熒光顯微鏡原理與標(biāo)本的制作方法

1、南京碧波生物科技有限公司熒光顯微鏡原理與標(biāo)本的制作方法熒光顯微鏡原理熒光顯微鏡是免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的基本工具。它是由光源、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要 部件組成。是利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光，通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標(biāo)本的 熒光圖像（一）光源現(xiàn)在多采用200W的超高壓汞燈作光源，它是用石英玻璃制作，中間呈球形，內(nèi)充一定 數(shù)量的汞，工作時由兩個電極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當(dāng)水銀完全蒸發(fā) 時，可達5070個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力，這一過程一般約需515min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強的紫外和藍(lán)紫光， 足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)，因此

2、，為熒光顯微鏡普遍采用。超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能。因此，燈室必須有良好的散熱條件，工作環(huán)境溫度不宜太 高。新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃，使用一些時間后，則需要高壓啟動（約為15000V，啟動后，維持工作電壓一般為5060V,工作電流約 4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2h的情況下約為200h,開動一次工作時間愈短，則壽命愈短，如開一次只工作 20min,則壽命降低50%因此，使用時盡量減少啟動次數(shù)。燈泡在使用過 程中，其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動。點燃燈泡后不可立即關(guān)閉，以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極，一般需要等15mi n。由于超高壓汞燈壓

3、力很高，紫外線強烈，因此燈泡必須置燈室中方可點燃，以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸時造成操作。超高壓汞燈（100W或200W）光源的電路和包括變壓、鎮(zhèn)流、啟動幾個部分。在燈室上 有調(diào)節(jié) 燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng)，燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡，前面安裝有集光透 鏡。國產(chǎn)超高壓汞燈 GCQ-200型性能良好，可以代替 HB0-200等型的進口燈泡，平均壽命在 200h以上，價格也比較低。我國研制的一種簡易輕便型高色溫溴鎢熒光光源裝置，體積小，重量輕，功率小，交、 直流兩用（自帶直流電源），易于攜帶，使用方便，已推廣應(yīng)用。（二）濾色系統(tǒng)濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位，由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。濾板型號，各廠家

4、名 稱常不統(tǒng)一。濾板一般都以基本色調(diào)命名，前面字母代表色調(diào)，后面字母代表玻璃，數(shù)字代 表型號特點。如德國產(chǎn)品（Schott ） BG12就是種藍(lán)色玻璃，B是藍(lán)色的第一個字母，G 是玻璃的第一個字母；我國產(chǎn)品的名稱已統(tǒng)一用拼音字母表示，如相當(dāng)于BG12的藍(lán)色濾板名為QB24 Q是青色（藍(lán)色）拼音的第一個字母，B是玻璃拼音的第一個字母。不過有的濾板也可以透光分界濾長命名，如K530,就是表示壓制濾長 530nm以下的光而透過 530nm以上的光。還有的廠家的濾板完全以數(shù)字命名，如美國 Corning廠的NO 5-58，即相當(dāng)于BG12 1 激發(fā)濾板根據(jù)光源和熒光色素的特點，可選用以下三類激發(fā)濾板，

5、提供一定波長范圍的激發(fā)光。紫外光激發(fā)濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過。 常用型號為UG-1或UG-5,外加一塊 BG-38,以除去紅色尾波。紫外藍(lán)光激發(fā)濾板：此濾板可使300450nm范圍內(nèi)的光通過。常用型號為ZB-2或ZB-3，外加 BG-3&紫藍(lán)光激發(fā)濾板：它可使 350490nm的光通過。常用型號為 QB24（BG12。最大吸收峰在500nm以上者的熒光素（如羅達明色素）可用藍(lán)綠濾板（如B-7）激發(fā)。近年開始采用金屬膜干涉濾板，由于針對性強，波長適當(dāng)，因而激發(fā)效果比較玻璃濾更 好。如西德Leitz廠的FITC專用KP490濾板和羅達明的

