內(nèi)標法與外標法(定義及應(yīng)用).

1、內(nèi)標法與外標法一、內(nèi)標法什么叫內(nèi)標法 ? 怎樣選擇內(nèi)標物 ?內(nèi)標法是一種間接或相對的校準方法。在分析測定樣品中某組分含量時, 加入一種內(nèi)標物質(zhì)以校誰和消除出于操作條件的波動而對分析結(jié)果產(chǎn)生的影響, 以提高分析結(jié)果的準確度。內(nèi)標法在氣相色譜定量分析中是一種重要的技術(shù)。使用內(nèi)標法時,在樣品 中加入一定量的標準物質(zhì), 它可被色譜拄所分離, 又不受試樣中其它組分峰的干 擾, 只要測定內(nèi)標物和待測組分的峰面積與相對響應(yīng)值, 即可求出待測組分在樣 品中的百分含量。 采用內(nèi)標法定量時, 內(nèi)標物的選擇是一項十分重要的工作。 理 想地說, 內(nèi)標物應(yīng)當是一個能得到純樣的己知化合物, 這樣它能以準確、 已知的 量加

2、到樣品中去, 它應(yīng)當和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化 學性質(zhì) (如化學結(jié)構(gòu)、 極性、 揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等 、 色譜行為和響應(yīng)特 征, 最好是被分析物質(zhì)的一個同系物。 當然, 在色譜分析條什下, 內(nèi)標物必須能 與樣品中各組分充分分離。 需要指出的是, 在少數(shù)情況下, 分析人員可能比較關(guān) 心化臺物在一個復雜過程中所得到的回收率, 此時, 他可以使用一種在這種過程 中很容易被完全回收的化臺物作內(nèi)標, 來測定感興趣化合物的百分回收率, 而不 必遵循以上所說的選擇原則。在使用內(nèi)標法定量時,有哪些因素會影響內(nèi)標和被測組分的峰高或峰面積 的比值 ?影響內(nèi)標和被測組分峰高或峰面積比值的

3、因素主要有化學方面的、色譜方 面的和儀器方面的三類。由化學方面的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復樣品時出現(xiàn)。 化學方面的因素包括:1、內(nèi)標物在樣品里混合不好;2、內(nèi)標物和樣品組分之間發(fā)生反應(yīng),3、內(nèi)標物純度可變等。對于一個比較成熟的方法來說,色譜方面的問題發(fā)生的可能性更大一些, 色譜上常見的一些問題 (如滲漏 對絕對面積的影響比較大, 對面積比的影響則要 小一些, 但如果絕對面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度, 那么 一定有某個重要的色譜問題存在, 比如進樣量改變太大, 樣品組分濃度和內(nèi)標濃 度之間有很大的差別, 檢測器非線性等。 進樣量應(yīng)足夠小并保持不變, 這樣才不 致于造成

4、檢測器和積分裝置飽和。 如果認為方法比較可靠, 而色譜固看來也是正 常的話, 應(yīng)著重檢查積分裝置和設(shè)置、 斜率和峰寬定位。 對積分裝置發(fā)生懷疑的 最有力的證據(jù)是:面積比可變,而峰高比保持相對恒定,在制作內(nèi)標標準曲線時應(yīng)注意什么 ?在用內(nèi)標法做色話定量分析時,先配制一定重量比的被測組分和內(nèi)標樣品 的混合物做色譜分析, 測量峰面積, 做重量比和面積比的關(guān)系曲線, 此曲線即為 標準曲線。 在實際樣品分析時所采用的色譜條件應(yīng)盡可能與制作標準曲線時所用 的條件一致, 因此, 在制作標準曲線時, 不僅要注明色譜條件 (如固定相、 柱溫、 載氣流速等 ,還應(yīng)注明進樣體積和內(nèi)標物濃度。在制作內(nèi)標標準曲線時,各

