第二章蛋白質(zhì)化學(xué)3-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系2

1、2022-2-20 生物化學(xué)生物化學(xué)Biochemistry第二章 蛋白質(zhì)protein第五節(jié)第五節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（The Relation of Structure and Function of Protein）（一）一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)（一）一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ) 一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 牛胰核糖核酸牛胰核糖核酸酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)二二硫硫鍵鍵 天然狀態(tài)，天然狀態(tài)，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 -巰基乙醇巰基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巰基乙醇巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無(wú)活性非折疊狀態(tài)，無(wú)活性v多肽鏈中氨基酸的

2、排列順序決定了多肽鏈中氨基酸的排列順序決定了肽鏈的折疊和卷曲方式肽鏈的折疊和卷曲方式v部分氨基酸殘基在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中部分氨基酸殘基在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中處于關(guān)鍵位置處于關(guān)鍵位置1、種屬差異、種屬差異同源蛋白同源蛋白（homologous protein) 在不同生物體中行使相同或相似功在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)。能的蛋白質(zhì)。同源蛋白質(zhì)的氨基酸順同源蛋白質(zhì)的氨基酸順序具有明顯的相似性即為序列同源。序具有明顯的相似性即為序列同源。 （二）一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（二）一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 如不同哺乳動(dòng)物的胰島素如不同哺乳動(dòng)物的胰島素分子結(jié)構(gòu)都由分子結(jié)構(gòu)都由A A和和B B兩條兩條鏈組成，且

3、二硫鍵的配對(duì)和空間構(gòu)象極其相似。鏈組成，且二硫鍵的配對(duì)和空間構(gòu)象極其相似。一級(jí)結(jié)構(gòu)也相似，僅有個(gè)別氨基酸有差異，因此一級(jí)結(jié)構(gòu)也相似，僅有個(gè)別氨基酸有差異，因此它們都執(zhí)行著相同的它們都執(zhí)行著相同的調(diào)節(jié)糖代謝調(diào)節(jié)糖代謝的生理功能。的生理功能。同源蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)中有許多位置的氨基酸對(duì)所同源蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)中有許多位置的氨基酸對(duì)所有種屬來(lái)說(shuō)都是相同的，稱(chēng)為有種屬來(lái)說(shuō)都是相同的，稱(chēng)為不變殘基不變殘基（invariant residue） 。其他位置的氨基酸差。其他位置的氨基酸差異較大，稱(chēng)為異較大，稱(chēng)為可變殘基可變殘基（variable residue） 。哺乳動(dòng)物胰島素氨基酸序列差異哺乳動(dòng)物胰島素氨基酸序

4、列差異胰島素胰島素人人豬豬狗狗兔兔牛牛羊羊馬馬 氨基酸殘基序列號(hào)氨基酸殘基序列號(hào)A5ThrThrThrThrAlaAlaThrA6Ser SerSerGlyGlySerSerA10 Ile Ile Ile IleValValIleB30ThrAlaAlaSerAlaAlaAla 是一種與血紅素輔基共價(jià)結(jié)合的單鏈蛋白，是一種與血紅素輔基共價(jià)結(jié)合的單鏈蛋白，存在于真核生物線(xiàn)粒體中。相對(duì)分子量約為存在于真核生物線(xiàn)粒體中。相對(duì)分子量約為13,00013,000，含有，含有104104個(gè)氨基酸殘基。近個(gè)氨基酸殘基。近100100個(gè)種屬個(gè)種屬的細(xì)胞色素的細(xì)胞色素c c氨基酸順序已被測(cè)定。氨基酸順序已被測(cè)定

5、。肽鏈中肽鏈中2828個(gè)位置的氨基酸個(gè)位置的氨基酸對(duì)所有已測(cè)試的種屬都相同的，對(duì)所有已測(cè)試的種屬都相同的，表明，這些殘基是規(guī)定細(xì)胞色素表明，這些殘基是規(guī)定細(xì)胞色素c c功能所必需功能所必需的。的。細(xì)胞色素細(xì)胞色素c（cytochrome c, Cyt.c）生物名稱(chēng)生物名稱(chēng)與人不同的氨與人不同的氨基酸參加數(shù)目基酸參加數(shù)目生物名稱(chēng)生物名稱(chēng)與人不同的氨與人不同的氨基酸參加數(shù)目基酸參加數(shù)目黑猩猩黑猩猩0響尾蛇響尾蛇14恒河猴恒河猴1海龜海龜15兔兔9金槍魚(yú)金槍魚(yú)21袋鼠袋鼠10角鮫角鮫23牛、豬、羊牛、豬、羊10小蠅小蠅25狗狗11蛾蛾31驢驢11小麥小麥35馬馬12粗糙鏈孢菌粗糙鏈孢菌43雞、火雞雞

