非細(xì)胞微生物的形態(tài)和結(jié)構(gòu)

1、非細(xì)胞微生物的形態(tài)與結(jié)構(gòu)第一節(jié) 病毒一、 概述（一）病毒病的表象認(rèn)知時(shí)代郁金香碎色病植物病毒病 ；天花（水痘）；狂犬?。ǘ┯小懊　钡倪^濾器和病毒的發(fā)現(xiàn)1886年德國人Mayer A發(fā)現(xiàn)具有傳染性的煙草花葉病，但是他指出是由細(xì)菌引起的。1892年俄國Ivanovski D發(fā)現(xiàn)煙草花葉病病原體能通過細(xì)菌濾器，還能引起煙草花葉病。認(rèn)為是由細(xì)菌產(chǎn)生的毒素造成的1898年荷蘭細(xì)菌學(xué)家Beijerinck M W對煙草花葉病病原體進(jìn)行研究引起煙草花葉病的致病因子特點(diǎn)：能通過細(xì)菌過濾器；僅能在感染的細(xì)胞內(nèi)繁殖；在體外非生命物質(zhì)中不能生長由此Beijerinck M W下結(jié)論認(rèn)為：致病因子不是細(xì)菌，而是比

2、細(xì)菌小的、具有傳染性的活的流質(zhì)病毒1900年前后德國細(xì)菌學(xué)家Loeffler和Frosh發(fā)現(xiàn)引起?？谔阋叩牟≡部梢酝ㄟ^細(xì)菌濾器，從而再次證明伊萬諾夫斯基和貝杰林克的重大發(fā)現(xiàn)。1915年英國人 Twort、1917年法國人 dHerelle分別發(fā)現(xiàn)細(xì)菌（Shigella dysenteriae）病毒-噬菌體（三）病毒的本質(zhì)1935年，美國生物化學(xué)家W M Stanley從患有花葉病的煙草的提純汁液中分析出一種蛋白晶體，將這種晶體再溶解后，保持了它的致病性，從而認(rèn)為病毒是一種蛋白質(zhì)。英國的Bawden和Pirie提出疑問，因?yàn)樗麄儼l(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒的提純液及晶體中還含有相當(dāng)量的硫和磷，磷是蛋白質(zhì)沒

3、有而核酸有的。Bawden等證明煙草花葉病毒的本質(zhì)為核蛋白電鏡的貢獻(xiàn)20世紀(jì)30年代后期電鏡的發(fā)展，可以直接觀察到病毒顆粒的形態(tài)。1940年Kausche首先用電鏡觀察到煙草花葉病毒顆粒。證明病毒顆粒的內(nèi)部是核酸，外面包裹著蛋白質(zhì)，有些病毒顆粒外邊被囊膜包裹著 病毒是由蛋白質(zhì)和核酸兩個(gè)部分組成。隨后的研究又證實(shí)核酸可分為RNA和DNA兩類。1936年后經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)證明核酸是病毒感染、致病及復(fù)制的主體。施拉姆（Schramm）等研究者也證明了T噬菌體侵入細(xì)菌內(nèi)部的是其核酸DNA，而留在細(xì)菌外壁的是其蛋白質(zhì)外殼。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，有些病毒除含有核酸和蛋白質(zhì)外，還含有一定量的脂類物質(zhì)及碳水化合物（四

4、）病毒的定義和特點(diǎn)定義：病毒是一類比較原始的、有生命特征的、能夠自我復(fù)制和嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的非細(xì)胞生物。特點(diǎn)（初步認(rèn)識）：形態(tài)及其微小，一般能通過細(xì)菌濾器，必須在電鏡下才能觀察； 有細(xì)胞構(gòu)造，主要成分僅為核酸和蛋白質(zhì)；一種病毒只含一種核酸，DNA或RNA；在離體條件下，能以無生命力的大分子狀態(tài)存在，并可長期保持其侵染活力。（亞病毒）：有的病毒甚至沒有蛋白質(zhì)，只含有具有單獨(dú)侵染性的較小型的核糖核酸（RNA）分子類病毒；有的病毒只含有不具備侵染性的RNA擬病毒；有的病毒沒有核酸而有感染性的蛋白質(zhì)顆粒朊病毒二、 病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組分病毒顆粒（病毒粒子）：指成熟的、結(jié)構(gòu)完整的、具有侵染性的單個(gè)病毒個(gè)