5、點 并不完全落在直線上,此時應(yīng)求出面積比和重量比的比值與其平均位的標準偏 差,在使用過程中應(yīng)定期進行單點校正,若所得值與平均值的偏差小于 2,曲線 仍可使用,若大于 2,則應(yīng)重作曲線,如果曲線在鉸短時期內(nèi)即產(chǎn)生變動,則不 宜使用內(nèi)標法定量。二、外標法用待測組分的純品作對照物質(zhì), 以對照物質(zhì)和樣品中待測組分的響應(yīng)信號相 比較進行定量的方法稱為外標法。 此法可分為工作曲線法及外標一點法等。 工作 曲線法是用對照物質(zhì)配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線, 求出斜率、 截 距。 在完全相同的條件下, 準確進樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液, 根據(jù)待 測組分的信號, 從標準曲線上查出其濃度, 或用回歸

6、方程計算, 工作曲線法也可 以用外標二點法代替。 通常截距應(yīng)為零, 若不等于零說明存在系統(tǒng)誤差。 工作曲 線的截距為零時,可用外標一點法 (直接比較法 定量。外標一點法是用一種濃度的對照品溶液對比測定樣品溶液中 i 組分的含量。 將對照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進樣, 測得峰面積的平均值, 用下式 計算樣品中 i 組分的量:W =A(W/(A式中 W 與 A 分別代表在樣品溶液進樣體積中所含 i 組分的重量及相應(yīng)的峰 面積。 (W及(A分別代表在對照品溶液進樣體積中含純品 i 組分的重量及相應(yīng)峰面積。外標 法方法簡便, 不需用校正因子, 不論樣品中其他組分是否出峰, 均可對待測組分 定量

7、。 但此法的準確性受進樣重復性和實驗條件穩(wěn)定性的影響。 此外, 為了降低 外標一點法的實驗誤差, 應(yīng)盡量使配制的對照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度 相近。外標法 external standard method 色譜分析中的一種定量方法,它不是把標準物質(zhì)加入 到被測樣品中, 而是在與被測樣品相同的色譜條件下單獨測定, 把得到的色譜峰面積與被測 組分的色譜峰面積進行比較求得被測組分的含量。 外標物與被測組分同為一種物質(zhì)但要求它 有一定的純度,分析時外標物的濃度應(yīng)與被測物濃度相接近,以利于定量分析的準確性。三、 定量分析中怎樣選擇內(nèi)標法或外標法 (來源:藥物分析網(wǎng)選一與欲測組分相近但能完全分離的組

8、分做內(nèi)標物 (當然是樣品中沒有的組分 , 然后配制欲測組分和內(nèi)標物的混合標準溶液, 進樣得相對校正因子。 再將內(nèi)標物 加入欲測組分的樣品中, 進樣后測得欲測組分和內(nèi)標物的定量參數(shù)。 用內(nèi)標法公 式計算即可。內(nèi)標法是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標物, 加入到準確稱量的試樣中, 根據(jù)被測試樣 和內(nèi)標物的質(zhì)量比及其相應(yīng)的色譜峰面積之比,來計算被測組分的含量。 選擇 內(nèi)標物有 4個要求:1. 內(nèi)標物應(yīng)是該試樣中不存在的純物質(zhì); 2. 它必須完全溶于 試樣中, 并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離; 3. 加入內(nèi)標物的量應(yīng)接近于被 測組分; 4. 色譜峰的位置應(yīng)與被測組分的色譜峰的位置相近, 或在幾個被測組分 色

9、譜峰中間。 內(nèi)標法的優(yōu)點是測定的結(jié)果較為準確,由于通過測量內(nèi)標物及被 測組分的峰面積的相對值來進行計算的, 因而在一定程度上消除了操作條件等的 變化所引起的誤差。 內(nèi)標法的缺點是操作程序較為麻煩, 每次分析時內(nèi)標物和試 樣都要準確稱量,有時尋找合適的內(nèi)標物也有困難。 外標法簡便,但進樣量要 求十分準確, 要嚴格控制在與標準物相同的操作條件下進行, 否則造成分析誤差, 得不到準確的測量結(jié)果。內(nèi)標與外標都是定量的一種方法而已,至于哪一種方法好與不好不能一概而論, 做不同的分析, 面對著不同的要求, 再加上分析成本分析效率等等問題, 我想簡 單而有效進行定量分析來滿足要求才是最重要的。1、以前做過很