6、、火雞13酵母菌酵母菌44不同生物與人細(xì)胞色素不同生物與人細(xì)胞色素c的氨基酸數(shù)目比較的氨基酸數(shù)目比較 狗狗人人猴猴 馬馬騾騾 鯨鯨 兔兔豬豬袋鼠袋鼠企鵝企鵝雞雞 鴨鴨響尾蛇響尾蛇龜龜蒼蠅蒼蠅 蛾蛾脈孢菌屬脈孢菌屬念珠菌屬念珠菌屬面包酵母菌面包酵母菌小麥小麥牛牛 蛙蛙金槍魚(yú)金槍魚(yú)動(dòng)動(dòng) 物物爬行動(dòng)物爬行動(dòng)物兩棲動(dòng)物兩棲動(dòng)物魚(yú)魚(yú)哺乳動(dòng)物哺乳動(dòng)物鳥(niǎo)鳥(niǎo)昆昆 蟲(chóng)蟲(chóng)植植 物物脊椎動(dòng)物脊椎動(dòng)物從細(xì)胞色素從細(xì)胞色素C的一級(jí)結(jié)構(gòu)看生物進(jìn)化的一級(jí)結(jié)構(gòu)看生物進(jìn)化生物進(jìn)化生物進(jìn)化2、一級(jí)結(jié)構(gòu)改變引起分子病、一級(jí)結(jié)構(gòu)改變引起分子病 例：鐮刀形紅細(xì)胞貧血例：鐮刀形紅細(xì)胞貧血N-val his leu thr pro glu

7、 glu C(146) HbS 肽鏈肽鏈HbA 肽肽 鏈鏈N-val his leu thr pro val glu C(146) 基因突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的突變，導(dǎo)致基因突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的突變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物功能的下降或喪失，這種由蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)生物功能的下降或喪失，這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，稱(chēng)為稱(chēng)為“分子病分子病（molecular disease）” 。 最早從分子水平最早從分子水平證明的先天性遺傳證明的先天性遺傳病病鐮刀形紅細(xì)鐮刀形紅細(xì)胞貧血癥胞貧血癥( (sickle-cell anemia) )。鐮刀形紅細(xì)胞鐮刀形紅細(xì)胞正常血細(xì)胞正常血細(xì)

8、胞hemoglobin 6: GAA(Glu) - GTA(Val) 血紅蛋白 -鏈上谷氨酸變成纈氨酸鐮刀狀貧血病 的分子機(jī)理3、蛋白質(zhì)前體的激活、蛋白質(zhì)前體的激活 一些蛋白質(zhì)或酶在細(xì)一些蛋白質(zhì)或酶在細(xì)胞中首先合成的是其前胞中首先合成的是其前體體,在成為有功能的蛋白在成為有功能的蛋白質(zhì)或酶之前需要激活質(zhì)或酶之前需要激活. 例如例如,胰島素胰島素(insulin ).的前體是胰島素原的前體是胰島素原(proinsulin),要在切除要在切除C肽之后才轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘碾闹蟛呸D(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘囊葝u素胰島素胰島素原的一級(jí)結(jié)構(gòu)胰島素原的一級(jí)結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)差異越小，功能相關(guān)性越大。一級(jí)結(jié)構(gòu)差異越小，功能相關(guān)性越大。

9、一級(jí)結(jié)構(gòu)上的細(xì)微變化可直接影響其功能一級(jí)結(jié)構(gòu)上的細(xì)微變化可直接影響其功能（一）血紅蛋白與肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)（一）血紅蛋白與肌紅蛋白的結(jié)構(gòu) 二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 1 1、血紅素、血紅素 肌紅蛋白肌紅蛋白(myoglobin,Mb)與與血紅蛋白都是含有血紅蛋白都是含有血紅素血紅素輔輔基的蛋白質(zhì)。血紅素是鐵卟基的蛋白質(zhì)。血紅素是鐵卟啉化合物，由啉化合物，由4個(gè)甲炔基相連個(gè)甲炔基相連成為一個(gè)環(huán)形，成為一個(gè)環(huán)形，F(xiàn)e2+居于環(huán)中。居于環(huán)中。鐵離子有鐵離子有6個(gè)配位鍵，其中個(gè)配位鍵，其中4個(gè)與吡咯環(huán)的個(gè)與吡咯環(huán)的N配位結(jié)合，配位結(jié)合，1個(gè)配位鍵和肌紅蛋白的個(gè)配位鍵和肌紅