5、體。病毒的殼體有三種結(jié)構(gòu)類型 ：1螺旋對稱殼體 亞基有規(guī)律地沿著中心軸（核酸）呈螺旋排列，進(jìn)而形成高度有序、對稱的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。病毒顆粒為直桿狀、彎曲桿狀和線狀等很多植物病毒為堅(jiān)硬的桿狀；一些植物病毒和噬菌體為軟而能彎曲的纖維狀；昆蟲核型多角體病毒多為桿狀2二十面對稱殼體 蛋白質(zhì)亞基圍繞具立方對稱的正多面體的角或邊排列，進(jìn)而形成一個(gè)封閉的蛋白質(zhì)的鞘。病毒顆粒為球狀大部分動(dòng)物病毒和少數(shù)植物病毒呈球狀3復(fù)合對稱殼體 包裝有病毒核酸的頭部通常呈二十面體對稱，尾部呈 螺旋對稱。 病毒為蝌蚪狀、磚塊狀。（噬菌體為蝌蚪形。）某些動(dòng)物病毒呈復(fù)雜形狀，如豆病毒呈磚塊狀病毒的結(jié)構(gòu)：核殼（nucleocapsid）：

6、蛋白質(zhì)殼體 + 核酸（核心），又稱核衣殼。裸露病毒顆粒：僅由核衣殼構(gòu)成的病毒顆粒具包膜病毒顆粒：核衣殼外具一層脂蛋白膜，由宿主細(xì)胞膜衍生而來病毒以出芽方式成熟時(shí)獲得作用：保護(hù)病毒核殼；啟動(dòng)病毒感染；病毒的附屬物刺突某些昆蟲病毒核衣殼外面有很多蛋白質(zhì)晶體包被，形成多角形的包涵體，呈四面、長方、六面和十二面等，所以稱為多角體病毒。病毒的化學(xué)組成：核酸；毒粒 蛋白質(zhì)； 基本化學(xué)組成 病毒顆粒在化學(xué)上表現(xiàn)為核蛋白 脂類；碳水化合物病毒的核酸：核酸是病毒的遺傳物質(zhì)；一種病毒的毒粒只含有一種核酸：DNA或RNA （單鏈DNA（ss DNA）；雙鏈DNA（ds DNA）單鏈RNA（ss RNA）；雙鏈RNA

7、（ds RNA）； ） 非結(jié)構(gòu)蛋白 病毒基因組編碼的，在病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生并具有一定功能，但并不結(jié)合于毒粒中的蛋白質(zhì) 病毒蛋白質(zhì) 結(jié)構(gòu)蛋白 構(gòu)成一個(gè)形態(tài)成熟的有感染性的病毒顆粒所必需的蛋白質(zhì) 殼體蛋白； 保護(hù)作用包膜蛋白； 啟動(dòng)感染（決定感染的特異性） 存在于毒粒中的酶：參與病毒的入侵或復(fù)制 （如T4噬菌體的溶菌酶、一些病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶等） 病毒的脂類：許多病毒的包膜內(nèi)存在有脂類化合物（磷脂、脂肪酸、甘油三酸脂和膽固醇等）。這些脂類幾乎都是由病毒粒子在細(xì)胞內(nèi)成熟，在細(xì)胞膜處以葡生方式釋放，直接從寄主細(xì)胞膜上得到。病毒脂類存在與病毒的吸附和侵入有關(guān)病毒的碳水化合物：有的病毒還含有少量的碳水化合物有

8、包膜病毒中碳水化合物以寡糖側(cè)鏈的形式與蛋白質(zhì)結(jié)合形成包膜糖蛋白。 三、病毒的繁殖方式病毒的復(fù)制 病毒生長繁殖的特點(diǎn)：嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生物，只能在活細(xì)胞內(nèi)繁殖病毒的復(fù)制：病毒感染敏感宿主細(xì)胞后，病毒核酸進(jìn)入細(xì)胞，通過其復(fù)制與表達(dá)產(chǎn)生子代病毒基因組和新的蛋白質(zhì)，然后由這些新合成的病毒組分裝配（assembly）成子代毒粒，并以一定方式釋放到細(xì)胞外。病毒的這種特殊繁殖方式稱做復(fù)制.病毒復(fù)制過程：吸附：病毒吸附蛋白（VAP）一般由衣殼蛋白或包膜上的糖蛋白突起充當(dāng)。細(xì)胞表面受體（也稱為病毒受體）則為有效結(jié)合病毒粒子的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)。§ 大多數(shù)噬菌體的病毒受體為細(xì)菌細(xì)胞壁上的磷壁酸分子、脂多糖分子以及

