蛋白質相互作用

1、蛋白質相互作用的概述一、為什么要研究蛋白質相互作用二、蛋白質相互作用親和力： Kd=AB/AB三、蛋白質相互作用的應用A、 利用抗原和抗體的相互作用：Western blot，免疫共沉淀，染色質沉淀 ，抗體篩庫B、利用已知的相互作用建立 tag: GST pull down， Biotin - Avidin結合，C、 直接利用蛋白質的相互作用：蛋白質親和層析，酵母雙雜交，phage display，Bait蛋白質篩表達庫，蛋白質組四、相互作用的生物學意義：蛋白質間的相互作用是細胞生命活動的基礎。五、生物學功能的研究：獲得功能或失去功能I、一些常用蛋白質相互作用技術? Traditional c

2、o-purification （chromatography co-purification and co-sedimentation）? Affinity chromatography ： GST pull down ， Epitope-tag? （co-）Immunoprecipitation? Western 和 Far-Western blotSurface Plasmon ResonanceTwo-Hybrid SystemFluorescence Resonance Energy Transfer （FRET）（實驗過程及原理，注意事項，優(yōu)缺點）III 、研究實例討論一、酵母雙雜交

3、系統(tǒng) 作用：發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質；鑒定和分析已有的蛋白質間的相互作用；確定蛋白質相互作用的功能基團具體過程：見書本優(yōu)點：是酵母細胞的in vivo相互作用；只需要 cDNA，簡單；弱的相互作用也能檢測到 缺點：都是融合蛋白，萬一融合出新的相互作用；酵母的翻譯后修飾不盡相同，尤其是蛋白質的調控性修飾；自身激活報告基因；基因庫 德要求比較高，單向 1/3 是 in frame 蛋白質毒性；第三者 Z 插足介導的相互作用；假陽性酵母雙雜交系統(tǒng)是當前廣泛用于蛋白質相互作用組學研究的一種重要方法。其原理是當靶蛋白和誘餌蛋白特異結合后，誘餌蛋白結合于 報道基因的啟 動子，啟動報道基因在酵母細胞內(nèi)的表達，

4、如果檢測到報道基因的表達產(chǎn)物，則說明兩者之間有相互作用，反之則兩者之 間沒有相互作用。將這種技術微量化、陣列 化后則可用于大規(guī)模蛋白質之間相互作用的研究。在實際工作中，人們根據(jù)需要發(fā)展了單雜 交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)和反向雜交系統(tǒng)等。（1）原理：將編碼某一蛋白 X 的 DNA 序列與 DNA 結合域 BD 的編碼序列融合形成一個雜交體，將編碼另一蛋白 Y 的 DNA 序列與 DNA 激活域 AD 的編碼序列融合形成另一個雜交體，當兩個雜交體共轉化酵母細胞（此酵母細胞上游有DNA結合位點的報告基因），若X和Y沒有相互作用，則單獨不能激活報告基因的轉錄；若 X和Y可相互作用，則使BD和AD靠近形成一個有

5、效的轉錄激活子，激活報告基因的轉錄。 因此可通過檢測報告基因的轉錄來研究蛋白質X和Y的相互作用。（2）應用范圍1）已知蛋白之間相互作用的檢測：2）蛋白質的功能域研究：通過對其中某一個蛋白質作缺失或定點突變，再用此系統(tǒng)檢測是否還存在相互作用，可闡明其功能域或關鍵氨 基酸；3）克隆新基因和新蛋白： 將感興趣的蛋白質基因與 BD 基因構建成 “誘餌”表達質粒， 將某一器官或組織的 cDNA 文庫與 AD 基因構建成 “獵物”基因庫，共轉化酵母細胞，可篩到與感興趣蛋白質相互作用的蛋白質的cDNA 序列，并推測其蛋白質序列。1）二、噬茵體展示技術在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的 DNA 序列

