酶聯(lián)免疫在食品檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展(共6頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上酶聯(lián)免疫法在食品分析檢測(cè)中的應(yīng)用lyz摘要: 介紹了酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)原理, 闡述了該技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展。討論了該技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)及其應(yīng)用前景關(guān)鍵詞: 酶聯(lián)免疫法;食品分析;檢測(cè)The Application of ELISA in Food Analysis DeterminationStudent majoring in food engineering，Yizhe LiuAbstract: The technology of Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was briefly introduce

2、d. Meanwhile, the application of ELISA in analysis of food safety and determination progress were commented, including pesticide residue, animal drug residue, food toxins, pathogenic microorganisms and the compositions of genetically modified foods, etc. The development tendency of ELISA and its app

3、lication prospect were discussed.Keywords: Enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA); Food analysis; determination1 引言我國(guó)的食品安全問(wèn)題已不再單純的是一般的質(zhì)量問(wèn)題，食品自然甚至人為地污染日趨多樣化和復(fù)雜化，緊抓食品安全控制成為了關(guān)系國(guó)計(jì)民生的大事，人民和政府的高度重視迫使食品科技不斷增加新的檢驗(yàn)項(xiàng)目，利用新的科技手段不斷提高檢驗(yàn)水平和質(zhì)量、效率。現(xiàn)今，食品安全檢測(cè)正朝著快速、靈敏、簡(jiǎn)便的方向發(fā)展。酶聯(lián)免疫技術(shù)正是迎合了這一方向而被越來(lái)越多地應(yīng)用于食品安全檢驗(yàn)領(lǐng)域的。2 酶聯(lián)免

4、疫吸附技術(shù)概述酶免疫技術(shù)是20世紀(jì)60年代在免疫熒光和組織化學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)，1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者 Van Weerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，即:酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)1。ELISA是目前應(yīng)用最廣泛、發(fā)展最快的一項(xiàng)酶免疫技術(shù)，它是將可溶性抗原（抗體）吸附到某種固相表面，并保持抗原（抗體）免疫活性，這樣在與標(biāo)本中抗體（抗原）反應(yīng)后，只需經(jīng)過(guò)固相的洗滌，就可以達(dá)到抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)的分離，大大簡(jiǎn)化了操作步

5、驟2。2.1 ELISA測(cè)定原理圖1 ELISA測(cè)定原理（以間接法為例）ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題，它將酶促反應(yīng)的高效率和免疫反應(yīng)的高度專一性有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，可對(duì)各種微量有機(jī)物含量進(jìn)行測(cè)定。ELISA檢測(cè)技術(shù)的基本原理是將酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合, 此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性, 也不影響酶的生物學(xué)活性。在測(cè)定時(shí), 酶標(biāo)抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合,受檢樣品與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)。加入酶反應(yīng)的底物后, 底物被酶催化成為有色產(chǎn)物, 顏色反應(yīng)的深淺與樣品中相應(yīng)抗體或抗原的量呈一定的比例關(guān)系

6、。故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性分析或通過(guò)酶標(biāo)儀進(jìn)行定量測(cè)定。由于酶的催化效率很高, 間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果, 使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度 3, 4。2.2 ELISA分類(lèi)ELISA方法的分類(lèi)至今還沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)5,最常用的測(cè)定方法有三類(lèi):(1)間接法測(cè)定抗原:將特異性抗原包被在固相載體上,從而形成固相抗原, 加入待檢樣品(含相應(yīng)抗體),抗體與固相抗原形成抗原-抗體復(fù)合物,再加入酶標(biāo)記的抗抗體(又稱二抗)與上述復(fù)合物結(jié)合,此時(shí)加入底物,復(fù)合物上的酶則與催化底物反應(yīng)而顯色,由于每步之間均有沖洗步驟。因此,若樣品中不含相應(yīng)的抗體,酶標(biāo)抗體則將被洗掉,底物不顯色而呈陰性反應(yīng);若樣品中含相應(yīng)的抗體