9、糖蛋白復(fù)合物；有的則位于菌毛、鞭毛或莢膜上。§ 大部分動(dòng)物病毒的病毒受體為鑲嵌在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層中的糖蛋白，也有的是糖脂或唾液酸寡糖苷。§ 植物病毒迄今尚未發(fā)現(xiàn)有特異性細(xì)胞受體，其進(jìn)入植物細(xì)胞的機(jī)制是通過傷口或媒介傳播。病毒的細(xì)胞受體具有種系和組織特異性，決定了病毒的宿主譜。§ 不同種屬的病毒其細(xì)胞受體不同；§ 同種不同型的病毒、同型不同株的病毒細(xì)胞 受體不同；§ 有些不同種屬的病毒卻有相同的細(xì)胞受體，其吸附和感染可對其 它病毒的感染產(chǎn)生干擾。VAP與病毒受體的結(jié)合需要一定的溫度條件。在0-37內(nèi)溫度越高病毒吸附效率也越高。病毒吸附細(xì)胞的過程

10、可在幾分鐘到幾十分鐘的時(shí)間內(nèi)完成。侵入：病毒吸附后幾乎立即發(fā)生侵入侵入是依賴于能量的感染步驟不同的病毒-宿主系統(tǒng)病毒侵入機(jī)制不同病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的方式：病毒直接進(jìn)入；細(xì)胞內(nèi)吞（胞吞方式）；膜融合；注射式侵入；特殊的侵入方式動(dòng)物病毒侵入方式：裸露的病毒直接進(jìn)入方式；毒粒包膜與細(xì)胞質(zhì)膜的融合：膜融合是有包膜病毒侵入過程中，病毒包膜與細(xì)胞膜融合的一種侵入方式。 細(xì)胞的內(nèi)吞功能：細(xì)胞內(nèi)吞是動(dòng)物病毒的常見侵入方式。經(jīng)細(xì)胞膜內(nèi)陷形成吞噬泡，使病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。 有尾噬菌體侵入方式：通過尾部刺突固著于細(xì)胞；尾部的酶水解細(xì)胞壁的肽聚糖，是細(xì)胞壁產(chǎn)生小孔；尾鞘收縮，核酸通過中空的尾管壓入胞內(nèi)，蛋白質(zhì)外殼留在

11、胞外；植物病毒侵入方式： 通過天然的外壁孔侵入；通過植物細(xì)胞間的胞間連絲侵入細(xì)胞；通過因人為地機(jī)械損傷所形成的微傷口進(jìn)入細(xì)胞；靠攜帶有病毒的媒介，主要靠是有吮吸式口器的昆蟲取食將病毒帶入細(xì)胞。脫殼：脫殼是指病毒感染性核酸從衣殼內(nèi)釋放出來的過程。有包膜病毒脫殼包括脫包膜和脫衣殼兩個(gè)步驟；無包膜病毒只需脫衣殼脫殼方式：以內(nèi)吞方式或直接進(jìn)入細(xì)胞的病毒粒子，經(jīng)蛋白酶的降解，先后脫包膜和衣殼。以膜融合方式侵入的病毒，其包膜在與細(xì)胞膜融合時(shí)即已脫掉，核衣殼被移至脫殼部位并在酶的作用下進(jìn)一步脫殼，病毒核酸游離并進(jìn)至細(xì)胞的一定部位進(jìn)行生物合成。注射式侵入的噬菌體和某些直接侵入的病毒可以直接在細(xì)胞膜或細(xì)胞壁表面