6、，當噬菌體生長時，表面就表達出相應的單抗，再將噬菌體過柱，柱上若 含目的蛋白， 就會與相應抗體特異性結合，這被稱為噬菌體展示技術。此技術也主要用于研究蛋白質之間的相互作用，不僅有高通量及 簡便的特點，還具有直接得到基因、高選擇 性的篩選復雜混合物、在篩選過程中通過適當改變條件可以直接評價相互結合的特異性等優(yōu) 點。目前，用優(yōu)化的噬菌體展示技術，已經(jīng)展示了人和鼠的兩種特殊細胞系的 cDNA 文庫，并分離出了人上皮生長因子信號傳導途徑中的信號分子。三、等離子共振技術表面等離子共振技術 （Surface Plasmon Resonance，SPR） 已成為蛋白質相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一

7、種納米級的薄膜吸附上誘餌蛋白”，當待測蛋白與誘餌蛋白結合后，薄膜的共振性質會發(fā)生改變，通過檢測便可知這兩種蛋白的結合情況。SPR技術的優(yōu)點是不需標記物或染料，反應過程可實時監(jiān)控。測定快速且安全，還可用于檢測蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用。四、熒光能量轉移技術（ fluorescence resonance energy transfe，r FRET ） FRET ： 優(yōu)點：體內(nèi)測定兩個蛋白質之間的相互作用；敏感度高；溶解度好？；大分子的主要構象變化能測定；定量和定性測定相互作用。 缺點：只能測定熒光基團大小為（ 20-100?）的分子；儀器設備很貴；需要熒光標記FRET 可用于研究活

8、細胞生理條件下研究蛋白質 -蛋白質間相互作用?；驹恚涸趦蓚€不同的熒光基團中，如果一個熒光基團（供體Donor ）的發(fā)射光譜與另一個基團（受體Acceptor ）的吸收光譜有一定的重疊，當這兩個熒光基團間的距離合適時（一般小于 100 ?），就可觀察到熒光能量由供體向受體共振轉移的現(xiàn)象，即以前一種基團的激發(fā)波長激發(fā)時，可觀察到后一個基團發(fā)射的熒光。其中以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）及其突變體的應用最為廣泛。特點： a 反映在當時活細胞生理條件下蛋白質-蛋白質間相互作用的動態(tài)變化過程 ;b 兩個熒光集團間的合適距離為20100 ?（210nm）

9、;c需用熒光或GFP標記測試蛋白。熒光共振能量轉移（ FRET ）廣泛用于研究分子間的距離及其相互作用 ; 與熒光顯微鏡結合，可定量獲取有關生物活體內(nèi)蛋白質、脂類、DNA和RNA的時空信息。隨著綠色熒光蛋白（GFP）的發(fā)展，F(xiàn)RET熒光顯微鏡有可能實時測量活體細胞內(nèi)分子的動態(tài)性質。提出了一種定量測量 FRET 效率以及供體與受體間距離的簡單方法， 僅需使用一組濾光片和測量一個比值，利用供體和受體的發(fā)射譜消除光譜間的串擾。該方法簡單快速，可實時定量 測量 FRET 的效率和供體與受體間的距離，尤其適用于基于GFP 的供體受體對。FRET就是采用非放射方法，在供體和受體相互靠得很近（1-10 nm

10、）時，將光子能從一個受激發(fā)的熒光團（供體）轉移到另一個熒光團（受體）。當它們足夠接近時，用 CFP的吸收波長激發(fā)，CFP的發(fā)色基團將會把能量高效率地共振轉移至YFP的發(fā)色基團上，所以 CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失， 主要發(fā)射將是 YFP 的熒光。 兩個發(fā)色基團之間的能量轉換效率與它們之間的空間距離的 6 次方成反比， 對空間 位置的改變非常靈敏。例如要研究兩種蛋白質a和b間的相互作用，可以根據(jù)FRET原理構建一融合蛋白，這種融合蛋白由三部分組成：CFP（ cyan fluorescent protein ）、蛋白質 b、YFP（yellow fluorescent protein）。用 CFP