10、多醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析,沒有 自動進樣器, 用外標法定量, 確實重現(xiàn)性與穩(wěn)定性非常差, 結(jié)果經(jīng)常受到搞合成 同事的質(zhì)疑。 其實, 仔細分析原因不一定就是外標法不適合這種定量分析, 首先 我們的實驗室儀器和手段是否調(diào)整到一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)了, 比如, 襯管是否 潔凈, 玻璃棉的位置是否合適恰當 (能否使樣品盡可能的汽化 、 汽化溫度是否 合適、 色譜峰形是否對稱 (也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配 、 附近有沒有 其它色譜峰的干擾、 選用什么進樣方式 (如快速進樣還是熱針進樣 等等因素的 影響都需要考慮, 如果這些因素都考慮了, 按照 GMP 方法驗證對于精密度的要

11、求, 同一樣品進 6針以上的 RSD 和配制 6個樣品的定量結(jié)果 RSD 都能滿足小于 1.5%的要求, 那么這個方法用外標法就是完全適用的, 但是前面的影響因素是一定要 都考慮到的, 否則談?wù)撨@個方法是否適用就有失偏頗了。 在做過的許多出口產(chǎn)品 的定量分析方法當中有許多是一些醫(yī)藥公司提供的比較完善而驗證過的方法, 內(nèi) 標與外標都有(他們用的都是自動進樣精密度都能滿足 RSD 小于 1.5%的要求, 當一個方法能夠滿足測試要求的時候, 無論內(nèi)標外標, 都是可行的, 當然有一個 分析成本和分析時間的問題, 內(nèi)標的成本和控制溶液、 樣品溶液的配制當然要比 外標要高和麻煩一些了。 而有些時候, 可能

12、受你實驗室現(xiàn)有儀器和附屬設(shè)備的影 響, 達不到一定的要求, 而還必須進行定量分析, 有時外標的結(jié)果可能就要差一 些, 這時, 你可能就要考慮用內(nèi)標法了, 可以排除手動進樣的誤差、 分流歧視的 影響、 包括一些未知因素平行誤差的影響, 這時內(nèi)標可能就顯示出它的優(yōu)勢來了。2、上面已經(jīng)提到當做方法驗證的時候,當同一樣品配制 6個樣品溶液用所選用 的外標法進行定量的時候, RSD 都滿足 1.5%的要求時,也分為兩種情況,小于 1%和大于 1%小于 1.5%。如果 RSD 的結(jié)果小于 1%,那這個方法就沒有什么可以懷 疑的了;如果 RSD 的結(jié)果大于 1%而在 1.5%略低一些的范圍活動時,這個方法的

13、可行性就將受到質(zhì)疑, 畢竟這是方法驗證, 你就要考慮上面 1所提到的影響因素 的影響了, 如果排除掉以上的影響因素, RSD 還是在 1.5%附近, 就要嘗試內(nèi)標了, 如果內(nèi)標結(jié)果的 RSD 很好, 就證明你的這個方法受實驗條件的影響很大, 只能用 內(nèi)標了,或者干脆將原方法做大的變動,再嘗試用外標法測試。3、而對于微量分析,比如農(nóng)藥和獸藥殘留的分析、環(huán)境分析等,根據(jù)不同的限 量標準要求對于精密度的要求也比常量分析的要求要寬松的多, RSD 有時可以允 許達到 10%甚至更高,這時可能外標法有更大的應(yīng)用空間。4、單從精密度方面去考慮,排除其它成本和效率的因素,個人認為還是內(nèi)標優(yōu) 于外標。曾經(jīng)做過一個中間體二氨基丙醇的常量定量分析,以二乙醇胺為內(nèi)標, RTX-5 amine(堿改性 15m*0.32mm*1.0um色譜柱分析,將配制好的控制溶液 (含有內(nèi)標物 自動進樣器進 6針, 目的物 (二氨基丙醇 與內(nèi)標物 (二乙醇胺 峰面積比率的 RSD 為 0.18%,而只對這六針樣品的目的物峰(二氨基丙醇面積 求 RSD ,結(jié)果為 0.71%,通過這一實例的結(jié)果大家就會發(fā)現(xiàn)到底哪個方法精密度 更好了, 當然是內(nèi)標更好了。 當然這個