刺五加葉中金絲桃苷含量的測定

1、植物學(xué)通報 2005, 22 (2: 203 206教育部重點(diǎn)實驗室開放基金和教育部重點(diǎn)項目 (104191資助。通訊作者。 Author for correspondence. E-mail:zygorl收稿日期:2003-12-31 接受日期:2004-06-25 責(zé)任編輯:白羽紅 刺五加葉中金絲桃苷含量的測定 曹建國趙則海楊逢建李慶勇祖元剛 (東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實驗室 哈爾濱 150040摘要 用高效液相色譜法測定了刺五加 (Acanthopanax senticosus (Rupr.& Maxin Harms葉中金絲桃 苷 (hyperin的含量。色譜柱為 C

2、 18柱,流動相為甲醇和 0.025 mol. L -1磷酸,比例為 V 甲醇 :V0.025 mol. L -1磷酸 =55:45 (混合后用三乙胺調(diào) pH3.03.2, 檢測波長 360 nm。樣品用甲醇超聲提取。結(jié)果表明 , 金絲桃 苷峰形良好,與其他組分的色譜峰達(dá)到基線分離。加樣回收率為 104%, 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD 為 5.38%。 本研究為刺五加葉中金絲桃苷含量的測定建立了一種可靠的方法。 關(guān)鍵詞 刺五加 , 金絲桃苷 , 高效液相色譜法Determination of Hyperin in the Leaves ofAcanthopanax senticosusCAO Jia

3、n-Guo ZHAO Ze-Hai YANG Feng-Jian LI Qing-Yong ZU Yuan-Gang(Key Laboratory of Forest Plant Ecology of Ministry of Education, Northeast ForestryUniversity , Harbin 150040Abstract This paper describes the use of high performance liquid chromatography (HPLC todetermine the hyperin in the leaves of Acant

4、hopanax senticosus on a C18 chromatogram column.Methanol:0.025 mol. L -1 phosphoric acid solution (V/V, 55:45 was used as the mobile phase (themixture was adjusted with triethylamine to pH 3.0-3.2, and the detection wavelength was 360 nm.The sample was extracted with methanol by the ultrasonic extra

5、ction method. Hyperin content showeda symmetrical peak shape and reached the baseline separation with the peak content of other chemicals.The average recovery was 104% and the relative standard deviation (RSD 5.38%. This study pro-vided evidence of an accurate and credible method of determining the

6、content of hyperin in theleaves of A . senticosus.Key words Acanthopanax senticosus, Hyperin, High performance liquid chromatography刺五加 (Acanthopanax senticosus (Rupr.& MaxinHarms的全株均含有多種藥用成 分。它的根和根莖以及地上部分的莖和枝中 含多種刺五加甙, 其中丁香甙含量最高 (許正斌和王明禹 , 1984。果實中含刺五加多糖, 具 有 明 顯 的 增 強(qiáng) 免 疫 的 作 用 (徐 任 生 等 , 1983

7、 。而刺五加葉中黃酮類物質(zhì)含量較高 (許正斌和王明禹 , 1984;許正斌等 , 1984。20422(2黃酮類化合物種類多,通常具有較高的藥用 價值 (黃河勝等 , 2000。 史九良等 (1981從刺 五加的葉中分離到一種黃酮苷,經(jīng)鑒定為金 絲桃苷 (hyperin,藥理試驗表明其具有提高 動物耐低壓缺氧的能力和鎮(zhèn)靜效果,并對垂 體后葉素引起的急性心肌缺血有保護(hù)作用。 另外,金絲桃苷還對缺血性腦損傷有很好的 保護(hù)作用 (陳志武等 , 1998。 這說明刺五加的 葉具有很大的開發(fā)價值。目前,在刺五加葉 的利用方面,山區(qū)的人們把刺五加嫩莖葉當(dāng) 山野菜,已經(jīng)開發(fā)出了五加參茶,具有調(diào)節(jié) 心腦血管的