12、同步完成侵入和脫殼病毒脫殼必須有酶脫殼酶的參與，脫殼酶來自宿主細(xì)胞，有的為病毒基因編碼。生物合成：病毒借助宿主細(xì)胞提供的原料、能量和場所合成核酸和蛋白質(zhì)，期間所需的多數(shù)酶也來自宿主細(xì)胞。在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后生物合成階段，胞漿中無病毒顆粒，稱為隱晦期（eclipse）病毒大分子的合成：病毒基因組進(jìn)入胞內(nèi)宿主細(xì)胞的代謝發(fā)生改變病毒利用宿主的生物合成機(jī)構(gòu)和場所，使病毒核酸表達(dá)和復(fù)制，產(chǎn)生大量的病毒蛋白質(zhì)和核酸。病毒基因組的表達(dá)與復(fù)制存在著強(qiáng)烈的時(shí)序性 病毒生物合成的第一步是病毒mRNA的合成病毒復(fù)制所需要的病毒特異性酶蛋白及蛋白質(zhì)外殼的合成（5種核酸，6條途徑） 裝配（成熟、形態(tài)發(fā)生）：新合成的毒粒

13、結(jié)構(gòu)組分組裝成完整的病毒顆粒，稱做病毒的裝配，亦稱成熟（maturation）或形態(tài)發(fā)生（morphogenesis）。絕大多數(shù)DNA病毒在細(xì)胞核內(nèi)組裝；RNA病毒與痘病毒類則在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)組裝。無包膜病毒組裝成核衣殼即為成熟的病毒粒子病毒的早期蛋白，即非病毒結(jié)構(gòu)成分不組裝入病毒，殘留在感染細(xì)胞中。T4噬菌體的裝配：T4噬菌體的裝配是一個(gè)極為復(fù)雜的自我裝配的過程 P185毒粒的釋放：裸露的病毒毒粒和有包膜的病毒毒粒釋放的機(jī)制有所不同:裸露病毒經(jīng)常裂解宿主細(xì)胞而被釋放有包膜病毒的包膜形成和釋放通常同時(shí)進(jìn)行，宿主細(xì)胞在一段時(shí)間可以持續(xù)釋放病毒有包膜的動(dòng)物病毒是在從宿主細(xì)胞核芽出或細(xì)胞質(zhì)膜芽出的過程中裹

14、上包膜而形成包膜病毒有包膜病毒的裝配與釋放有時(shí)也是同時(shí)完成的大多數(shù)噬菌體都是以裂解細(xì)胞方式釋放 絲桿噬菌體（如M13或fd）不殺死細(xì)胞，毒粒以分泌方式不斷從受染細(xì)胞中釋放，并同時(shí)完成毒粒的組裝。感染周期或復(fù)制周期：從單個(gè)病毒吸附開始至所有病毒釋放，此過程稱為感染周期或復(fù)制周期。三、 病毒的培養(yǎng)和純化1） 病毒的培養(yǎng)二元培養(yǎng)物法1、 動(dòng)物病毒培養(yǎng)方法：雞胚培養(yǎng)法動(dòng)物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)技術(shù)2、植物病毒培養(yǎng)方法植物組織培養(yǎng)方法：植物病毒敏感植物葉片產(chǎn)生壞死斑或者枯斑噬菌體的培養(yǎng)方法： 營養(yǎng)液細(xì)菌培養(yǎng)液變清亮 噬菌體細(xì)菌培養(yǎng)物 營養(yǎng)瓊脂平板細(xì)菌平板成為殘跡平板 若是噬菌體樣經(jīng)過適當(dāng)稀釋再接種細(xì)菌平板，經(jīng)

15、過一定時(shí)間培養(yǎng)，在細(xì)菌菌苔上可形成圓形局部透明區(qū)域，即噬菌斑（plague） 2） 病毒的培養(yǎng)特征群體特征空斑：是由動(dòng)物病毒在宿主單層細(xì)胞培養(yǎng)物上所形成的局部病損區(qū)域?？莅撸菏怯芍参锊《驹谥参锶~片上所形成的病斑。噬菌斑：是指病毒侵染細(xì)菌在細(xì)菌菌苔上所形成的負(fù)菌落（空斑）。包涵體：是病毒侵染動(dòng)植物細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)所形成的一種群體特征。也就是存在于動(dòng)植物細(xì)胞中的病毒3）病毒的純化 病毒是有感染性的生物體制備物應(yīng)保持其感染性純化標(biāo)準(zhǔn) 病毒具有化學(xué)大分子的屬性制備物的理化性質(zhì)應(yīng)具有均一性 主要化學(xué)組成為蛋白質(zhì)蛋白提純方法方法 （鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、凝膠層析、離子交換等） 具有一定的大小、形狀