7、,底物顯色則呈陽(yáng)性反應(yīng)。(2)雙抗體夾心法測(cè)抗原:將已知的特異性抗體包被在固相載體上形成固相抗體,加入待檢樣品(含相應(yīng)抗原),其中抗原與固相抗體結(jié)合成復(fù)合物,再加入特異性的酶標(biāo)抗體,使之與已形成的抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合, 當(dāng)加入底物時(shí),酶則催化底物而顯色,根據(jù)顏色的有無(wú)和深淺,對(duì)待測(cè)抗原進(jìn)行定性和定量分析。(3)競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原:將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗體,加入待測(cè)樣品(含相應(yīng)抗原)和相應(yīng)的一定量的酶標(biāo)抗原,樣品中的抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合,待測(cè)樣品中抗原含量越高,則與固相抗體結(jié)合的越多,使得酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合的機(jī)會(huì)就越少,甚至沒(méi)有機(jī)會(huì)結(jié)合,這樣加入底物后就不顯色或顯色很淺

8、,顯色深者為陰性。前面兩種方法主要用于測(cè)定抗體和大分子抗原,通常用于臨床診斷,而競(jìng)爭(zhēng)法是測(cè)定小分子抗原的方法,適用于食品安全的檢測(cè)。由于食品安全檢測(cè)需測(cè)定的物質(zhì)大都是低分子量的,但免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體的抗原分子量要大(至少50000Da)。因此,首先小分子物質(zhì)必須結(jié)合高分子蛋白質(zhì)后才能作免疫檢測(cè)之用。競(jìng)爭(zhēng)法按實(shí)驗(yàn)操作原理的不同又可分成直接競(jìng)爭(zhēng)法和間接競(jìng)爭(zhēng)法, 研究者可根據(jù)自身的條件和實(shí)際要求, 靈活地設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)腅LISA法。另外還有捕獲法測(cè)IgM抗體、ABS (avidin biotinsystem) -ELISA法以及PCR- ELISA法和斑點(diǎn)免疫酶結(jié)合試驗(yàn)等檢測(cè)方法5。3 ELISA技術(shù)在食

9、品檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀近年來(lái)，ELISA因其操作程序的規(guī)范化、簡(jiǎn)單化和檢測(cè)的高靈敏性，在農(nóng)藥殘留、動(dòng)物違禁藥物殘留、有害細(xì)菌、有機(jī)物重金屬污染、生物毒素、有害添加劑以及病原體的快速檢測(cè)和分析等食品安全性檢測(cè)領(lǐng)域正逐步推廣應(yīng)用。3.1 毒素檢測(cè)真菌毒素是真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，有十幾種對(duì)人類(lèi)危害較大，它們具有毒性強(qiáng)和污染頻率高的特點(diǎn)。目前利用合成單克隆抗體的方式，幾乎所有重要真菌毒素如伏馬毒素、赭曲毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯酮、展青霉素、黃曲霉毒素（AFT）等的ELISA檢測(cè)方法均已建立。另外該方法也正在被廣泛地應(yīng)用于各種藻類(lèi)和貝類(lèi)毒素的檢測(cè)。不過(guò)目前國(guó)內(nèi)研究的最多的是黃曲霉毒素，王彩云等

10、分別采用黃曲霉毒素M1測(cè)定試劑盒（德國(guó)必發(fā)）貨號(hào)R1101和黃曲霉毒素B1測(cè)定試劑盒（德國(guó)必發(fā)）貨號(hào)R1211測(cè)定了奶粉中的黃曲霉毒素M1和食品配料中的黃曲霉毒素B1。柳潔等對(duì)糧油中的黃曲霉毒素B1用了AFLA酶聯(lián)免疫篩查試劑盒(美國(guó)International Diagnostic Systems公司)進(jìn)行測(cè)定，并與高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行比較，結(jié)果差距甚微。可以看出，ELISA技術(shù)在黃曲霉毒素的研究方面較為成熟，但是其測(cè)定的試劑盒也多為進(jìn)口，國(guó)內(nèi)自主研發(fā)的甚少，所以我們需要在自主研發(fā)領(lǐng)域多下功夫，掌握核心競(jìng)爭(zhēng)力才是硬道理6。3.2 細(xì)菌污染檢測(cè)目前利用ELSIA檢測(cè)食品中的有害細(xì)菌數(shù)量