8、作用。由此可見,刺五加葉既可 食用又具有一定的藥用價值。但到目前為 止,還沒有對刺五加葉中金絲桃苷含量測定 的報道。本文首次采用高效液相色譜法測定 刺五加葉中金絲桃苷含量,結(jié)果表明本方法 操作簡便、準(zhǔn)確且重現(xiàn)性好。1實驗部分1.1 儀器和試藥主要儀器有 LC-6A 高效液相色譜儀 (日本 島津 、 C-R3A 色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)和 SIL-6A 自 動 進(jìn) 樣 器 。金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品購于美國 sigma 公司。 甲醇為色譜純,磷酸和三乙胺為分析純。刺 五加 (經(jīng)東北林業(yè)大學(xué)聶紹荃教授鑒定 葉于 2003年 7月采自東北林業(yè)大學(xué)帽兒山試驗林 場,生長于天然次生林林下。1.2 色譜條件色譜柱為 C 18

9、柱 (6.0 mmi.d.×150 mm, 5µm , 流動相為 V 甲醇 :V0.025mol/L磷酸 =55:45 (混 合后用三乙胺調(diào) pH3.03.2,檢測波長 360 nm ,流速 1.0 mL. min -1,柱溫 25 。 1.3 對照品溶液的配制精確稱取金絲桃苷對照品 1 mg置于 1.5 mL 微量離心管中, 用移液器精確吸取甲醇 1 mL 加入微量離心管中,搖勻,作為對照品 溶液,濃度為 1 mg. mL -1。 1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立精密吸取金絲桃苷對照品溶液 5、 10、 20、 30、 40、 50和 60 µL ,分別置于 1.5 mL的

10、微量離心管中,精確定容至 1 mL。在選 定的條件下,將以上各對照品溶液分別用 HPLC 重復(fù)測定 3次,對峰面積積分,并取 峰面積平均值,以峰面積為縱坐標(biāo),以金絲 桃苷濃度為橫坐標(biāo),進(jìn)行線形關(guān)系分析,得 到 峰 面 積 -金絲桃苷濃度回歸方程 Y = 39764x +2304.9, R 2=0.9966。根據(jù)該方程可以得到金絲桃苷含量的計 算公式如下:樣品中金絲桃苷的百分含量 =×V /MY 代表峰面積, V 代表提取液體積 (mL, M 代表樣品重量 (µg1.5 樣品的制備和測定將刺五加葉干燥并粉碎,過 100目篩。 精確稱定刺五加葉粉末 0.5 g左右,置于 25

11、mL 量瓶中,加甲醇約 20 mL,在超聲波發(fā) 生器內(nèi)提取 60分鐘,靜置冷卻,加甲醇至 刻度,搖勻。進(jìn)樣前經(jīng) 15 000轉(zhuǎn) /分鐘高速 離 心 處 理 。吸取樣品溶液 20 µL 左右注入液相色譜儀 中,實際進(jìn)樣為 10 µL ,測定其中金絲桃苷 色譜峰峰面積,根據(jù)線性關(guān)系方程計算出樣 品中金絲桃苷的濃度或含量。2 實驗結(jié)果2.1 樣品色譜圖分析通 過 多 次 試 驗 發(fā) 現(xiàn) , 以 C 18柱 (6. 0 mmi.d. ×150 mm, 5 µm 為色譜柱,流 動相為 V 甲醇 :V0.025 mol. L -1磷酸 =55:45,檢 測波長 36

12、0 nm,流速 1.0 mL. min -1,柱 溫 25 的條件下,可使樣品中金絲桃苷 與其他組分的色譜峰達(dá)到基線分離 (圖 1, 圖 2 。397642052005曹建國等 : 刺五加葉中金絲桃苷含量的測定 準(zhǔn)偏差 (RSD ,結(jié)果見表 1。 2.3 重復(fù)性試驗精確稱定刺五加葉粉末 0.5 g左右,按 1.5節(jié)的方法制備樣品并測定其中金絲桃苷色 譜峰峰面積,重復(fù) 5次,計算出金絲桃苷在 刺五加葉中的百分含量和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié) 果見表 2。2.4 加樣回收率試驗精確稱取上述已知金絲桃苷含量的樣品 0.5 g左右,計算金絲桃苷的含量。加入對照品溶液 100 µL ,含金絲桃苷 100