10、蛋白的93位位組氨酸殘基結(jié)合，氧則與組氨酸殘基結(jié)合，氧則與Fe2+ 形成第形成第6個(gè)配位鍵，接近第個(gè)配位鍵，接近第64位（位（E7)組氨酸組氨酸。肌紅蛋白（肌紅蛋白（myoglobin, Mb） 肌紅蛋白是一個(gè)肌紅蛋白是一個(gè)只有三級(jí)只有三級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，有的蛋白質(zhì)，有8段段-螺螺旋結(jié)構(gòu)，旋結(jié)構(gòu)，分別成為分別成為A B C D E F G H肽段。整條多肽鏈折肽段。整條多肽鏈折疊成緊密球狀分子，氨基酸疊成緊密球狀分子，氨基酸殘基上的疏水側(cè)鏈大都在分殘基上的疏水側(cè)鏈大都在分子內(nèi)部，富極性及電荷的則子內(nèi)部，富極性及電荷的則在分子表面，因此水溶性較在分子表面，因此水溶性較好。好。Mb分子內(nèi)部有個(gè)袋

11、形分子內(nèi)部有個(gè)袋形空穴，血紅素居于其中?？昭?，血紅素居于其中。血紅蛋白（血紅蛋白（hemoglobin, Hb） 血紅蛋白具有四個(gè)亞基血紅蛋白具有四個(gè)亞基組成的四級(jí)結(jié)構(gòu)，每個(gè)亞基組成的四級(jí)結(jié)構(gòu)，每個(gè)亞基中間有一個(gè)疏水局部，可攜中間有一個(gè)疏水局部，可攜帶一個(gè)血紅素并攜帶一分子帶一個(gè)血紅素并攜帶一分子氧，氧，因此因此1分子分子Hb共結(jié)合四共結(jié)合四分子氧分子氧。Hb各亞基的三級(jí)結(jié)各亞基的三級(jí)結(jié)構(gòu)與構(gòu)與Mb極為相似。極為相似。Hb亞基亞基之間通過(guò)八對(duì)鹽鍵，使四個(gè)之間通過(guò)八對(duì)鹽鍵，使四個(gè)亞基緊密結(jié)合而形成親水的亞基緊密結(jié)合而形成親水的球狀蛋白。球狀蛋白。Hb與與Mb一樣能可逆地與一樣能可逆地與O2結(jié)合，

12、結(jié)合， Hb與與O2結(jié)合后稱(chēng)為氧合結(jié)合后稱(chēng)為氧合Hb。氧合。氧合Hb占總占總Hb的百分?jǐn)?shù)（稱(chēng)百分飽和度）隨的百分?jǐn)?shù)（稱(chēng)百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。濃度變化而改變。2、血紅蛋白的構(gòu)象變化與結(jié)合氧、血紅蛋白的構(gòu)象變化與結(jié)合氧 * 協(xié)同效應(yīng)協(xié)同效應(yīng)(cooperativity) 一個(gè)寡聚體蛋白質(zhì)的一個(gè)亞基與其配體結(jié)合一個(gè)寡聚體蛋白質(zhì)的一個(gè)亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一個(gè)亞基與配體結(jié)合能后，能影響此寡聚體中另一個(gè)亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象，稱(chēng)為力的現(xiàn)象，稱(chēng)為協(xié)同效應(yīng)協(xié)同效應(yīng)。 如果是促進(jìn)作用則稱(chēng)為如果是促進(jìn)作用則稱(chēng)為正協(xié)同效應(yīng)正協(xié)同效應(yīng) (positive cooperativity)如

13、果是抑制作用則稱(chēng)為如果是抑制作用則稱(chēng)為負(fù)協(xié)同效應(yīng)負(fù)協(xié)同效應(yīng) (negative cooperativity)抗體抗體生物體內(nèi)最奇妙的分子生物體內(nèi)最奇妙的分子 無(wú)限的多樣性（無(wú)限的多樣性（diversity) 功能與結(jié)構(gòu)的雙重性功能與結(jié)構(gòu)的雙重性 可變區(qū)可變區(qū)抗原結(jié)合抗原結(jié)合 恒定區(qū)恒定區(qū)生物學(xué)效應(yīng)功能生物學(xué)效應(yīng)功能（二）免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)與功能（二）免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)與功能（1）抗體的基本結(jié)構(gòu)）抗體的基本結(jié)構(gòu)Ig分子基本結(jié)分子基本結(jié)構(gòu)是由四個(gè)肽構(gòu)是由四個(gè)肽鏈組成的。鏈組成的。包括二條較小包括二條較小的輕鏈和二條的輕鏈和二條較大的重鏈。較大的重鏈。輕鏈與重鏈之輕鏈與重鏈之間是由二硫鍵間是由二硫鍵連接