6、S546綠色濾板，均遠(yuǎn)比玻璃濾板效 果好。激發(fā)濾板分薄厚兩種，一般暗視野選用薄濾板，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些。基本 要求是以獲得最明亮的熒光和最好的背景為準(zhǔn)。2 壓制濾板 壓制濾板的作用是完全阻擋激發(fā)光通過，提供相應(yīng)濾長范圍的熒光。與激發(fā)濾 板相對應(yīng)，常用以下 3種壓制濾板：紫外光壓制濾板：可通過可見光、阻擋紫外光通過。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或 GG-6K460紫藍(lán)光壓制濾板：能通過 510nm以上濾長的熒光（綠到紅），能與BG-12組合。通常用 OG-4K510或 OG-1K530紫外紫光壓制濾板：能通過 460nm以上波長的熒光（藍(lán)到紅），可與 BG-3組合，

7、常用 OG-11K470AK 490 K510b（三）反光鏡反光鏡的反光層一般是鍍鋁的，因為鋁對紫外光和可見光的藍(lán)紫區(qū)吸收少，反射達90%以上，而銀的反射只有 70% 一般使用平面反光鏡。（四）聚光鏡專為熒光顯微鏡設(shè)計制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明視野聚光器的暗視野聚光器兩種。還有相差熒光聚光器。1 明視野聚光器在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強，使用方便，特別適于低、中倍放大的標(biāo)本觀察。2 暗視野聚光器暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應(yīng)用日益廣泛。因為激發(fā)光不直接進入物鏡，因而除散射光外，激發(fā)光也不進入目鏡，可以使用薄的激發(fā)濾板，增強激發(fā)光的 強度，壓制濾

8、板也可以很薄，因紫外光激發(fā)時，可用無色濾板（不透過紫外）而仍然產(chǎn)生黑 暗的背景。從而增強了熒光圖像的亮度和反襯度，提高了圖像的質(zhì)量，觀察舒適，可能發(fā)現(xiàn) 亮視野難以分辨的細(xì)微熒光顆粒。3 相差熒光聚光器相差聚光器與相差物鏡配合使用，可同時進行相差和熒光聯(lián)合觀察，既能看到熒光圖像，又能看到相差圖像，有助于熒光的定位準(zhǔn)確。一般熒光觀察很少需 要這種聚光器。（五）物鏡各種物鏡均可應(yīng)用，但最好用消色差的物鏡，因其自體熒光極微且透光性能（波長范圍）適合于熒光。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比，而與其放大 倍數(shù)成反比，所以為了提高熒光圖像的亮度，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大時

9、其影響非常明顯。因此對熒光不夠強的標(biāo)本，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡，配合以盡可能低的目 鏡（4X ,5 X, 6.3 X等）。（六）目鏡在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡，如5X和6.3 X。過去多用單筒目鏡，因為其亮度比雙筒目鏡高一倍以上，但目前研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡，觀察很方便。（七）落射光裝置新型的落射光裝置是從光源來的光射到干涉分光濾鏡后，波長短的部分（紫外和紫藍(lán)） 由于濾鏡上鍍膜的性質(zhì)而反射，當(dāng)濾鏡對向光源呈45。傾斜時，則垂直射向物鏡，經(jīng)物鏡射向標(biāo)本，使標(biāo)本受到激發(fā)，這時物鏡直接起聚光器的作用。同時，濾長長的部分(綠、黃、紅等)，對濾鏡是可透的，因此，不向物鏡方向反射，濾鏡起了激發(fā)濾板作用

