分子生物學(xué)大實(shí)驗(yàn)習(xí)題及解答

1、分子生物學(xué)大實(shí)驗(yàn)習(xí)題及解答一、名詞解釋1、genome；2、基因芯片；3、持家基因；4、Operon；5、感受態(tài)細(xì)胞；6、逆轉(zhuǎn)錄酶；7、PCR技術(shù)；8、轉(zhuǎn)化；9、重組DNA技術(shù) ；10、基因沉默；11、hnRNA；12、復(fù)制子；13、反義RNA；14、衰減子；15、擬基因；16、RNA編輯；17、顛換；18、拓?fù)洚悩?gòu)酶；19、變性；20、轉(zhuǎn)座子二、基礎(chǔ)理論單項(xiàng)選擇題1、DNA連接酶的作用為（ ）A、合成RNA引物 B、將雙螺旋解鏈 C、去除引物、填補(bǔ)空隙 D、使雙螺旋DNA鏈缺口的兩個(gè)末端連接 2、DNA復(fù)制中RNA引物的主要作用是( )。 A、引導(dǎo)合成岡奇片段 B、作為合成岡奇片段的模板 C

2、、為DNA合成原料dNTP提供附著點(diǎn) D、激活DNA聚合酶 3、下列哪一種蛋白不是組蛋白的成分（ ） A、 H1 B、H2A 、H2B C、 H3、H4 D、 H5 4、DNA的變性：（ ） A、包括雙螺旋的解旋 B、可以由低溫產(chǎn)生 C、是可逆的 D、是磷酸二酯鍵的斷裂 5、轉(zhuǎn)錄需要的原料是:（ ）A、 dNTP B、 dNDP C、 dNMP D、 NTP 6、在原核生物復(fù)制子中以下哪種酶除去RNA引發(fā)體并加入脫氧核糖核甘酸： A、DNA聚合酶 B、 DNA聚合酶 C、DNA聚合酶 D、外切核酸酶MFl 7、下真核生物復(fù)制起始點(diǎn)的特征包括（ ）A、富含GC區(qū) B、富含AT區(qū) C、 Z DNA

3、 D、無明顯特征8、SDS凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量是根據(jù)各種蛋白質(zhì)（ ） A、在一定pH值條件下所帶的凈電荷的不同 B、分子大小不同 C、分子極性不同 D、溶解度不同9、DNA復(fù)制時(shí)不需要以下哪種酶？（ ）A、 DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶 B、RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶C、拓?fù)洚悩?gòu)酶D、連接酶10、1、證明DNA是遺傳物質(zhì)的兩個(gè)關(guān)鍵性實(shí)驗(yàn)是：肺炎鏈球菌在老鼠體內(nèi)的毒性和T2噬菌體感染大腸桿菌。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中主要的論點(diǎn)證據(jù)是：（ ） A、從被感染的生物體內(nèi)重新分離得到DNA，作為疾病的致病劑 B、DNA突變導(dǎo)致毒性喪失 C、生物體吸收的外源DNA（而并非蛋白質(zhì)）改變了其遺傳潛能 D、DNA是不能

4、在生物體間轉(zhuǎn)移的，因此它一定是一種非常保守的分子11、利用自己的位點(diǎn)專一重組酶把自己從寄主基因組中的一個(gè)地方移到另一個(gè)地方的遺傳元件叫（ ）A、啟動(dòng)子 B、轉(zhuǎn)座子 C、T-DNA D、順反子12、原核DNA合成酶中（ ）的主要功能是合成前導(dǎo)鏈和岡崎片段A、DNA聚合酶 B、DNA聚合酶 C、DNA聚合酶 D、引物酶 13、在基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒以便于重組和篩選。已知有些不同的限制酶也可能會(huì)切出相同的黏性末端限制酶I的識(shí)別序列和切點(diǎn)是一G GATCC一，限制酶的識(shí)別序列和切點(diǎn)是一GATC一。根據(jù)圖示判斷下列操作正確的是（ ）A、質(zhì)粒用限制酶I切割，目的基因用限制酶切割

5、 B質(zhì)粒用限制酶切割，目的基因用限制酶I切割 C目的基因和質(zhì)粒均用限制酶I切割 D目的基因和質(zhì)粒均用限制酶切割14、下列描述最能確切表達(dá)質(zhì)粒DNA作為克隆載體特性的是：A、小型環(huán)狀雙鏈DNA分子B、攜帶有某些抗性基因 C、在細(xì)胞分裂時(shí)恒定地傳給子代細(xì)胞 D、具有自我復(fù)制功能15、基因工程中實(shí)現(xiàn)目的基因與載體DNA拼接的酶是： A、DNA聚合酶 B、RNA聚合酶 C、DNA連結(jié)酶 D、RNA連結(jié)酶 三、填空1、DNA聚合酶I有（ ）和（ ） 活性。 2、在真核生物中存在3種RNA聚合酶，RNA聚合酶I負(fù)責(zé)（ ）的合成、RNA聚合酶II負(fù)責(zé) 的合成（ ）RNA聚合酶III負(fù)責(zé)（ ）的合成。3、細(xì)菌