16、和密度：差速離心；梯度離心（超速離心）常用的病毒純化方法：1、差速和密度梯度離心法（differential and density gradient centrifugation）2、病毒沉淀法（precipitation of virus）：過飽和硫酸銨3、雜質(zhì)變性法（denaturation of contaminants）：加熱或改變pH使雜質(zhì)變性；丙酮、氯仿等有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)等雜質(zhì)變性4、細(xì)胞組分的酶消化法（enzymatic digestion of cell constituents）：核酶、蛋白酶降解細(xì)胞中的核酸核蛋白質(zhì)。病毒對其具有較強(qiáng)抗性。五、病毒的分類第二節(jié) 噬菌體一、

17、概述1、噬菌體的發(fā)現(xiàn)1915年英國人Twort培養(yǎng)葡萄球菌時(shí)發(fā)現(xiàn)菌落出現(xiàn)透明斑。1917年法國人dHerelle觀察到痢疾桿菌的新鮮液體培養(yǎng)物能被加入的某種污水的無細(xì)菌濾液所溶解，培養(yǎng)物由混濁變澄清。溶菌因子噬菌體2、 噬菌體的概念是侵染細(xì)菌、放線菌、藍(lán)細(xì)菌等原核微生物的病毒。20世紀(jì)60 年代后發(fā)現(xiàn)一些真菌都有噬菌體的存在：酵母菌、青霉菌、曲霉菌、交鏈孢菌、鐮刀菌等3、 噬菌體的分布土壤、肥料、糞便、腐爛的有機(jī)物、污水（包括下水道污水）、發(fā)酵工廠排出的廢液、周圍空氣二、 噬菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成E. coli T4噬菌體結(jié)構(gòu) P172化學(xué)組成：蛋白質(zhì)，核酸（dsDNA,ssDNA,ssRN

18、A,dsRNA）三、 噬菌體的繁殖根據(jù)噬菌體與宿主細(xì)胞間的關(guān)系，將噬菌體分為：烈性噬菌體（或稱毒性噬菌體）；溫和噬菌體（一）烈性噬菌體噬菌體侵入細(xì)菌細(xì)胞后，在宿主細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)增殖，產(chǎn)生大量子噬菌體，并通過裂解細(xì)菌細(xì)胞而釋放出來的噬菌體，被稱為烈性噬菌體。 T4噬菌體是一個(gè)典型的烈性噬菌體。噬菌體繁殖的5個(gè)階段：吸附、侵入、增殖（復(fù)制與生物合成）、成熟（裝配）、裂解釋放吸附： 可逆吸附，無特異性（非細(xì)胞顆粒也可吸附）：隨機(jī)碰撞而接觸（靜電引力或氫鍵） 噬菌體粒子 特異性，不可逆吸附，啟動(dòng)噬菌體感染的第一階段：噬菌體表面蛋白與細(xì)菌受體的結(jié)合吸附是噬菌體與菌體表面受體發(fā)生特異性結(jié)合的過程，其特異性取決

19、于噬菌體蛋白與宿主菌表面受體分子結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性。宿主菌表面特異性受體：E. coli對T3、T4、T7的特異性受體是脂多糖層；E. coli對T2、T6的特異性受體是脂蛋白層；噬菌體的吸附器官：尾絲、頂角上的衣殼粒不同噬菌體吸附于宿主細(xì)胞的部位不同：E. coli T系噬菌體以其尾部的末端吸附于宿主細(xì)胞表面；E. coli M13噬菌體吸附于宿主細(xì)胞的性纖毛末端；還有噬菌體吸附于E. coli性纖毛的側(cè)面 影響噬菌體吸附的因素：噬菌體數(shù)量、陽離子濃度、溫度、輔助因子（Trp、Biotin）感染復(fù)數(shù)（度）：每一敏感細(xì)胞所能吸附的相應(yīng)噬菌體的數(shù)量有尾噬菌體的侵入：注射方式將噬菌體核酸注入細(xì)胞（同上）