10、，由于標(biāo)本的 熒光處在可見光長波區(qū)，可透過濾鏡而到達目鏡觀察，熒光圖像的亮度隨著放大倍數(shù)增大而 提高，在高放大時比透射光源強。它除具有透射式光源的功能外，更適用于不透明及半透明 標(biāo)本，如厚片、濾膜、菌落、組織培養(yǎng)標(biāo)本等的直接觀察。近年研制的新型熒光顯微鏡多采 用落射光裝置，稱之為落射熒光顯微鏡。二、熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求(一) 載玻片載玻片厚度應(yīng)在0.81.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激 發(fā)光在標(biāo)本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發(fā)熒光。有時需用石英玻璃載玻 片。(二) 蓋玻片蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特

11、制的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質(zhì)(如氟化鎂)的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光女可激發(fā)標(biāo)本。(三) 標(biāo)本組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察 到的上部不充分激發(fā)。另外，細(xì)胞重迭或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。(四) 封裱劑封裱劑常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.59.5時較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.09.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。(五) 鏡油一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時，必須使用鏡油，最好使用特制的無熒光鏡 油，也可用上述甘油代替，液體石蠟

12、也可用，只是折光率較低，對圖像質(zhì)量略有影響。三、使用熒光顯微鏡的注意事項(1) 嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。(2) 應(yīng)在暗室中進行檢查。進入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈515min,待光 源發(fā)出強光穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開始觀察標(biāo)本。(3) 防止紫外線對眼睛的損害，在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護眼鏡。(4) 檢查時間每次以 12h為宜，超過90min,超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射 35min后，熒光也明顯減弱；所以，最多不得超過23h。(5) 熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時間，保護光源。天熱時， 應(yīng)加電扇散熱降溫，新

13、換燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再用時，須待燈泡充分冷卻后才能點燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源。(6) 標(biāo)本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋 中4C保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發(fā)。(7) 熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：一般分為四級，即“一”一無或可見微弱熒光?！?”一僅 能見明確可見的熒光。“ +” 一可見有明亮的熒光?！?+” 一可見耀眼的熒光。四、熒光圖像的記錄方法熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學(xué)特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在 判斷結(jié)果時，必須將二者結(jié)合起來綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標(biāo)，即憑工作者目力觀察。 作為一般定性觀察，基本上可

14、靠的。隨著技術(shù)科學(xué)的發(fā)展，在不同程度上采用客觀指標(biāo)記錄 判斷結(jié)果，如用細(xì)胞分光光度計，圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結(jié)果，也必須結(jié)合 主觀的判斷。熒光顯微鏡攝影技術(shù)對于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時攝影 記錄結(jié)果。方法與普通顯微攝影技術(shù)基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24。以上。因紫外光對熒光猝滅作用大，如FITC的標(biāo)記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡 都有半自動或全自動顯微攝影系統(tǒng)裝置。使用中應(yīng)注意：末裝濾光片不要用眼直接觀察 ，以免引起眼的損傷；用油鏡觀察標(biāo)本時， 必

15、須用無熒光的特殊油鏡；高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開，需經(jīng)5分鐘后才能再啟動，否則會不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。標(biāo)本的制作方法樣品須經(jīng)過石蠟包埋切片，然后用鐵磯蘇木精染色，普通光鏡觀察效果還可以.作熒光觀察需用熒光染料DAPI染色，石蠟切片的過程：1. 取材：刀片要求鋒利而薄，組織厚度約23mm,大小1.5 X 1.5 X 0.20.3cm為宜.取材時間越快越好.2. 固定：組織取下后應(yīng)立即放入10%畐爾馬林(相當(dāng)于4辦醛)固定.注意:(1).固定液量應(yīng)為組織塊體積的40倍.(2) 固定時間固定時間與使用的固定液種類和組織塊大小，溫度等有關(guān).一般為324h.(3) 固定溫度大多可在室溫固定，在低溫(4 °C)時間應(yīng)延長.(4) 固定容器應(yīng)大些.3. 漂洗：流水沖洗210h.4. 脫水：從低濃度酒精到高濃度酒精.70%(數(shù)分鐘)t80%(60-120' ) t90%(60-120')宀95%(60-120')宀95%(60-120')宀 100%(60-120