14、形成連接形成Ig分分子單體。子單體。 （1）抗體的基本結(jié)構(gòu)）抗體的基本結(jié)構(gòu)（2）可變區(qū)和恒定區(qū)）可變區(qū)和恒定區(qū) 可變區(qū)可變區(qū)和抗原識(shí)別有關(guān)，決定抗體識(shí)別的特異性，和抗原識(shí)別有關(guān)，決定抗體識(shí)別的特異性，而而恒定區(qū)恒定區(qū)和效應(yīng)功能相關(guān)。和效應(yīng)功能相關(guān)。 此外在此外在Y形分子伸出的兩臂和主干之間還有個(gè)可形分子伸出的兩臂和主干之間還有個(gè)可彎曲的彎曲的鉸鏈區(qū)鉸鏈區(qū)(hinge R)，能改變兩個(gè)結(jié)合抗原的，能改變兩個(gè)結(jié)合抗原的Y形臂之間的距離。形臂之間的距離。 兩臂之間的角度可有自?xún)杀壑g的角度可有自0到到90的變化，這樣的變化，這樣有利于兩臂同時(shí)結(jié)合位于抗原上分布于不同位置有利于兩臂同時(shí)結(jié)合位于抗原上分

15、布于不同位置的表位。的表位。鉸鏈區(qū)Ig的鉸鏈區(qū)及其功能（三）蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾?。ㄈ┑鞍踪|(zhì)構(gòu)象改變與疾病 蛋白質(zhì)構(gòu)象疾?。旱鞍踪|(zhì)構(gòu)象疾?。喝舻鞍踪|(zhì)的折疊若蛋白質(zhì)的折疊發(fā)生錯(cuò)誤，盡管其一級(jí)結(jié)構(gòu)不變，但蛋發(fā)生錯(cuò)誤，盡管其一級(jí)結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致疾病發(fā)生。嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致疾病發(fā)生。蛋白質(zhì)構(gòu)象改變導(dǎo)致疾病的機(jī)理：蛋白質(zhì)構(gòu)象改變導(dǎo)致疾病的機(jī)理：有些蛋有些蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解白質(zhì)錯(cuò)誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖

16、維沉淀的病理改變。為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類(lèi)疾病包括：這類(lèi)疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。瘋牛病中的蛋白質(zhì)構(gòu)象改變瘋牛病中的蛋白質(zhì)構(gòu)象改變瘋牛病是由朊病毒蛋白瘋牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一組人和動(dòng)物神經(jīng)退行性病變。引起的一組人和動(dòng)物神經(jīng)退行性病變。正常的正常的PrP富含富含-螺旋，稱(chēng)為螺旋，稱(chēng)為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全為為-折疊的折疊的PrPsc，從而致病。，從而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPs

17、c-折疊折疊正常正常瘋牛病瘋牛病第六節(jié)第六節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的性質(zhì) 相對(duì)分子質(zhì)量很大，一般介于相對(duì)分子質(zhì)量很大，一般介于10 000-1 000 000道爾頓道爾頓之間，也有更大的。之間，也有更大的。 測(cè)定分子量的方法很多：測(cè)定分子量的方法很多：滲透壓法、超離心法、滲透壓法、超離心法、凝膠過(guò)濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。凝膠過(guò)濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。（一）蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量（一）蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量（二）蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)及等電點(diǎn)（二）蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)及等電點(diǎn)蛋白質(zhì)分子除蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基兩端的氨基和羧基可解離外，可解離

18、外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液，在一定的溶液pHpH條條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)( isoelectric point, pI) 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的荷為零，此時(shí)溶液的pH稱(chēng)為稱(chēng)為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。 各種蛋白質(zhì)有特定的等電點(diǎn)，和它所含的氨基各種蛋白質(zhì)有特定的等電點(diǎn)，和它所含的氨基酸種類(lèi)和數(shù)量有關(guān)。酸種類(lèi)和數(shù)量

19、有關(guān)。 例：含有堿性氨基酸較多，則例：含有堿性氨基酸較多，則pI偏堿（偏大）偏堿（偏大） 含有酸性氨基酸較多，則含有酸性氨基酸較多，則pI偏酸（偏?。?；偏酸（偏?。?； 含有酸、堿氨基酸數(shù)目相近時(shí)，含有酸、堿氨基酸數(shù)目相近時(shí)，pI為中性偏為中性偏酸，約為酸，約為5.0左右。左右。 pHpI，蛋白質(zhì)帶負(fù)電蛋白質(zhì)帶負(fù)電，體內(nèi)蛋白質(zhì)的，體內(nèi)蛋白質(zhì)的pI大多大多為為5.0左右，故生理?xiàng)l件下一般以左右，故生理?xiàng)l件下一般以負(fù)離子負(fù)離子形式存在。形式存在。 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 酸性氨基酸數(shù)酸性氨基酸數(shù) 堿性氨基酸數(shù)堿性氨基酸數(shù) pIpI胃蛋白酶胃蛋白酶 37 6 1.037 6 1.0胰島素胰島素 4 4 5.35