13、 µg 。按 1.5節(jié)的方法制備樣品并測定樣品中金絲桃苷 的峰面積,計算出加樣后金絲桃苷的含量, 用實測值減去原樣品中金絲桃苷的含量再除以 加入的純品量,計算出回收率,結(jié)果見表 3。3 討論金絲桃苷是刺五加葉中的一種重要成分 (史久良等 , 1981。目前,還沒有對刺五加 葉中金絲桃苷含量測定的報道,本文首次采 用高效液相色譜法測定其中金絲桃苷含量。圖 1 金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig. 1 Chromatograms of hyperin of standard (7.017min (Time: 15.000 minutes; Amp: 0.000373 volts圖 2 刺五加葉樣

14、品 HPLC 色譜圖Fig.2 Chromatograms of leaf sample of Acanthopanax senticosus (7.067 min (Time: 15.000 minutes; Amp:0.000373 volts表 1 精密度試驗Table 1 Precision tests of determinationsNumberAreaAverageRelative standard deviation (%4219784 5237085表 2 刺五加葉中金絲桃苷含量的重復(fù)性試驗Table 2 Reproducibility test on the content

15、 of hyperin in the leaves of Acanthopanax senticosusNo.Weight(gArea Content (%Average (%Relative standard deviation (%40.49162070310.02510 52009322.2 精密度試驗按 1.5節(jié)的方法制備出樣品,連續(xù)進(jìn)樣 5次,測金絲桃苷的峰面積,計算出相對標(biāo)20622(2陳志武,馬傳庚,趙維忠 (1998 金絲桃甙對腦缺 血再灌損傷保護(hù)作用的實驗研究 . 藥學(xué)學(xué)報, 33:14-17黃河勝,馬傳庚,陳志武 (2000 黃酮類化合物藥 理作用研究進(jìn)展 . 中國中藥雜志

16、, 25: 589-592史久良 , 吳秉純 , 郭秀芳 , 董天慧 , 高鳳蘭 (1981 刺五 加葉金絲桃甙的分離、鑒定和藥理作用 . 見 : 黑龍 江省祖國醫(yī)藥研究所編著 , 中國刺五加研究 . 黑龍江 科學(xué)技術(shù)出版社,哈爾濱, 70-79宋必衛(wèi),陳志武,馬傳庚 (1995 金絲桃甙對中樞 神經(jīng)系統(tǒng)的一般藥理作用 . 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,研究表明,刺五加的其他部位不含金絲桃 苷或含量甚微,但在葉中金絲桃苷的含量 很高。金絲桃苷在臨床上對很多疾病有很 好療效,金絲桃苷有提高動物耐低壓缺氧 的能力和鎮(zhèn)靜效果 (宋必衛(wèi)等, 1995 ,對 急性心肌缺血有保護(hù)作用,具有鎮(zhèn)痛、保 護(hù)腦缺血損傷等作用

17、,并對鈣離子內(nèi)流有 影響 (陶遵威, 2002。因此,用金絲桃苷 作為衡量刺五加葉品質(zhì)的指標(biāo)是切實可行表 3 金絲桃苷的加樣回收率Table 3 Recoveries of added standard hyperinSample Content of hyperin inAdded Content ofRecovery Average Relative standard(g the sample(µg hyperin(µgdetermination (µg (% recovery (%deviation (%的,這對開發(fā)和利用刺五加葉提供了科學(xué) 的 依 據(jù) 。本試驗采用甲醇作提取劑, 固液比為 50:1,在 40 下超聲提取 45分鐘,一次性提 取基本完全,二次提取很難測到有金絲桃苷 的存在。而且金絲桃苷的峰形良好,與其他 成分的色譜峰完全達(dá)到了基線分離?？梢? 用高效液相色譜法測定刺五加葉