11、 吸收波長 433nm 作為激發(fā)波長，實驗靈巧設計，使當 蛋白質a與b沒有發(fā)生相互作用時，CFP與YFP相距很遠不能發(fā)生熒光共振能量轉移，因而檢測到的是 CFP的發(fā)射波長為476nm的熒光；但當?shù)鞍踪|a與b發(fā)生相互作用時，由于蛋白質b受蛋白質a作用而發(fā)生構象變化，使CFP與YFP充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉移，此時檢測到的就是 YFP 的發(fā)射波長為 527nm 的熒光 （圖 1）。將編碼這種融合蛋白的基因通過轉基因技術使其在細胞內(nèi)表達，這樣就可以在活 細胞生理條件下研究蛋白質蛋白質間的相互作用。五、抗體與蛋白質陣列技術蛋白芯片技術的出現(xiàn)給蛋白質組學研究帶來新的思路。蛋白質組學研究中一個主要的內(nèi)容

12、就是研究在不同生理狀態(tài)下蛋白水平的量變， 微型化，集 成化，高通量化的抗體芯片就是一個非常好的研究工具，他也是芯片中發(fā)展最快的芯片，而且在技術上已經(jīng)日益成熟。這些 抗體芯片有的已經(jīng)在向臨床應用上發(fā)展， 比如腫瘤標志物抗體芯片等，還有很多已經(jīng)應用再眼就的各個領域里。六、免疫共沉淀技術免疫共沉淀主要是用來研究蛋白質與蛋白質相互作用的一種技術，其基本原理是，在細胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育后再加 入與抗體特 異結合的結合于Pansobin珠上的金黃色葡萄球菌蛋白A（SPA），若細胞中有正與興趣蛋白結合的目的蛋白，就可以形成這樣一種復合物：目的蛋白一興趣蛋白一抗興趣蛋白抗體 一 |Pansob

13、in，因為SPA|Pansobin比較大，這樣復合物在離心時就被分離出來。 經(jīng)變性聚丙烯酰胺 凝膠電泳，復合物四組分又被分開。然后經(jīng) Western blotting 法，用抗體檢測目的蛋白是什么，是否為預測蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內(nèi)天然與興趣蛋白結合的，符合體內(nèi)實際情況，得到的蛋白可信度高。（1）原理當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質一蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X,那么與X在體內(nèi)結合的蛋白質 Y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內(nèi)結合，也可用于確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔缺點：一是兩種蛋白質的結合可能

14、不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；二是必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性，三是可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質一蛋白質相互作用七、pull-down 技術蛋白質相互作用的類型有牢固型相互作用和暫時型相互作用兩種。牢固型相互作用以多亞基蛋白復合體常見，最好通過免疫共沉淀（CoIP） > Pull-down技術或Far-western法研究。Pull-down技術用固相化的、已標記的餌蛋白或標簽蛋白（生物素-、PolyHis-或GST-），從細胞裂解液中釣岀與之相互作用的蛋白。 通過Pull-down技

15、術可以確定已知的蛋白與釣岀蛋白或已純化的相關蛋白間的相互作用關系，從體外傳路或翻譯體系中檢測岀蛋白相互作用關系。1）原理細菌表達的谷胱甘肽s轉移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的親和純化，也可以將GST融合蛋白作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白結合，然后根據(jù)谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀GST融合蛋白的能力來確定相互作用的蛋白。一般在得到目標蛋白的抗體前，或發(fā)現(xiàn)抗體干擾蛋白質一蛋白質之間的相互作用時，可以啟用GST沉降技術。該方法只是用于確定體外的相互作用。兩種應用：1）確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用2）證實探針蛋白與已知蛋白質間可疑的相互作用生物學意義是一切：1） 通過