20、無尾噬菌體的侵入：V 絲狀噬菌體M13：將核酸注入宿主細(xì)胞內(nèi)，而留下90蛋白質(zhì)在細(xì)胞外；V 絲狀噬菌體f1、fd：為ssDNA的雄性噬菌體，只能侵入雄性菌株，通過雄性菌株的性纖毛將其DNA轉(zhuǎn)入到菌體內(nèi)；V 人工分離的裸露的DNA也能進(jìn)入菌體內(nèi)；自外裂解：如果大量噬菌體在短時(shí)間內(nèi)吸附于同一細(xì)胞上，使細(xì)胞壁產(chǎn)生許多小孔，也可引起細(xì)胞立即裂解，但并未進(jìn)行噬菌體的增殖，這種現(xiàn)象稱為自外裂解。復(fù)制（增殖）：核酸復(fù)制、蛋白質(zhì)生物合成兩種不同的復(fù)制情況：噬菌體核酸侵入宿主細(xì)胞后，立即破壞細(xì)菌的核質(zhì)體，細(xì)菌的合成作用停止，而以噬菌體核酸為模板利用宿主RNA聚合酶、核糖體等合成噬菌體所需的酶類；噬菌體核酸侵入宿

21、主細(xì)胞后，還需要依賴宿主細(xì)胞提高的某些酶類，因此噬菌體并不破壞宿主細(xì)胞的核質(zhì)體，從而使宿主細(xì)胞能夠繼續(xù)合成某些蛋白質(zhì)裝配：T4噬菌體的裝配是一個(gè)極為復(fù)雜的自我裝配的過程 釋放：大多數(shù)噬菌體都是以裂解細(xì)胞方式釋放 T4噬菌體釋放過程涉及多個(gè)基因：一個(gè)基因指導(dǎo)合成內(nèi)溶菌素，它攻擊細(xì)胞壁肽聚糖。一個(gè)基因指導(dǎo)合成噬菌體蛋白穿孔素(holin)，它破壞質(zhì)膜，使呼吸停止，并允許內(nèi)溶菌素攻擊肽聚糖，推測它使膜形成孔洞毒性噬菌體的一步生長（復(fù)制周期、裂解性周期、增殖周期、溶菌性周期）：T4噬菌體的生命周期：一步生長曲線（onestep growth curve）P176定義：定量描述烈性噬菌體生長規(guī)律的實(shí)驗(yàn)曲

22、線。噬菌斑和噬菌體效價(jià)的測定：噬菌斑(plaque)：在固體培養(yǎng)基上，若用適量的噬菌體和宿主菌液混合后接種培養(yǎng)，培養(yǎng)基表面可有透亮的溶菌空斑出現(xiàn)。一個(gè)空斑系由一個(gè)噬菌體復(fù)制增殖并裂解細(xì)菌后形成，稱為噬菌斑。不同噬菌體噬斑的形態(tài)與大小不盡相同噬菌斑作用：菌株鑒定；噬菌體的檢出、分離和純化；進(jìn)行噬菌體的計(jì)數(shù)效價(jià)(噬菌斑形成單位數(shù),plaqueforming unit，pfu、感染中心數(shù))：表示每毫升試樣種所含有的具侵染性的噬菌體粒子數(shù)。效價(jià)測定方法：試管法；瓊脂平板法（單層瓊脂法，雙層瓊脂法）；玻片快速法；電鏡直接計(jì)數(shù)法噬菌體檢查和效價(jià)測定方法雙層瓊脂法：噬菌體檢查和效價(jià)測定方法單層瓊脂法：噬菌體