20、4 4 5.35RNARNA酶酶 10 18 7.8 10 18 7.8細(xì)胞色素細(xì)胞色素c 12 25 9.8c 12 25 9.810.810.8等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)以?xún)尚噪x子存在，最不穩(wěn)定，等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)以?xún)尚噪x子存在，最不穩(wěn)定，溶解溶解度最小，易沉淀析出度最小，易沉淀析出（用于蛋白質(zhì)的分離提純）；蛋（用于蛋白質(zhì)的分離提純）；蛋白質(zhì)的粘度、滲透壓、膨脹性以及導(dǎo)電能力均最小。白質(zhì)的粘度、滲透壓、膨脹性以及導(dǎo)電能力均最小。（三）蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性（三）蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性 * 蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的變性(denaturation)在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定的

21、的空間構(gòu)象被破壞空間構(gòu)象被破壞（即有序的空間結(jié)構(gòu)變成（即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無(wú)序的空間結(jié)構(gòu)），從而導(dǎo)致其無(wú)序的空間結(jié)構(gòu)），從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失變和生物活性的喪失。造成變性的因素造成變性的因素物理因素：物理因素：加熱、紫外線(xiàn)、加熱、紫外線(xiàn)、X線(xiàn)、超聲波線(xiàn)、超聲波化學(xué)因素：化學(xué)因素：乙醇等有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)乙醇等有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng) 堿、重金屬離子及生物堿試劑等堿、重金屬離子及生物堿試劑等 。 變性的本質(zhì)變性的本質(zhì) 破壞非共價(jià)鍵和二硫鍵，破壞非共價(jià)鍵和二硫鍵，不改變蛋白不改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。 變性特征：變性特征： 生物活性喪失；生物活性喪失； 理化性質(zhì)改變：

22、理化性質(zhì)改變：溶解度降低、球狀蛋白質(zhì)的溶解度降低、球狀蛋白質(zhì)的不對(duì)稱(chēng)性增加、粘度增加、擴(kuò)散系數(shù)降低，某不對(duì)稱(chēng)性增加、粘度增加、擴(kuò)散系數(shù)降低，某些蛋白質(zhì)不能夠再形成結(jié)晶些蛋白質(zhì)不能夠再形成結(jié)晶, , 變性后分子結(jié)構(gòu)變性后分子結(jié)構(gòu)松散、易被水解，變性蛋白易被酶消化。松散、易被水解，變性蛋白易被酶消化。 組成和相對(duì)分子質(zhì)量不變組成和相對(duì)分子質(zhì)量不變?nèi)舻鞍踪|(zhì)變性程度較輕，去除變性若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱(chēng)為原有的構(gòu)象和功能，稱(chēng)為復(fù)性復(fù)性。蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性(renaturation) Anfinsen實(shí)驗(yàn)

23、實(shí)驗(yàn)-牛胰核糖核酸酶的變性和復(fù)性牛胰核糖核酸酶的變性和復(fù)性結(jié)論：結(jié)論：蛋白質(zhì)的變性是可逆的；一級(jí)結(jié)構(gòu)決定三蛋白質(zhì)的變性是可逆的；一級(jí)結(jié)構(gòu)決定三維結(jié)構(gòu)；形成三維結(jié)構(gòu)所需要的所有信息都包含維結(jié)構(gòu)；形成三維結(jié)構(gòu)所需要的所有信息都包含在一級(jí)結(jié)構(gòu)中。在一級(jí)結(jié)構(gòu)中。（四）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)（四）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬(wàn)至萬(wàn)至100萬(wàn)之巨，其分子的直徑可達(dá)萬(wàn)之巨，其分子的直徑可達(dá)1100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。，為膠粒范圍之內(nèi)。 * * 蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷顆粒表面電荷水化膜水化膜+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋

24、白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化膜水化膜+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸酸堿堿酸酸堿堿酸酸堿堿脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉溶液中蛋白質(zhì)的聚沉蛋白質(zhì)由于帶有蛋白質(zhì)由于帶有電荷和水膜電荷和水膜，因此在水溶液，因此在水溶液中能成為穩(wěn)定的膠體。如果在蛋白質(zhì)溶液中加入中能成為穩(wěn)定的膠體。如果在蛋白質(zhì)溶液中加入某種電解質(zhì)或調(diào)節(jié)溶液某種電解質(zhì)或調(diào)節(jié)溶液pHpH，破壞了蛋白質(zhì)的水化，破壞了蛋白質(zhì)的水化膜及中和了蛋白質(zhì)的電荷，則蛋白質(zhì)從溶液中析膜及中和了蛋白質(zhì)的電