16、改變蛋白質的相互作用，分析由蛋白質相互作用改變而產(chǎn)生的生物學現(xiàn)象。如通過酵母雙雜交或蛋白質組分析，發(fā)現(xiàn)相互作用蛋 白質，再分析這些作用的生物學意義。人們?nèi)菀追傅腻e誤是：研究一大堆的蛋白相互作用，卻不知道這些相互作用有什么生物學意義。2）通過改變生物學現(xiàn)象，分析其中相關的蛋白質以及相互作用。如小分子化合物抑制了某一生物學活動，發(fā)現(xiàn)相應變化的蛋白質，再分 析蛋白質的功能和作用。人們?nèi)菀追傅腻e誤是：找到了平行變化的不相關蛋白質。蛋白質相互作用的親和力是技術的基礎。Kd=AB/AB 。Kd越小，親和力越好?？贵w的親和力為10-8 -10-10 M是好,10-6M是弱蛋白質相互作用的應用：發(fā)現(xiàn)新的相互作

17、用和相互作用蛋白 利用抗原和抗體的相互作用的技術：1）Westrern blot :變性抗原，主要用于檢測蛋白的存在與否2）免疫共沉淀：非變性抗原，用于鑒定不同蛋白質間的相互作用Ab Pr1 Pr2：免疫共沉淀。Pr1 Ab Pr2：非特異性結合3） 染色質沉淀：用抗體沉淀抗原得到與抗原結合的DNA，用PCR鑒定DNA，從而證明蛋白質和特定 DNA間的相互作用。4） 過時的抗體篩選:CDNA表達庫，抗體結合表達的蛋白質，從而得到基因。有了質譜和PCR后過時。利用已知的相互作用建立tag：1）GST pull down :已知蛋白質和 GST融合，與細胞或組織的“蛋白質湯”混合，用谷胱甘肽親和層

18、析分離和已知蛋白質結合的新蛋白 質。GST tag2） Biotin-Avidin結合：生物素標記已知蛋白質，通過Avidin結合生物素標記的蛋白質，從而得到與生物素標記蛋白結合的新蛋白質。優(yōu)點是biotin avidin的結合是最牢靠的；缺點是細胞內(nèi)結合biotin的蛋白質很多。3）其它各種tag。例子？生物素-親和素系統(tǒng)（biotin-avidin system，BAS）是以生物素和親和素具有的獨特結合特性為基礎，結合二者即可偶聯(lián)抗原抗體等大分子 生物活性物質，它們的結合迅速、專一、穩(wěn)定，并具有多級放大效應。自20世紀70年代，BAS開始應用于免疫化學領域以來，利用BAS可被熒光索、酶、放

19、射性核素等材料標記的特點而發(fā)展和建立了許多新的檢測方法和技術，尤其是與免疫標記技術的有機結合，極大地提 高了測定的靈敏度。直接利用蛋白質的相互作用：1）蛋白質親和層析：用蛋白質當親和層析的親和基團。要有大量的蛋白質2）酵母雙雜交：優(yōu)點是簡單；缺點是不能得到修飾調控型的相互作用蛋白質。還有衍生的酵母三雜交以及單雜交。3） 噬菌體展示：Physically固定蛋白質，結合 phage，洗脫，擴增phage，再結合；循環(huán)4） 快成化石的Bait蛋白質篩表達庫：bait蛋白質用同位素、GST、等標記，再篩庫。5）網(wǎng)打盡的 蛋白質組：這是檢測和鑒定蛋白質的方法。由于檢測和鑒定方法上的提高，使得許多蛋白質

20、間的相互作用都可以被用于發(fā) 現(xiàn)新的蛋白質和新的相互作用。缺點是發(fā)現(xiàn)的相互作用蛋白質太多常常超岀人們的辨別能力和研究能力。技術成果的鑒定：蛋白質相互作用的生物學功能 是蛋白質相互作用的意義1） 相互作用的證實：不同的發(fā)現(xiàn)互相作用的技術都可以用來被驗證相互作用的蛋白質。如GST pull down發(fā)現(xiàn)的蛋白質，用免疫共沉淀 或酵母雙雜交驗證。越接近生理狀態(tài)的證實越好。驗證方法和發(fā)現(xiàn)方法的差別越大驗證結果也越可靠。采用的方法多，結果也越可靠。2） 相互作用的生物學功能：有重要生物學功能的相互作用、一般功能的相互作用、還是沒有功能的相互作用。有運氣的成分。如果從重要功能蛋白質岀發(fā)，從重要生物學現(xiàn)象岀發(fā)

