shí)發(fā)現(xiàn)2個(gè)密碼子間只有1個(gè)氨基酸殘基C6沒有變化,和以前的報(bào)道28,29相比較,Lb僅44%殘基未變,氨基酸替換主要集中于Lpro末端,可能與其二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)。除位點(diǎn)H110D(SAT)、E77Q(O6 Pirbright/65)和E77K(A Phillipines/75)以外,所有毒株的位點(diǎn)C52、E77、H149、H110、 H139和D165

35、非常保守,其與Lpro活化27,30,31和eIF4G切割32相關(guān)。FMDV的衣殼由1A、1B、1C和1D 4種結(jié)構(gòu)蛋白組成5,1A是FMDV最保守的的結(jié)構(gòu)蛋白,包括N-末端十四烷基化位點(diǎn)和豬牛T-細(xì)胞表位(位于2035)33,1C包含重要的構(gòu)象表位,穩(wěn)定衣殼蛋白34。氨基酸替換集中在1C176186和1C196208,T細(xì)胞表位存在于該區(qū)域35,這些基序可能與病毒的感染和免疫有重要關(guān)系。1D與病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞、免疫保護(hù)和型特異性有關(guān)5。FMDV的宿主識別位點(diǎn)主要由保守RGD三肽基序組成36,37,資料表明小RNA病毒N末端的10個(gè)氨基酸殘基比較保守,其與病毒進(jìn)入細(xì)胞相關(guān)38,而FMDV 1D

36、缺失N-末端基序,這是FMDV與其它小RNA的重要區(qū)別。小RNA病毒1AB(VP0)的切割機(jī)制還不清楚,但是這需要病毒的成熟和感 染39,40。在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞過程中,1A介導(dǎo)病毒RNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)41,與其有重要關(guān)系的位點(diǎn)包括1B的H145、P144和L83;1C的G39、F41和 A50,其包含在保守基序LDVAEACPT(4553)之中42,這些位點(diǎn)可能與口蹄疫病毒的感染相關(guān)??谔阋叩姆墙Y(jié)構(gòu)蛋白由基因組的P2和P3區(qū)編碼,參與結(jié)構(gòu)蛋白的折疊和裝配以及RNA的復(fù)制。2A成熟可能是調(diào)節(jié)細(xì)胞翻譯機(jī)制而導(dǎo)致2A釋放9,10。保守基序DVEXNPG對2A活性有重要作用43,2A高度保守性,其意義目

37、前還不清楚。2C110-116、2C160-163和2C24324644 也比較保守,可能與ATP/GTP酶活性有關(guān)。3A中氨基酸的缺失與FMDV感染性弱化以及宿主嗜性有關(guān),其特性與其它的小RNA病毒相似45,46,缺失現(xiàn)象出現(xiàn)在O Taiwan/97分離株中,導(dǎo)致牛源細(xì)胞上不能生長復(fù)制,但是對豬和豬源細(xì)胞有很強(qiáng)的毒力47,核苷酸比較顯示3A由143153 aa構(gòu)成,其插入或缺失經(jīng)常發(fā)生于3A70110和3A130150。氨基酸比較證實(shí)3A是FMDV易變的蛋白之一,其中突變位點(diǎn)Q44、Q44R與致病性相關(guān)48,盡管突變Q44R在許多豬適應(yīng)株中存在,但是在其它豬適應(yīng)株和不適應(yīng)株中都發(fā)現(xiàn)有缺失。預(yù)

38、測的跨膜區(qū)(6076)的保守位點(diǎn)L64、L68、A70和I7247在本研究中發(fā)現(xiàn)并不保守,也發(fā)生氨基酸的替換,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞表位213533依然易變,這表明3A上氨基酸的突變可能是病毒適應(yīng)到新的宿主,宿主范圍的選擇可能由3A基因變異決定。3B包括3B1、3B2和3B313,49。氨基酸同源性比較證實(shí)3B1、3B2、3B3都比較保守,變異主要發(fā)生于C末端。保守基序GPYXGP(但是Sat 1/20 Rv 11/37是GPYXRP)中的Y和病毒基因組5'端以磷酸二酯鍵連接50。3B3的高度保守與FMDV潛在的致病性有 關(guān)13,51。相比較而言,3B1和3B2更容易變異,其中3B1的4和1

39、1位殘基以及3B2的1719位氨基酸是關(guān)鍵氨基酸,3B1和3B2 的缺失可能與口蹄疫病毒的致病性和宿主譜有關(guān)51,這與3A相似,3B1和3B2變異介導(dǎo)病毒的宿主特異性功能。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)3B環(huán)中的基序RAAA在口蹄疫病毒中非常保守,這與3B功能之間的關(guān)系還不清楚,有待進(jìn)一步探討。3Cpro催化多聚蛋白的次級裂解,還能裂解宿主的組蛋白H3和轉(zhuǎn)錄起始因子eIF4A與eIF4G。保守位點(diǎn)C163、Y136、H46、D84對3Cpro是比較重要的52,核苷酸比較也發(fā)現(xiàn)存在跨膜區(qū)7691和2744與基序VKGQDMLSDAALMVLH比較保守,這些位點(diǎn)和區(qū)域可能與3C的活性有重要作用,這需要從宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和

40、翻譯的關(guān)閉機(jī)制來揭示。3Dpol是病毒的RNA聚合酶,盡管以前的資料表明3D比較保守(變異率為8.6%)53,但是本研究發(fā)現(xiàn)3D也存在較多的變異(變異率26%)。但在本研究的所有FMDV分離株中都存在保守位點(diǎn)D245、N307、G295、G337、D338、D339及保守基序KDELR、PSG、YGGD、FLKR和抗原表位112、6476、143153,這與相關(guān)研究報(bào)道5357基本一致。4 結(jié)論本研究通過對184株口蹄疫病毒基因組的比較發(fā)現(xiàn),可以將FMDV 7個(gè)血清型分為2群,O、A、C和Asia1型為一群,稱為歐亞群,另外一群則稱為南非群,其包括STA1、STA2和STA3型,2群之間的核苷

41、酸和氨基酸同源性分別為77%89%和79%90%,而群內(nèi)的核苷酸和氨基酸都高達(dá)98%。本研究通過比較184株FMDV的核苷酸及其氨基酸序列表明,口蹄疫病毒基因組存在大量的突變位點(diǎn)和基序,它們與病毒的遺傳和變異息息相關(guān)。References1Xiao C, Rajput Z I, Hu S. Improvement of a commercial foot- and-mouth disease vaccine by supplement of Quil A. Vaccine, 2007, 25(25): 4795-4800.2Mason P W, Grubman M J, Baxt B. Mol

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