23、檢查和效價(jià)測定方法平板點(diǎn)滴法：效價(jià)計(jì)算公式：效價(jià)噬菌斑數(shù)目/（噬菌體稀釋液體積×噬菌體稀釋度）成斑率（efficiency of plating，EOP）：同一樣品根據(jù)噬菌斑計(jì)算出來的效價(jià)與用電鏡計(jì)算出來的效價(jià)之比。一步生長曲線測定方法：P1761、用噬菌體的稀釋液感染高濃度的宿主細(xì)胞；2、數(shù)分鐘后，加入抗噬菌體的抗血清（中和未吸附的噬菌體）；3、將上述混合物大量稀釋，終止抗血清的作用和防止新釋放的噬菌體感染其它細(xì)胞；4、保溫培養(yǎng)并定期檢測培養(yǎng)物形成噬菌斑數(shù)目（對噬菌體含量進(jìn)行計(jì)數(shù)）；5、以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，以噬菌斑數(shù)目為縱坐標(biāo)，繪制出噬菌體特征性的繁殖曲線一步生長曲線；潛伏期：噬菌

24、體吸附到細(xì)胞到釋放出新噬菌體的時(shí)間隱蔽期：噬菌體在受染細(xì)胞內(nèi)消失到細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)新的噬菌體時(shí)間在潛伏期的前一段，受染細(xì)胞內(nèi)檢測不到感染性噬菌體，后一階段，感染性噬菌體在受染細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量急劇增加。 隱蔽期噬菌體在細(xì)胞內(nèi)存在的動(dòng)力學(xué)曲線呈線性函數(shù)，而非指數(shù)關(guān)系，從而證明子代噬菌體顆粒是由新合成的噬菌體基因組與蛋白質(zhì)經(jīng)裝配成熟，而不是通過雙分裂方式產(chǎn)生的。 裂解量：每個(gè)受染細(xì)胞所產(chǎn)生的子代噬菌體顆粒的平均數(shù)目。其值等于潛伏期受染細(xì)胞的數(shù)目除以穩(wěn)定期受染細(xì)胞所釋放的全部子代噬菌體數(shù)目： 穩(wěn)定期噬菌體效價(jià)與潛伏期噬菌體效價(jià)之比。 噬菌體復(fù)制（繁殖）：（一步生長曲線） 1、吸附期； 游離的噬菌體吸附到宿主細(xì)胞

25、 2、潛伏期； 從噬菌體吸附到細(xì)胞到釋放出新噬菌體的最短時(shí)期 3、裂解期； 隨著菌體不斷破裂，新噬菌體數(shù)目增加，直到最高值 研究一步生長曲線意義了解噬菌體在菌體內(nèi)的最短潛伏期和平均收獲量（裂解量、爆破量）反映噬菌體的重要特征參數(shù)之一裂解量：是指每個(gè)被感染的細(xì)菌釋放新的噬菌體的平均數(shù)。裂解量=裂解期平均噬菌斑數(shù)/潛伏期平均噬菌斑數(shù)了解理化因素的變化對噬菌體感染循環(huán)時(shí)間的影響，以及每個(gè)被感染菌釋放噬菌體的影響。（二）溫和噬菌體感染宿主細(xì)胞后不能完成復(fù)制循環(huán)，噬菌體基因組長期存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，沒有成熟噬菌體產(chǎn)生。所以溫和噬菌體也稱溶源性噬菌體（lysogenic phage）這一現(xiàn)象稱做溶源性（ly

26、sogeny）現(xiàn)象溫和噬菌體的溶源性反應(yīng)（繁殖） ：在原噬菌體階段，噬菌體的復(fù)制被抑制，宿主細(xì)胞正常地生長繁殖，而噬菌體基因組與宿主細(xì)菌染色體同步復(fù)制，并隨細(xì)胞分裂而傳遞給子代細(xì)胞。細(xì)胞中含有以原噬菌體狀態(tài)存在的溫和噬菌體基因組的細(xì)菌稱做溶源性細(xì)菌 ；整合于細(xì)菌染色體或以質(zhì)粒形成存在的溫和噬菌體基因組稱做原噬菌體（prophage、前噬菌體） 溶源性細(xì)菌的基本特性：特性1：溶源性是溶源性細(xì)菌的一個(gè)及其穩(wěn)定的遺傳特性特性2：自發(fā)裂解：溶源性細(xì)菌的自發(fā)裂解特性3：誘發(fā)裂解：H2O2、UV、X射線、氮芥子氣、乙酰亞胺、絲裂霉素C等特性4：免疫性：被溫和噬菌體感染后形成的溶源性細(xì)菌具有“免疫性”，即其