21、，“運氣”會越好。生物學功能的研究：技術成果的大小相互作用的生物學功能研究基本上可以歸為兩類：獲得功能或失去功能。獲得功能：轉基因表達，使得原本不表達該蛋白質的細胞表達了蛋白質，從而和已有的蛋白質發(fā)生相互作用，細胞有新的功能。常用的方 法有細胞內(nèi)轉基因過表達蛋白質、轉基因老鼠。失去功能：抑制蛋白質的表達或用 dominant negative突變體，使原有的蛋白質缺失或失活，細胞功能的喪失。常用的方法有：RNA干擾使蛋白質不表達、蛋白質部分功能片斷的影響、基因敲除的細胞、基因敲除的老鼠。一、一些常用蛋白質相互作用技術：蛋白質相互作用的親和力是技術的基礎。Kd=AB/AB 。Kd越小，親和力越好

22、?？贵w的親和力為10-8 -10-10 M是好,10-6M是弱。1、蛋白質相互作用的目的是發(fā)現(xiàn)蛋白質與蛋白質的相互作用：生化方法（co-purification 提純，親和色譜法，GST pull down ,IP，WB, Far-Western ）Surface plasmon resonance表面等離子體諧振、遺傳分析、酵母雙雜交、Fluorescence resonance energy transfer FRET 熒光共振能量轉移、2、注釋：表面等離子體諧振 （Surface Plasmon Resonance,SPR）生化分析儀，是基于物理光學現(xiàn)象和生物傳感技術的新型生化分析系統(tǒng)。

23、熒光共振能量轉移（FPET）：當生色團被光照時，被照射激發(fā)的分子可以通過散發(fā)能量來返回到基態(tài)1-3。光能可被生色團在10-15秒內(nèi)吸收而在10-9秒內(nèi)在發(fā)射出來。然而，也有可能被激發(fā)分子并不發(fā)光而將能量傳遞給別的生色團或是另外的熒光素，這些熒光素可以在相同的時間量級內(nèi)發(fā)熒光，這后一種現(xiàn)象稱為FPET.應用：是比較分子間距離與分子直徑的有效工具，廣泛用于研究各種涉及分子間距離變化的生物現(xiàn)象，可以定量測量兩個發(fā)光基團之間的 距離，在蛋白質空間構象、蛋白與蛋白間相互作用、核酸與蛋白間相互作用得到廣泛應用。3、生化方法的具體實驗：1）GST pull down ,見 ppt252）IP和CoIP：上網(wǎng)

24、查3）Far-Western:a不是用抗體直接與膜上的蛋白質結合，而是用另一個蛋白質通過相互作用與膜上蛋白質作用。b.直接標記另一個蛋白質或用抗另一個蛋白質的抗體做 Western blot。c.因為是蛋白質相互作用，F(xiàn)ar-Western常常會包含一步蛋白質復性的過程。4） SPR：用來監(jiān)控生物特定表面在金屬層的相互作用，通過測量這個相互作用引起的溶液濃度的變化。具體過程？BLAcore SPR的優(yōu)點：不用標記；實時測量4、遺傳方法：例子：有A :小量表達；有 B :無表達；有C:無表達有A和B :表達增加；有A和C :小量表達；有 B和C:無表達有A、B、C:高表達結論：在A、B和C的蛋白