6、RNA聚合酶的核心酶由（ ）組成的，全酶還包括（ ）。4、DNA復(fù)制時(shí)，RNA引物的合成由（ ）負(fù)責(zé)，而引物的切除則由（ ）負(fù)責(zé)。5、真核細(xì)胞的染色體由（ ）、（ ）和（ ）組成。6、DNA復(fù)制時(shí)需要（ ）將DNA雙鏈解開，靠（ ）維持單鏈結(jié)構(gòu)。7、核小體是由H2A、H2B、H3、H4各兩個(gè)分子生成的（ ）和由大約200bp DNA組成的。八聚體在中間，DNA分子盤繞在外，而（ ）則在核小體的外面。 8、硝酸纖維素膜可結(jié)合（ ）鏈核酸。將RNA變性后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上再進(jìn)行雜交，稱（ ）印跡法。9、PCR又稱（ ）包括三個(gè)步驟（ ）（ ）（ ）。四、問答1、質(zhì)粒提取過程中，應(yīng)注意哪些操作，為

7、什么?2、闡述RT-PCR的基本原理和和過程。3、在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有RT-PCR產(chǎn)物，分析可能的原因及解決辦法。4、小量制備質(zhì)粒DNA時(shí)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA不能被限制酶所切割，分析可能原因及解決辦法。5、試闡述為了提高大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率, 實(shí)驗(yàn)中需考慮的幾個(gè)重要因素。6、在RNA提取過程中應(yīng)該注意事項(xiàng)？7、如何計(jì)算感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率。參考答案一、名詞解釋1、生物體所含有的全部的遺傳信息。2、核酸分子變性過程中，紫外吸收達(dá)到最大增量一半時(shí)的溶解溫度。3、在生物體幾乎所有的發(fā)育過程及所有的細(xì)胞中都能表達(dá)的基因。4、反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。是酶的特征物理學(xué)常數(shù)之一。近似

8、表示酶與底物的親和力。5、用化學(xué)方法處理細(xì)胞，使其改變膜對(duì)DNA的通透性。這種細(xì)胞就稱為感受態(tài)細(xì)胞，即細(xì)胞處于能攝入核酸分子時(shí)的生理狀態(tài)。這種方法已經(jīng)成為基因工程的常規(guī)技術(shù)，它對(duì)于我們利用體外DNA重組技術(shù)來了解真核和原核生物的基因功能特別重要。6、是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：6 i& H$ B- ) S( b# y% v) J1）依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈2) Rnase水解活性：水解RNA雜合體中的RNA；7 K" W6 L" & O0 + B3）依賴DNA的DNA聚合酶活

9、性：以第一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA。用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇隨機(jī)引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。對(duì)于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA，三種都可。7、體外人工模擬自然DNA復(fù)制過程的核酸擴(kuò)增技術(shù)。8、是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。9、將目的DNA片段在體外進(jìn)行改造、重組，然后轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞表達(dá)，從而改變生物性狀的技術(shù)。10、是指與mRNA互補(bǔ)的RNA分子，也包括與其他RNA互補(bǔ)的RNA分子。11、是指最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。包含有內(nèi)含子序列。12、從復(fù)制原點(diǎn)到終點(diǎn)

10、，組成一個(gè)復(fù)制單位，叫復(fù)制子13、14、一種轉(zhuǎn)錄終止順序，在這順序處會(huì)發(fā)生弱化作用，即通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的終止來抑制細(xì)菌中的一些操縱子的表達(dá)。15、是一種畸變基因，即核甘酸序列同有功能的正?；蚝芎艽蟮耐葱?，但由于突變，缺失或插入而不能表達(dá)，所以沒有功能。16、是指轉(zhuǎn)錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的突變、加入或丟失等現(xiàn)象17、是指在突變過程中嘌呤變成嘧啶，或嘧啶突變?yōu)猷堰实默F(xiàn)象。18、拓?fù)洚悩?gòu)酶：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，作用是松解負(fù)超螺旋。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。例：大腸桿菌中的蛋白 拓?fù)洚悩?gòu)酶：該酶能暫時(shí)性地切斷和重新連接雙鏈DNA，作用是將負(fù)超螺旋引入DNA分子。同復(fù)制有關(guān)。例

11、：大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶19、DNA雙鏈的氫鍵斷裂，最后完全變成單鏈的過程稱為變性。20、存在與染色體DNA上可自主復(fù)制和位移的基本單位。二、基礎(chǔ)理論單項(xiàng)選擇題1、D；2、A；3、D；4、A；5、A；6、C；7、B；8、B；9、B；10、A；11、B；12、C；13、A；14、D；15、C三、填空1、5-3聚合酶活性和5-3外切酶活性以及3-5外切酶活性2、rRNA、mRNA、tRNA3、'、；因子4、引物酶、氫鍵5、核小體、DNA、H16、解螺旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶、SSB7、核小體、H18、單、Northern9、寡聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、變性、退火、延伸四、問答1、答 ：從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA

12、的方法都包括3個(gè)基本步驟:培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞;分離和純化質(zhì)粒DNA。采用溶菌酶可以破壞菌體細(xì)胞壁,十二烷基磺酸鈉(SDS)和Triton X-100可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS或Triton X-100處理后,細(xì)菌染色體DNA會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上,同時(shí)由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多,易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線性染色體DNA變性,而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(Covalently closed circular DNA，簡(jiǎn)稱cccDNA)的兩條鏈不會(huì)相互分開，當(dāng)外界條件

13、恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體DNA片段難以復(fù)性,而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起,而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解狀態(tài)存在于液相中。 2、答 ：RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。R

14、T-PCR實(shí)驗(yàn)有三步：抽提RNA，RT，PCR。3、答： 1） RNA被降解：在用來驗(yàn)證完整性之前先在變性膠上分析RNA；使用良好的無污染技術(shù)分離RNA；在將組織從動(dòng)物體取出后立刻處理；在100甲酰胺中儲(chǔ)存RNA如果使用胎盤RNase抑制劑，不要加熱超過45或pH超過8.0，否則抑制劑或釋放所有結(jié)合的RNase。而且，在g/l）以幫助小量樣品RNA的恢復(fù)；逆轉(zhuǎn)錄抑制劑包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸鈉，亞精胺，甲酰胺和胍鹽；將對(duì)照RNA同樣品混合，同對(duì)照RNA反應(yīng)比較產(chǎn)量以檢驗(yàn)抑制劑；6 / M; M  n( m4 I 3) 多糖同RNA共沉淀：使用氯化鋰沉淀RNA以除

15、去多糖；3 - , f* X5 v- K5 M 4） 用于合成cDNA第一鏈合成的引物沒有很好退火：確定退火溫度適合您的引物。對(duì)于隨機(jī)六聚體，建議在反應(yīng)溫度保溫之前先在25保溫10分鐘；對(duì)于基因特異性引物（GSP），可以試一下其他GSP，或換用oligo(dT)或隨機(jī)六聚體確定GSP是反義序列 ( l; d7 _' 2 y6 yg乙酰BSA；9 w9 Y7 1 y" B+ % d5 y- ! w" R 6） RNA模板二級(jí)結(jié)構(gòu)太多：將RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性/退火；提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度，對(duì)SuperScript可以到50，對(duì)ThermoScript可以到

16、65。注意：不要在60時(shí)使用oligo(dT)引物，選擇一個(gè)在反應(yīng)溫度可以退火的GSP；對(duì)于1kb的RT-PCR產(chǎn)物，保持反應(yīng)溫度65。注意：不要在高于37時(shí)使用M-MLV；如果不需要全長(zhǎng)cDNA，在第一鏈反應(yīng)中使用隨機(jī)引物； 8 Z$ q2 a/ d; z! Z; L. t8 m7） 引物或模板對(duì)殘余的RNA模板敏感：在PCR前用RNaseH處理。& L+ h# Y- x6 h/ y$ xM之間。為了精確確定引物濃度，在260nm測(cè)量光密度，然后使用光吸收值和消光系數(shù)計(jì)算濃度。9% F9 A9 ( E% K: M% U0 y0 P999999999）富含GC的模板：于GC含量50的模

17、板，使用PCRx Enhancer Solution。10） 鎂離子濃度太低：從1mM到3mM，間隔進(jìn)行一系列反應(yīng)，確定對(duì)于每個(gè)模板和引物對(duì)的最佳鎂離子濃度。注意：對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR，使用3mM到5mM的鎂離子濃度。 ( R) M9 q0 . W- u) F4 S3 E& - F11） 退火溫度太高：使用表4的公式估算Tm，把退火溫度設(shè)定為低于Tm 5。因?yàn)檫@些公式只是估算Tm值，所有真正的退火溫度實(shí)際會(huì)高些或低些。4、答：由于從細(xì)菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時(shí)注意不夠，沒有去除干凈導(dǎo)致。大多數(shù)情況下，用酚：氯仿對(duì)溶液進(jìn)行抽提可以去除小量備物中的雜質(zhì)，如果總是依然存在，可用離心柱純

18、化DNA。5、答：1） 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于的培養(yǎng)菌，最好從70或-20甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通過監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600 來控制。DH5菌株的OD600 為0.5時(shí),細(xì)胞密度在5×107 個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時(shí)比較合適。密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。2） 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí),轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。1ng的cccDNA即可使50

19、l 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5。 3）試劑的質(zhì)量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。4） 防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染, 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。 6、答：1）在核酸提取時(shí)，為了增加細(xì)胞的裂解度，增加核蛋白復(fù)合體破碎度，以釋放更多的游離核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在確保沒有核酸水解酶存在的前提下，酶反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)越好。9 _7 s) P9 D  v# o! s, b7 $ A2）有時(shí)在使用蛋白酶時(shí)，