27、它同類噬菌體雖然可以再次感染該細(xì)胞，但不能增殖，也不能導(dǎo)致溶源性細(xì)菌裂解。特性5：溶源性細(xì)菌的復(fù)愈：溶源性細(xì)菌有時(shí)消失了其中的原噬菌體，變成非溶源性細(xì)胞，這時(shí)既不發(fā)生自發(fā)裂解現(xiàn)象，也不發(fā)生誘發(fā)裂解現(xiàn)象。稱為溶源性細(xì)菌的復(fù)愈后非溶源化。特性6：溶源轉(zhuǎn)變：原噬菌體引起的溶源性細(xì)菌除免疫性外的其他的表形改變，包括溶源菌細(xì)胞表面性質(zhì)的改變和致病性轉(zhuǎn)變被稱為溶源轉(zhuǎn)變(lysogenic conversion)。例如：白喉?xiàng)U菌只有在含有特定類型的原噬菌體時(shí)才能產(chǎn)生白喉毒素，引起被感染機(jī)體發(fā)病。外界因素如紫外線可引起宿主的染色體的破壞，宿主產(chǎn)生應(yīng)急反應(yīng)合成具有DNA重組活性的RecA蛋白，導(dǎo)致cI的被降解，

28、噬菌體進(jìn)入裂解循環(huán)。 誘發(fā)裂解是檢查是否存在溶原性細(xì)菌的有效方法溶源性細(xì)菌的檢定方法：需要一種敏感的、非溶源性的菌株作為指示菌；對待測的溶源性菌株進(jìn)行誘發(fā)裂解；培養(yǎng)物過濾，濾液與指示菌混合，觀察是否形成噬菌斑；結(jié)果：有噬菌斑：為溶源菌；無噬菌斑：不是溶源菌溫和噬菌體的存在狀態(tài)：游離的、具有感染性的病毒粒子；原噬菌體；營養(yǎng)期噬菌體決定溫和噬菌體三種存在狀態(tài)的因素：細(xì)菌和噬菌體本身的遺傳特性、溫度、宿主生理狀況、菌種、每個(gè)細(xì)菌所接受的噬菌體的數(shù)目溶源性存在：大腸桿菌、假單胞菌、沙門氏菌、鏈球菌、芽孢桿菌、棒桿菌、弧菌、極毛桿菌溶源性菌株的命名：E. coli K12 （） 溫和噬菌體的種類：按照溫

29、和噬菌體與細(xì)菌DNA結(jié)合部位不同可分為兩類：只有一個(gè)結(jié)合部位：附著在宿主細(xì)胞膜的某一位點(diǎn)，或具有多個(gè)或不定的接合位點(diǎn)：四、 噬菌體與發(fā)酵工業(yè)噬菌體對發(fā)酵工業(yè)的危害：發(fā)酵周期延長、發(fā)酵液變清、發(fā)酵產(chǎn)物難以形成、嚴(yán)重時(shí)倒罐、停產(chǎn)等噬菌體的分離與檢查：分離方法： 雙層瓊脂平板方法；單層瓊脂平板方法；載玻片快速法噬菌體防治：避免噬菌體污染，應(yīng)樹立“預(yù)防為主”的觀念。1）決不使用可疑菌種；2）嚴(yán)格保持環(huán)境衛(wèi)生，決不隨意丟棄、排放生產(chǎn)菌種的菌液；3）注意通氣質(zhì)量，嚴(yán)格過濾；4）不斷篩選抗噬菌體菌種；5）經(jīng)常輪換生產(chǎn)菌種；6）嚴(yán)格會(huì)客制度。五、 噬菌體的其他利用測定輻射劑量，在分子生物學(xué)中的應(yīng)用第三節(jié) 亞病毒一、類病毒具有侵染性的RNA分子（一）類病毒的發(fā)現(xiàn)馬鈴薯紡錘形塊莖?。翰痪叩鞍踪|(zhì)衣殼，僅有RNA組成，馬鈴薯紡錘形塊莖病類病毒（二）類病毒定義只含RNA一種核酸的最小的，專性細(xì)胞內(nèi)寄生的分子生物（三）類病毒分布只在植物體中發(fā)現(xiàn)類病毒引起的植物病害番茄簇頂病、柑桔裂皮病、