25、荷，則蛋白質(zhì)從溶液中析出的作用，稱(chēng)為蛋白質(zhì)的沉淀作用。出的作用，稱(chēng)為蛋白質(zhì)的沉淀作用。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生沉變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。淀，但并不變性。 根據(jù)反應(yīng)的可逆性分為根據(jù)反應(yīng)的可逆性分為可逆沉淀可逆沉淀和和不可逆沉不可逆沉淀淀兩種。兩種。（五）蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)（五）蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)1、可逆的沉淀作用、可逆的沉淀作用 定義：定義：蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀后，用透析等方法除去沉蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀后，用透析等方法除去沉淀劑，可使蛋白質(zhì)重新溶于原來(lái)的溶液中。淀劑，可使蛋白質(zhì)重新溶于原來(lái)的溶液中。 在沉淀過(guò)程中，在沉淀過(guò)程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒(méi)有發(fā)生變化，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒(méi)有

26、發(fā)生變化，在在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱(chēng)為種沉淀又稱(chēng)為非變性沉淀非變性沉淀。 可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如如等等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等。等。反應(yīng)類(lèi)型：反應(yīng)類(lèi)型： （1）加高濃度鹽類(lèi)）加高濃度鹽類(lèi) : 如硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等如硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等 鹽析：鹽析：加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象 不同的蛋白質(zhì)鹽析時(shí)所需的鹽濃度不同，調(diào)節(jié)不同的蛋白質(zhì)鹽析時(shí)所需的鹽濃度不同，調(diào)節(jié)鹽濃度可將混合蛋白質(zhì)分段析出（分段

27、鹽析）。鹽濃度可將混合蛋白質(zhì)分段析出（分段鹽析）。例：例： 半飽和的半飽和的(NH4)2SO4可使球蛋白沉淀；可使球蛋白沉淀； 飽和的飽和的(NH4)2SO4可使清蛋白析出。可使清蛋白析出。 應(yīng)用：應(yīng)用：利用此性質(zhì)可分離和制備各種蛋白質(zhì)和利用此性質(zhì)可分離和制備各種蛋白質(zhì)和酶制品酶制品（2）加有機(jī)溶劑：）加有機(jī)溶劑：如酒精、丙酮等如酒精、丙酮等機(jī)理：機(jī)理：有機(jī)溶劑和水有較強(qiáng)的作用，破壞有機(jī)溶劑和水有較強(qiáng)的作用，破壞了蛋白質(zhì)分子周?chē)乃ぃ虼税l(fā)生沉淀反應(yīng)。了蛋白質(zhì)分子周?chē)乃?，因此發(fā)生沉淀反應(yīng)。（3）等電點(diǎn)沉淀）等電點(diǎn)沉淀 利用蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)，在等電點(diǎn)時(shí)溶解度利用蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)，在等電點(diǎn)時(shí)

28、溶解度最小的特點(diǎn)。最小的特點(diǎn)。 在在pI時(shí)，加入這些有機(jī)溶劑可加速蛋白質(zhì)的時(shí)，加入這些有機(jī)溶劑可加速蛋白質(zhì)的沉淀，可用于蛋白質(zhì)的分離純化。沉淀，可用于蛋白質(zhì)的分離純化。 定義：定義：蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀后，不能用透析等方法除蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀后，不能用透析等方法除去沉淀劑而使蛋白質(zhì)重新溶解的現(xiàn)象去沉淀劑而使蛋白質(zhì)重新溶解的現(xiàn)象 在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，的穩(wěn)定性，而且也而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀過(guò)程發(fā)生了由于沉淀過(guò)程發(fā)生

29、了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱(chēng)為變性沉淀。所以又稱(chēng)為變性沉淀。 如如加熱沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物加熱沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。都屬于不可逆沉淀。2、不可逆沉淀、不可逆沉淀（六）蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)（六）蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)1、雙縮脲反應(yīng)、雙縮脲反應(yīng)(biuret reaction)蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱(chēng)為酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱(chēng)為雙縮脲雙縮脲反應(yīng)反應(yīng)，雙縮脲反應(yīng)可用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)水解程度。，雙縮脲反應(yīng)可用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)水解程