25、質復合體中，A是和基因調控區(qū)結合并有小的轉錄活性；B可以和A結合促進A的轉錄活性；C本身不能直接促進A的活性，所以不大可能和 A有直接相互作用，但能通過B的介導進一步促進轉錄。二、研究實例討論：1、 G2/M期阻斷的實驗測定方法：根據(jù)DNA的含量變化2、 親和層吸：對磷酸化蛋白質有特異性的結合（PY蛋白）3、質譜鑒定蛋白4、磷酸化蛋白質的驗證5、 蛋白質生物學功能的驗證：Loss of function and gain of function6、進一步尋找相互作用蛋白質7、細胞內(nèi)的定位和細胞器，與細胞器的動態(tài)相互作用8、根據(jù)已知的蛋白質結構和功能的特點，提岀功能模型9、模型的驗證10、得到研

26、究結論1 .2. 生化方法 (Biochemical approaches )1.1 共純化、共沉淀 Traditional co-purification (chromatography co-purification and co-sedimentation) 在不同基質上進行色譜層析1.2蛋白質親和層析(Affinity chromatography )將一種蛋白質固定于某種基質上(如Sepharose),當細胞抽提液經(jīng)過改基質時，可與改固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒有吸附的非目標蛋白則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過改變洗脫液或者洗脫條件而 回收下來。GST pull dow

27、n :為了更有效的利用蛋白質親和色譜，可以將待純話的蛋白以融合蛋白的形式表達，即將”誘餌“蛋白與一種易于純化的配體蛋白融合。例如與GST融合的蛋白再經(jīng)過 GSH的色譜柱時，就可以通過GST和GSH的相互作用而被吸附。當載有細胞抽提物經(jīng)過柱時，就可以得到能夠與“誘餌”蛋白相互作用的目標蛋白了。Epitope-tag:表位附加標記技術就是將附加的抗原融合到目的蛋白以檢測目的蛋白的表達，同時還可以通過親和層析法來純化目的蛋白。缺點：表位附加標記可能會使融合蛋白不穩(wěn)定，改變或使融合蛋白功能喪失。以上兩種方法都要共同的缺點：假陽性。實驗所檢測到的相互作用可能時由蛋白質所帶電荷引起的，并不是生理性的相互作

28、用；蛋白 的相互作用可能并不是直接的，可是由第三者作為中介的；有時會檢測到兩種在細胞中不可能相遇卻有極強親和力的蛋白。因此實驗結果 還應經(jīng)其他方法驗證。1.3 免疫共沉淀(Immunoprecipitation )免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經(jīng)典方法。改法的優(yōu)點是蛋白處于天然狀態(tài)，蛋白 的相互作用可以在天然狀態(tài)下進行，可以避免認為影響；可以分離得到天然狀態(tài)下相互作用的蛋白復合體。缺點：免疫共沉淀同樣不能保證沉淀的蛋白復合物時候為直接相互作用的兩種蛋白。另外靈敏度不如親和色譜高。Pmtttn complexAnttbody capturvLC-WS-M

29、S11外翅夠AntibodyProftjJn c amplerIdentify components1.4 Far-Western又叫做親和印記。將 PAGE膠上分離好的凡百樣品轉移到硝酸纖維膜上，然后檢測哪種蛋白能與標記了同位素的誘餌蛋白發(fā)生作用, 最后顯影。缺點是轉膜前需要將蛋白復性。3. 表面等離子共振 (Surface plasmon resonance )該技術是將誘餌蛋白結合于葡聚糖表面，葡聚糖層固定于幾十納米厚的技術膜表面。當有蛋白質混合物經(jīng)過時，如果有蛋白質同“誘 餌”蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結合將使金屬膜表面的折射綠上升，從而導致共振角度的改變。而共振角度的改變與該處的蛋

30、白質濃度成線性關系，由此可以檢測蛋白質之間的相互作用。該技術不需要標記物和染料，安全靈敏快速，還可定量分析。缺點：需要專門的等離子表面共振檢測儀器。芯片比較昂貴，如果重復使用可能導致結果不好。4. 遺傳學方法 (Genetic approaches )3.1基因外抑制子基因外抑制子是通過一個基因的突變來彌補原有基因的突變。比如相互作用的蛋白 A和B,如果A發(fā)生了突變使兩者不再相互作用，此時B如果再發(fā)生彌補性突變就可以使兩者的相互作用恢復，那么B就是A的基因外抑制子。 缺點：需要知道基因，要有表型，篩選抑制子比較費時。3.2合成致死篩選指兩個基因同時發(fā)生突變會產(chǎn)生致死效應，而當每個基因單獨發(fā)生突