11、有許多種途徑，其中通過(guò)制備單克隆抗體分析食品中細(xì)菌的酶聯(lián)免疫測(cè)定技術(shù)研究最多，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。ELISA法可用于檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌、軍團(tuán)菌、大腸桿菌、李斯特菌及金黃色葡萄球菌等致病微生物。另外，ELISA在寄生蟲(chóng)的檢測(cè)中也有應(yīng)用，如：豬弓形蟲(chóng)2。3.3 農(nóng)藥殘留檢測(cè)酶聯(lián)免疫測(cè)定已成為許多國(guó)際權(quán)威分析機(jī)構(gòu)如AOAC分析農(nóng)藥殘留的首選方法。迄今為止，應(yīng)用酶聯(lián)免疫測(cè)定檢測(cè)食品中的殘留農(nóng)藥主要為除草劑、殺蟲(chóng)劑和殺菌劑。例如草甘膦的ELISA檢出下限為0.07 g/mL，與色譜法測(cè)定的結(jié)果一致5,6。3.4 肉類(lèi)品質(zhì)檢測(cè)ELISA在肉類(lèi)食品品質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用主要包括加熱終溫判定分析和摻入異種肉的檢測(cè)兩個(gè)

12、方面。利用蛋白質(zhì)制備抗體，可以指示蛋白質(zhì)在加熱過(guò)程中變化，在商業(yè)上作為快速判定分析肉品終溫的一種ELISA方法。對(duì)摻入異種肉的檢測(cè)，則利用單克隆抗體的酶聯(lián)免疫測(cè)定法。目前在商業(yè)上，酶聯(lián)免疫測(cè)定已可以檢測(cè)十多種動(dòng)物肉2,6。3.5動(dòng)物違禁藥物殘留殘留檢測(cè)目前幾乎所有違禁藥物均已建立了ELISA檢測(cè)方法，如：-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、氯霉素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、磺胺類(lèi)、呋喃唑酮AOZ和氟喹諾酮類(lèi)等，尤其是鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺等違禁藥物7,8。例如瘦肉精（鹽酸克倫特羅）酶聯(lián)免疫檢測(cè)法，基于抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性抑制測(cè)定，不僅可作為一個(gè)定性篩選過(guò)程，也可以進(jìn)一步進(jìn)行定量測(cè)定。另外，寵物食品及含油

13、食品中氟喹諾酮類(lèi)藥物如諾氟沙星、環(huán)丙沙星等殘留也可以利用該方法檢出，且滿足歐盟及日本美國(guó)等地區(qū)和國(guó)家對(duì)該類(lèi)藥物篩選檢測(cè)的要求7。3.6 轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)ELISA法可以檢測(cè)某些特定的轉(zhuǎn)基因表達(dá)蛋白，以分析食品是否來(lái)自轉(zhuǎn)基因生物或含有轉(zhuǎn)基因成分。美國(guó)食品藥品管理局（FDA）已研究出用雙夾心ELISA 法檢測(cè)食品中是否含有轉(zhuǎn)基因玉米成分。Stratejic Dignostics公司已開(kāi)發(fā)利用ELISA原理的試劑盒用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆。EnvirologixELISA試劑盒可用于測(cè)定玉米中的Cry9C蛋白。Lipp等使用ELISA法，通過(guò)抗體特異性地與CP4-EPSPS(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合

14、酶，來(lái)源于農(nóng)桿菌CP4)蛋白結(jié)合，檢測(cè)RRS(rundupreadysoybean，抗革甘膦大豆) 2,5,6。3.7 病原體檢測(cè)目前在禽流感病毒檢測(cè)方面，我國(guó)已完成并建立了禽流感免疫酶診斷方法和技術(shù)，已形成試劑盒生產(chǎn)能力。另外，采用ELISA法還可以有效檢測(cè)牛及羊朊病毒蛋白，該蛋白可引起牛的病理性海綿狀病毒，是一種致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾病（瘋牛病，BSE），與人群發(fā)生變異型克雅氏?。╒CJD）有關(guān)。3.8 環(huán)境污染物的檢測(cè)ELISA亦可用于檢測(cè)環(huán)境污染物，如：重金屬、二噁英和甾體激素等的檢測(cè)。利用能與Hg、Cd、Pb、Zn Cu、Ag等重金屬離子結(jié)合的金屬硫蛋白，設(shè)計(jì)的ELISA檢測(cè)方法可以高效靈