30、度。2、米倫氏反應(yīng)（酚基）、米倫氏反應(yīng)（酚基） 米倫試劑為米倫試劑為硝酸汞、亞硝酸汞、硝酸和亞硝硝酸汞、亞硝酸汞、硝酸和亞硝酸的混合物酸的混合物，蛋白質(zhì)溶液加入此試劑后即產(chǎn)生，蛋白質(zhì)溶液加入此試劑后即產(chǎn)生白色白色沉淀沉淀，加熱后沉淀變?yōu)椋訜岷蟪恋碜優(yōu)榧t色紅色。酪氨酸含有酚基，故。酪氨酸含有酚基，故含酪氨酸的蛋白質(zhì)都有此反應(yīng)。含酪氨酸的蛋白質(zhì)都有此反應(yīng)。3、乙醛酸反應(yīng)（吲哚基）、乙醛酸反應(yīng)（吲哚基） 在蛋白質(zhì)溶液中加入在蛋白質(zhì)溶液中加入乙醛酸乙醛酸，并沿試管壁慢慢，并沿試管壁慢慢注入濃硫酸，在兩層之間就會(huì)出現(xiàn)注入濃硫酸，在兩層之間就會(huì)出現(xiàn)紫色環(huán)紫色環(huán)。色氨酸。色氨酸及含有色氨酸的蛋白質(zhì)有此反應(yīng)

31、。及含有色氨酸的蛋白質(zhì)有此反應(yīng)。4、坂口反應(yīng)、坂口反應(yīng) 精氨酸分子含有精氨酸分子含有胍基胍基，能與次氯酸鈉及，能與次氯酸鈉及- -萘萘酚在氫氧化鈉溶液中產(chǎn)生酚在氫氧化鈉溶液中產(chǎn)生紅色產(chǎn)物紅色產(chǎn)物。5 5、酚試劑（福林試劑）反應(yīng)、酚試劑（福林試劑）反應(yīng) 酪氨酸中的酚基能將福林試劑中的磷鉬酸及磷酪氨酸中的酚基能將福林試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸還原成藍(lán)色化合物。鎢酸還原成藍(lán)色化合物。 該反應(yīng)常用蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。該反應(yīng)常用蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。（五）蛋白質(zhì)的紫外吸收（五）蛋白質(zhì)的紫外吸收由于蛋白質(zhì)分子中含有由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸和色氨酸，因此在，因此在280nm波長(zhǎng)波長(zhǎng)

32、處有特征性吸收處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作此可作蛋白質(zhì)定量測(cè)定蛋白質(zhì)定量測(cè)定。 前處理及抽提：前處理及抽提：選材、破碎、勻漿、溶解、離心或選材、破碎、勻漿、溶解、離心或差速離心、（差速離心、（pH、溫度、酶的抑制劑等保證蛋白質(zhì)、溫度、酶的抑制劑等保證蛋白質(zhì)的穩(wěn)定）。的穩(wěn)定）。 粗制品獲得（粗分級(jí)分離）：粗制品獲得（粗分級(jí)分離）：鹽析、等電點(diǎn)沉淀、鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑分級(jí)分離，離心。有機(jī)溶劑分級(jí)分離，離心。 純化（細(xì)分級(jí)分離）：純化（細(xì)分級(jí)分離）：層折法。層折法。 鑒定和測(cè)定：鑒定和測(cè)定：純度和含量。純度和含量。二、蛋白

33、質(zhì)的分離和分析技術(shù)二、蛋白質(zhì)的分離和分析技術(shù)（一）蛋白質(zhì)分離純化的一般原則（一）蛋白質(zhì)分離純化的一般原則1 1、透析及超濾、透析及超濾* 透析透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開(kāi)的方法。開(kāi)的方法。只用于除鹽類(lèi)和小分子雜質(zhì)只用于除鹽類(lèi)和小分子雜質(zhì)（二）常見(jiàn)分離純化技術(shù)（二）常見(jiàn)分離純化技術(shù)透析透析(dialysis):磁力攪拌器磁力攪拌器透析前透析前透析后透析后透析袋透析袋通過(guò)透析，小分子通過(guò)透析袋，散布于透析液通過(guò)透析，小分子通過(guò)透析袋，散布于透析液中，大分子量的蛋白質(zhì)不能通過(guò)透析袋，留在透析中，大分子量的蛋白質(zhì)不能通過(guò)透析