31、變時則無致死效應。用于分析兩個具有相同重要蛋白之間的相互 作用。5. 酵母雙雜交 (Two-hybrid )原理基于真核細胞轉錄因子的結構特殊性，這些轉錄因子通常需要兩個或以上相互獨立的結構域組成。分別使結合域和激活域同誘餌 蛋白和獵物蛋白形成融合蛋白，在真核細胞中表達，如果兩種蛋白可以發(fā)生相互作用，則可使結合域和激活域在空間上充分接近，從而激 活報告基因。優(yōu)點是是酵母細胞內(nèi)的 in vivo相互作用，只需要 cDNA，簡單，弱的相互作用也能檢測到。缺點：自身有轉錄功能的蛋白或者有其他蛋白插足介導或者自身激活報告基因會造成假陽性。融合蛋白會影響蛋白的真實結構和功能;不利于核外蛋白研究，會導致假

32、隱性。另外還有酵母的翻譯后修飾不盡相同。尤其是蛋白質的調控性修飾；對基因庫的要求比較高，單向 1/3是in frame ;蛋白質毒性等。6. 熒光共振能量轉移技術(Fluorescence resonance energy transfer)指兩個熒光法色基團在足夠近(<100埃)時，它們之間可發(fā)生能量轉移的現(xiàn)象。熒光共振能量轉移技術可以研究分子內(nèi)部對某些刺激發(fā)生的構象變化，也能研究分子間的相互作用。它可以在活體中檢測，非常靈敏，分辯率高，能夠檢測大分子的構象變化，能夠定性定量 的檢測相互作用的強度。缺點：此項技術要求發(fā)色基團的距離<100埃。另外設備昂貴，還需要融合GFP給蛋白標

33、記。此外還有交聯(lián)技術(cross- linKing )，蛋白質探針技術，噬菌體展示技術(Phage display)以及生物信息學的方法來檢測蛋白質之間相互作用<,1502.2酵母雙雜交2.2.1構建pBD-A與pAD-I兩種重組表達質粒GAL4激活結構域；2.2.2 pBD-A與pAD-I兩種質粒共轉化酵母細胞。分別設置如下對照組：pBD / pAD ；pBD-A / pAD ；pBD / pAD-I ；這樣使得待研究蛋白可融合表Yeast Two1159$w 4-Hybrid Vec?o達GAL4 DNA結合結構域和2.2.3藍白斑法驗證 LacZ基因的表達情況。 說明:如果蛋白A和

34、蛋白I能夠相互作用， 達。Co-leans formationEzpressiort of DB-X and AD-Y prcleins0曲匸那么GAL4 DNA 結合結構域和 GAL4激活結構域就會相互作用從而激活lacZ報道基因的表如果設置的實驗組長岀藍色克隆而對照組沒有的話基本上可證明蛋白A和蛋白I有相互作用»>aohnlerac!Trgri£QFip143MPramolerBep orier3）研究蛋白質相互作用的意義：細胞生命活動的基礎'穩(wěn)定相互作用-protein complex 瞬時相互作用-enzyme-substrate蛋白質相互作用如無相應

35、功能是沒有研究意義的！蛋白質相互作用一-_一二-生物學功能4）蛋白質相互作用的親和力-一切蛋白質相互作用的基礎AB = A + B Kd=AB/AB（ Kd: dissociation constant ）5）蛋白質相互作用的應用1、利用抗原和抗體的相互作用Western blot :變性抗原，主要用于檢測蛋白質的存在與否。 免疫共沉淀：非變性抗原，用于鑒定不同蛋白質間的相互作用。Ab - Pr1 Pr2：免疫共沉淀Pr1 - Ab - Pr2 :非特異性結合染色質沉淀：用抗體沉淀抗原得到與抗原結合的DNA，用PCR鑒定DNA，從而證明蛋白質和特定DNA間的相互作用2、利用已知的相互作用建立