15、敏地檢出食品中含有的以上幾種重金屬5,6。3.9 其他成分的檢測(cè)（1）食品中營(yíng)養(yǎng)素的測(cè)定 如: a 檢測(cè)嬰幼兒配方食品中谷蛋白含量9 b 檢測(cè)保健食品中透明質(zhì)酸的含量10 c 牛初乳中乳鐵蛋白含量6（2）抗?fàn)I養(yǎng)素因子的檢測(cè) 如：大豆及其制品中的胰蛋白酶抑制因子2（3）可用于檢測(cè)食品加工過(guò)程中的酶含量的變化5 如:磷酸丙糖異構(gòu)酶(TIM)和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG) (4) 有害食品包裝材料的檢測(cè) 如：雙酚A（BPA）114 ELISA技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)及不足與其他檢測(cè)方法相比：目前用于食品安全檢測(cè)的方法有很多，如薄層色譜(TLC)、微生物法、氣相色譜（GC）、質(zhì)譜（MS）、高效液相色譜（HPLC）和核酸探針

16、技術(shù)等。TLC必須進(jìn)行較為復(fù)雜的樣品預(yù)處理和抽提，且不能定量，靈敏度低。微生物法不易篩選到特別敏感的菌株，也只能定性不能定量，易受其他抗菌藥物的影響。GC及HPLC等雖靈敏度高，但設(shè)備昂貴，樣品預(yù)處理復(fù)雜，檢測(cè)費(fèi)用高，難以推廣使用，核酸探針則在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中易受到污染。然而，食品安全檢測(cè)的發(fā)展方向是快速、靈敏、簡(jiǎn)便。ELISA分析與其它方法相比，有以下優(yōu)勢(shì)：(1)高特異性；(2)高靈敏性，檢測(cè)范圍在ng和pg水平；(3)準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好；(4)一次性可處理大量樣品，適宜于用定性試驗(yàn)進(jìn)行篩選；(5)易于推廣到基層。ELISA分析也存在著一些缺陷，比如：(1)不能同時(shí)分析多種成分；(2)對(duì)試劑的選擇

17、性高；(3)對(duì)結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物有一定程度的交叉反應(yīng)。但如果與其它檢測(cè)手段聯(lián)合使用，如GC、HPLC，既可增加檢測(cè)的靈敏度又可降低交叉反應(yīng)，還可進(jìn)行更準(zhǔn)確的定量。隨著McAb技術(shù)的成熟，隨著新ELISA法的不斷出現(xiàn)，隨著免疫試劑盒的商業(yè)化，ELISA分析在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域中一定會(huì)得到進(jìn)一步的應(yīng)用和推廣。5 結(jié)語(yǔ)當(dāng)前我國(guó)在ELISA方面的研究還處于起步階段，許多成分的檢驗(yàn)都是模仿其他發(fā)達(dá)國(guó)家或者購(gòu)買(mǎi)其試劑盒，自主創(chuàng)新的很少。因此，為了我國(guó)的食品安全，身在食品領(lǐng)域的我們?nèi)沃囟肋h(yuǎn)。參考文獻(xiàn)1楊利國(guó),胡少昶.酶免疫測(cè)定技術(shù)M.南京,南京大學(xué)出版社, 1998.2李玉珍,林親錄.酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)及其在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展J.中國(guó)食品添加劑,2006,1:109113.3楊利國(guó),胡少昶.酶免疫測(cè)定技術(shù)M. 南京: 南京大學(xué)出版社, 1998.4蒲健,馮曉紅.ELISA酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法簡(jiǎn)介 J.肉類(lèi)研究, 2002, ( 2): 4143.5彩鴻翔,魯曉翠.酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展J. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué),2007, 11 (6): 6769.6何紫薇,郭琦.酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）技術(shù)在食品檢驗(yàn)的發(fā)