34、袋，留在透析袋內(nèi)。從而，蛋白質(zhì)溶液中的小分子物質(zhì)通過(guò)透析袋內(nèi)。從而，蛋白質(zhì)溶液中的小分子物質(zhì)通過(guò)透析被分離除去。被分離除去。超過(guò)濾超過(guò)濾（ultrafiltration）加壓加壓蛋白質(zhì)溶液蛋白質(zhì)溶液半透膜半透膜支持膜的柵板支持膜的柵板超濾液超濾液原理原理: :是利用壓是利用壓力或離心力，強(qiáng)力或離心力，強(qiáng)行使水和其他小行使水和其他小分子溶質(zhì)通過(guò)半分子溶質(zhì)通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)透膜，而蛋白質(zhì)留在半透膜上，留在半透膜上，以達(dá)到濃縮和脫以達(dá)到濃縮和脫鹽的目的鹽的目的2 2、鹽析和鹽溶、鹽析和鹽溶*鹽析鹽析(salt precipitation)：將高濃度的中性鹽，：將高濃度的中性鹽，如硫酸銨、硫酸鈉或氯

35、化鈉等加入蛋白質(zhì)溶如硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面液，使蛋白質(zhì)表面電荷電荷被中和以及被中和以及水化膜水化膜被被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。 鹽溶（鹽溶（salt solution）：）：低濃度的中性鹽可以使低濃度的中性鹽可以使蛋白質(zhì)溶解度增加。蛋白質(zhì)溶解度增加。 等電點(diǎn)沉淀法：等電點(diǎn)沉淀法：不同蛋白質(zhì)、氨基酸組成不同，不同蛋白質(zhì)、氨基酸組成不同，等電點(diǎn)不同，可利用等電點(diǎn)沉淀方法進(jìn)行分離。等電點(diǎn)不同，可利用等電點(diǎn)沉淀方法進(jìn)行分離。 等電點(diǎn)特點(diǎn)：等電點(diǎn)特點(diǎn)：蛋白溶解度最低蛋白溶解度最低3 3、等電點(diǎn)沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法4 4、低溫有機(jī)溶劑沉淀法、低溫有機(jī)溶劑沉

36、淀法*常用有機(jī)溶劑：常用有機(jī)溶劑：乙醇、丙酮乙醇、丙酮*丙酮沉淀：丙酮沉淀：使用使用丙酮沉淀丙酮沉淀時(shí)，必須在時(shí)，必須在04低溫低溫下進(jìn)行，丙酮用量一般下進(jìn)行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離，否則蛋白易蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離，否則蛋白易變性。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。變性。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 以上幾種方法只能分離得到蛋白質(zhì)的粗制品，以上幾種方法只能分離得到蛋白質(zhì)的粗制品，還無(wú)法得到具有一定純度的蛋白質(zhì)。還無(wú)法得到具有一定純度的蛋白質(zhì)。5 5、電泳、電泳根據(jù)電荷不同進(jìn)行純化的方法根據(jù)電荷不同進(jìn)行純化的方法蛋白質(zhì)在高于

37、或低于其蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的的溶液中為帶電的顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種通過(guò)顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種通過(guò)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù)術(shù), 稱(chēng)為稱(chēng)為電泳電泳(elctrophoresis) 。根據(jù)支撐物的不同，可分為根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠薄膜電泳、凝膠電泳電泳等。等。 原點(diǎn)原點(diǎn)帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)的泳動(dòng)方向帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)的泳動(dòng)方向?yàn)V紙、醋酸纖維素濾紙、醋酸纖維素薄膜或其他支持物薄膜或其他支持物陽(yáng)陽(yáng)極極陰極陰極電極緩沖液電極緩沖液電極緩沖液電極緩沖液電泳示意圖電泳示意圖薄膜電泳薄膜電泳幾

38、種重要的蛋白質(zhì)電泳幾種重要的蛋白質(zhì)電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分常用于蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定。子量的測(cè)定。*等電聚焦電泳，等電聚焦電泳，通過(guò)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分通過(guò)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。離蛋白質(zhì)的電泳方法。*雙向凝膠電泳，雙向凝膠電泳，以上兩種方法相結(jié)合，是蛋白以上兩種方法相結(jié)合，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。凝膠電泳凝膠電泳（四）層析（色譜）（四）層析（色譜）層析層析(chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理分離蛋白質(zhì)的原理當(dāng)流動(dòng)相帶著待分離蛋白質(zhì)溶液經(jīng)過(guò)一個(gè)固當(dāng)流動(dòng)相帶著待分離蛋白質(zhì)溶液經(jīng)過(guò)一個(gè)固態(tài)物質(zhì)（固定相）時(shí)，根據(jù)溶液中待分離的蛋白態(tài)物質(zhì)（固定相）時(shí)，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的 。蛋白質(zhì)分離常用的層析方法蛋白質(zhì)分離常用的層析方法* 離子交換層析：離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。不同進(jìn)行分離。 凝膠過(guò)濾凝膠過(guò)濾(gel filtration)又稱(chēng)分子篩層析、分子又稱(chēng)分子篩