36、tagGST pull down :已知蛋白質和GST融合，與細胞或組織的“蛋白質湯”混合，用谷胱甘肽親和層析分離和已知蛋白質結合的新蛋白 質，即 GST tag。Biotin - Avidin結合：Biotin標記已知蛋白質， 通過Avidin結合biotin標記的蛋白質，從而得到與biotin標記蛋白結合的新蛋白質。 點是biotin - avidin的結合是最牢靠的；缺點是細胞內(nèi)結合biotin的蛋白質很多。3、直接利用蛋白質的相互作用蛋白質親和層析：用蛋白質當親和層析的親和基團。要有大量的蛋白質。酵母雙雜交：優(yōu)點是簡單；缺點是不能得到修飾調控型的相互作用蛋白質。還有衍生的酵母三雜交以及

37、單雜交。phage display： Physically固定蛋白質，結合 phage，洗脫，擴增 phage,再結合；這樣做好幾輪。Bait蛋白質篩表達庫：bait蛋白質用同位素、GST、等標記，再篩庫。蛋白質組：這是檢測和鑒定蛋白質的方法。不管用什么方法，只要你能得到結合的蛋白質，理論上蛋白質組都可以分析。但由于檢測 和鑒定方法上的提高，使得許多蛋白質間的相互作用都可以被用于發(fā)現(xiàn)新的蛋白質和新的相互作用。缺點是發(fā)現(xiàn)的相互作用蛋白質太多常 常超岀人們的辨別能力和研究能力。2）發(fā)現(xiàn)相互作用的生物學意義相互作用的證實：不同的發(fā)現(xiàn)相互作用的技術都可以被用來驗證相互作用的蛋白質。相互作用的生物學功能

38、：有重要生物學功能的相互作用、一般功能的相互作用、還是沒有功能的相互作用。3）生物學功能的研究功能的獲得：轉基因表達，使得原本不表達該蛋白質的細胞表達了蛋白質，從而和已有的蛋白質發(fā)生相互作用，細胞有了新的功能。常用技術：細胞內(nèi)轉基因過表達蛋白質、轉基因老鼠功能的失去：抑制蛋白質的表達或用dominant negative突變體，使原有的蛋白質缺失或失活，細胞功能的喪失常用技術：RNA干擾使蛋白質不表達、蛋白質部分功能片斷的影響、基因敲除的細胞、基因敲除的老鼠一些常用蛋白質相互作用技術5）生化方法Traditional co-purificationAffinity chromatography

39、(GST pull down)ImmunoprecipitationWestern and Far-Western blota. GST pull down已知蛋白質和GST融合，與細胞或組織的 蛋白質湯”混合，用谷胱甘肽親和層析分離和已知蛋白質結合的新蛋白質GST tag谷胱甘肽T Fusion Protein PurificationGST （谷胱甘肽S轉移酶）GST fusi on proteinbindingwashelutionbindingGST的結合較弱!b. 免疫共沉淀免疫沉淀：通過抗原與抗體的結合得到所要的蛋白質免疫共沉淀：通過抗原與抗體的結合，得到與該已知蛋白有相互作用的蛋

40、白質 優(yōu)點為：（1）相互作用的蛋白質都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響;（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。缺點為：（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質蛋白質相互作用；（2） 兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；（3） 必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結果，方法本身具 有冒險性。c. 蛋白質分析技術：SDS PAGE :蛋白質按分子大小分離。Western Blot：顯示特異蛋白質的技術?；驹?采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質， “探針”是抗體， “顯色”用標記的二抗。經(jīng)過 PAGE 分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（ PVDF 膜全面優(yōu)于 nitrocellulose 膜）上，固相載體